木林潔程錦國(guó)△姜程曦（.溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州市中醫(yī)院，浙江 溫州325000）

腎病一號(hào)方總皂苷對(duì)腎纖維化大鼠的治療作用*

木林潔1，2程錦國(guó)1，2△姜程曦1
（1.溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州市中醫(yī)院，浙江 溫州325000）

目的 觀察腎病一號(hào)方及其總皂苷對(duì)腎纖維化大鼠的治療作用。方法 雄性SD大鼠30只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、UUO模型組、洛丁新組、腎病一號(hào)方組、總皂苷組。采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎制作UUO大鼠模型，造模14 d后收集24 h尿液，采用雙縮脲法測(cè)定24 h尿蛋白含量（24 h UP）。處死大鼠取血清檢測(cè)尿素氮（BUN）和血肌酐（Scr），取腎組織行HE染色評(píng)價(jià)腎小管間質(zhì)纖維化損傷程度，免疫組化方法觀察轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 （TGF-β1）的表達(dá)情況。結(jié)果 腎病一號(hào)方組和總皂苷組大鼠腎纖維化明顯改善，TGF-β1表達(dá)水平降低，與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 腎病一號(hào)方及其總皂苷能明顯改善腎纖維化，其作用機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，從而達(dá)到腎臟保護(hù)的作用。腎病一號(hào)方總皂苷可能是腎病一號(hào)方防治腎纖維化的藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

腎纖維化 單側(cè)輸尿管結(jié)扎 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

【Abstract】Objective：To observe the therapeutic effect of Nephropathy 1st decoction and saponin in renal fibrosis rats.Methods：30 male SD rats were randomly divided into the sham operation group，UUO model group，Lotensin group，Nephropathy 1st decoction group and saponin group.A rat model of renal fibrosis was induced by unilateral ureteral ligation.Rats were executed after 14 days.24 h urinary protein（24h UP），serum blood urea nitrogen（BUN）and serum creatitine（Scr）were tested.Renal tubular interstitial fibrosis was evaluated by Hematoxylin and eosin staining（HE）.The expression of transforming growth factor-beta 1（TGF-β1）was observed with immunohistochemical method.Results：The improvement of renal fibrosis in Nephropathy 1st decoction group and saponin group was obvious；the expression level of TGF-β1 decreased and compared with the model group，there were significant differences（P＜0.05）.Conclusion：Nephropathy 1st decoction and saponin may ameliorate renal interstitial fibrosis by down-regulating the expression levels of TGF-β1.Saponin may be one of the pharmacodynamic material bases of Nephropathy 1st decoction.

【Key words】Renal fibrosis；Unilateral ureteral obstruction；Transforming growth factor-beta 1

隨著我國(guó)人口老齡化以及糖尿病、高血壓患病人數(shù)的增加，慢性腎臟病的發(fā)病率正在逐年上升［1］，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了巨大壓力。慢性腎臟病在人類(lèi)死亡的主要原因中仍然居于第5位至9位之間。因此，慢性腎功能衰竭仍然是人類(lèi)生存的重要威脅之一［2］。研究表明腎纖維化是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期的共同通路［3］。中醫(yī)藥對(duì)防治腎纖維化具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，腎病一號(hào)方是溫州市中醫(yī)院腎病科長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)得出的抗腎纖維化的基本方，具有較好的臨床療效［4-5］。為了進(jìn)一步探討其藥用價(jià)值，對(duì)其有效部位進(jìn)行分離，總皂苷是其主要有效部位之一。已有研究表明中草藥皂苷類(lèi)有效成分具有一定的免疫調(diào)節(jié)和抗腎小球硬化的作用［6-7］。在此筆者將探討腎病一號(hào)方總皂苷對(duì)UUO大鼠模型腎纖維化及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠30只，普通級(jí)，體質(zhì)量（185±10）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供［許可證號(hào)SCXK（滬）2012-0002］。

1.2 藥物與試劑 腎病一號(hào)方由柴胡6 g，黃芩12 g，半夏12 g，白芍30 g，土茯苓30 g，半枝蓮30 g，菝葜30 g，漏蘆30 g等組成，由溫州市中醫(yī)院提供。洛丁新（編號(hào)12294563，鹽酸貝那普利片，北京諾華制藥）?？筎GF-β1抗體（abcam，產(chǎn)品編號(hào)ab92486）；一抗稀釋液（A1810，北京索萊寶生物科技公司）；濃縮型DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋公司）；免疫組化一步法聚合物檢測(cè)系統(tǒng)（PV6001，北京中杉金橋公司）；蘇木精-伊紅染色（HE）試劑盒（北京索萊寶生物科技公司）。超低溫冰箱，中國(guó)海爾 DW-86L626；光學(xué)顯微鏡，日本Olympus BX51；微量加樣槍?zhuān)聡?guó)Eppendorf公司；病理切片機(jī)，德國(guó)Leica RM2235；組織脫水機(jī)，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司，KD-TS3A；全自動(dòng)生化分析儀，美國(guó)Beckman Coulter AU5800。腎病一號(hào)方經(jīng)水提醇沉法得到初提藥液，然后采用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇等提取分離，得到含70%總皂苷成分的腎病一號(hào)方制劑［8］。

1.3 造模與分組 實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、洛丁新組、腎病一號(hào)方組和總皂苷組，各6只。本實(shí)驗(yàn)采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型［9］，10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉下行左側(cè)輸尿管結(jié)扎，從背部距左側(cè)脊肋角1.5 cm處做一斜向切口，逐層切開(kāi)后暴露左側(cè)腎臟，尋找左側(cè)輸尿管并游離，于約腎盂處和輸尿管上1/3處雙重結(jié)扎，回納腎臟并逐層縫合。假手術(shù)組開(kāi)腹后只游離左側(cè)輸尿管不進(jìn)行結(jié)扎［10］。30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、洛丁新組、腎病一號(hào)方組、總皂苷組各6只。

1.4 給藥方法 根據(jù)動(dòng)物與人體的每千克體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表計(jì)算給藥劑量［11］，洛丁新組按1.67 mg/ （kg·d）灌胃，腎病一號(hào)方組以相當(dāng)于生藥18.75 g/（kg·d）灌胃，皂苷組按160 mg/（kg·d）灌胃，假手術(shù)組、模型組予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃，造模后第2日開(kāi)始灌胃，每日1次，連續(xù)14 d。給藥14 d后處死大鼠，留取血、尿樣本和腎組織樣本。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）血尿生化指標(biāo)。給藥14 d后將大鼠放在干凈的代謝籠中收集24 h尿液，采用雙縮脲法測(cè)定24 h尿蛋白含量。采用10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，固定大鼠后心臟取血3～5 mL，離心后取血清保存于-20℃冰箱，通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐和血尿素氮 （溫州市中醫(yī)院檢驗(yàn)科提供）。2）腎臟病理學(xué)檢查方法。腎臟組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成3.0 μm薄片，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織病理學(xué)改變。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野連續(xù)不重復(fù)視野（×400），依據(jù)每個(gè)視野腎小管病變累及的小管數(shù)目評(píng)定腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)［12］。腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分：0分為腎小管結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)病變；l分為小管病變數(shù)目＜3個(gè)；2分為腎小管病變累及數(shù)目3～5個(gè)；3分為小管病變數(shù)目＞5個(gè)或腎小管結(jié)構(gòu)消失。3）免疫組織化學(xué)檢查方法。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，pH6.0檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)抗原，滴加抗TGF-β1抗體 （1∶200），4℃孵育18 h，根據(jù)免疫組化一步法聚合物檢測(cè)系統(tǒng)滴加二抗，室溫孵育30 min。DAB處理1 min，顯微鏡下控制著色時(shí)間，蘇木素復(fù)染2 min后脫水、透明、封片［13］。光學(xué)顯微鏡下觀察，400倍視野下，每張切片隨機(jī)選取6個(gè)非重疊視野，采用Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)量每個(gè)視野下平均積分光密度值 （IOD），以IOD值反映組織切片中陽(yáng)性物質(zhì)的表達(dá)程度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以（±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett T3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血、尿生化指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。與假手術(shù)組相比，模型組和各處理組大鼠血肌酐、血尿素氮明顯上升（P＜0.05）。與模型組對(duì)比，洛丁新組、腎病一號(hào)方組和總皂苷組大鼠血肌酐、血尿素氮明顯降低 （P＜0.05）。而24 h尿蛋白定量各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），

表1 各組大鼠血、尿生化指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠血、尿生化指標(biāo)比較（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別 n 24 h UP（mg/L）假手術(shù)組 6 415.00±201.78模型組 6 444.50±170.00洛丁新組 6 313.17±108.56 Scr（μmol/L）BUN（μmol/L）19.33±1.97 7.57±0.43 48.83±5.19*14.96±1.24*22.50±2.89*△9.97±0.30*△腎病一號(hào)方組 6 373.66±153.90 27.83±3.97*△12.04±0.75*△總皂苷組 6 27.67±3.61*△12.16±0.95*△372.33±95.35

2.2 各組腎臟組織病理改變 見(jiàn)圖1，表2。HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組未見(jiàn)明顯的病理改變，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常，腎間質(zhì)無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)大量變性和壞死，管腔擴(kuò)張，間質(zhì)增寬，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎間質(zhì)纖維化程度嚴(yán)重；洛丁新組、腎病一號(hào)方組和總皂苷組的腎小管損傷程度較模型組明顯減輕，但3組之間腎小管損傷程度對(duì)比不明顯。腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)比較：與假手術(shù)組比較，其他各組腎間質(zhì)損傷指數(shù)顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，洛丁新組、腎病一號(hào)方組和總皂苷組的腎間質(zhì)損傷程度下降（P＜0.05），但3個(gè)治療組之間差異不明顯（P＞0.05）。

2.3 各組TGF-β1的表達(dá)比較 見(jiàn)圖2，表3。免疫組化染色顯示，與假手術(shù)對(duì)比，假手術(shù)組腎臟幾乎不表達(dá)或者低表達(dá)TGF-β1；其他各組大鼠腎小管中TGF-β1均有不同程度的表達(dá)（P＜0.05）；與模型組對(duì)比，模型組陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)，腎間質(zhì)中可見(jiàn)大量棕黃色顯色，洛丁新組、腎病一號(hào)方組和總皂苷組的陽(yáng)性表達(dá)則相對(duì)減弱（P＜0.05）。洛丁新組、腎病一號(hào)方組和總皂苷組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠腎組織病理學(xué)改變（HE染色，400倍）

表2 各組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)比較（分，±s）

表2 各組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)比較（分，±s）

?

表3 各組大鼠腎間質(zhì)TGF-β1表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠腎間質(zhì)TGF-β1表達(dá)比較（±s）

組別 n假手術(shù)組 6模型組 6洛丁新組 6 IOD值1.63±0.18 22.55±5.89*11.37±1.85*△腎病一號(hào)方組 6 11.56±1.15*△總皂苷組 6 10.98±0.68*△

圖2 各組大鼠腎間質(zhì)中TGF-β1的表達(dá)（HE染色，400倍）

3 討 論

大量研究表明各種慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期的共同通路都是腎間質(zhì)纖維化［1］。目前認(rèn)為腎臟纖維化形成的分子機(jī)制主要分4個(gè)階段：第1階段是細(xì)胞的活化和受損。第2階段是促纖維化因子的釋放。第3階段是纖維化的形成。第4階段是腎臟結(jié)構(gòu)和功能受損［14］。在生理狀態(tài)下，TGF-β1在腎小管上皮細(xì)胞微表達(dá)。病理狀態(tài)下，活化的腎間質(zhì)細(xì)胞大量分泌TGF-β1促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。TGF-β1被認(rèn)為是促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的最重要作用因子［15］。因此TGF-β1的表達(dá)對(duì)于腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展及預(yù)后具有重要意義。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為各種腎臟疾病的根本病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜。本虛為脾腎兩虛，而標(biāo)實(shí)則以濕濁、濕熱、瘀血、毒邪、風(fēng)邪為主，各方面相互交織，最終導(dǎo)致腎纖維化。腎病一號(hào)方是溫州市中醫(yī)院腎病科在臨床長(zhǎng)期應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)方。本方根據(jù)病機(jī)特點(diǎn)，將小柴胡湯作為君藥，主入三焦，使三焦樞機(jī)調(diào)暢，加上土茯苓、半枝蓮清熱除濕解毒，菝葜解毒化瘀，從而調(diào)暢三焦氣機(jī)，祛除三焦?jié)嵝啊Ｕn題組前期研究已經(jīng)證實(shí)腎病一號(hào)方可能通過(guò)減少GMC（系膜細(xì)胞）和FN（纖維連接蛋白）的分泌，下調(diào)IL-6 mRNA表達(dá)，抑制大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮抗腎臟纖維化的作用［3］。然而，以上研究沒(méi)有揭示腎病一號(hào)方抗腎纖維化的藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，我們對(duì)其有效部位進(jìn)行分離，得到純化的腎病一號(hào)方總皂苷成分，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠腎臟TGF-β1的表達(dá)，進(jìn)一步探討腎病一號(hào)方及其總皂苷防治腎纖維化的可能機(jī)制和腎病一號(hào)方抗腎纖維化的藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。

該研究結(jié)果顯示，腎病一號(hào)方及其總皂苷能夠有效降低腎纖維化大鼠腎臟血肌酐和血尿素氮，同時(shí)能下調(diào)UUO大鼠腎間質(zhì)TGF-β1蛋白表達(dá)水平。綜上，第一，腎病一號(hào)方及其總皂苷具有延緩腎纖維化發(fā)生發(fā)展的作用，其作用機(jī)制可能是下調(diào)腎間質(zhì)TGF-β1蛋白表達(dá)水平，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)沉積，達(dá)到抗腎纖維化的作用。第二，腎病一號(hào)方總皂苷成分可能是其發(fā)揮抗纖維化作用的藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)之一。中醫(yī)藥在防治腎纖維化中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，然而其藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)十分復(fù)雜，無(wú)論是腎病一號(hào)方還是其他中藥復(fù)方，其發(fā)揮作用的藥效學(xué)機(jī)制都有待進(jìn)一步探索。

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The Therapeutic Effect of Nephropathy 1st Decoction and Saponin in Renal Fibrosis Rats

MU Linjie，CHENG Jinguo，JIANG Chengxi.Wenzhou Medical University，Zhejiang，Wenzhou 325000，China.

·研究報(bào)告·

R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

1004-745X（2016）08-1493-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.011

浙江省藥學(xué)重中之重一級(jí)學(xué)科開(kāi)放基金（YKFJ005）；2015年溫州市中醫(yī)藥建設(shè)資助項(xiàng)目

（電子郵箱：wsjcjg@126.com）

2016-04-10）