唐美霞 王 茜 耿俊隆 杜若桑 鄭淑美崔 海（首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069）

·研究報(bào)告·

腧穴針刺對急性期偏頭痛大鼠中腦組織SP及其受體NK-1的影響*

唐美霞 王 茜 耿俊隆 杜若桑 鄭淑美△崔 ?！?br/>（首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069）

目的 觀察腧穴針刺對偏頭痛大鼠中腦P物質(zhì)（SP）及其受體NK-1 mRNA表達(dá)的影響，為探討針刺治療急性偏頭痛機(jī)制提供依據(jù)。方法 40只健康Wistar雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組（A組）、模型對照組（B組）、腧穴電針組（C組）、偽電針組（D組）4組，每組10只。各組按設(shè)計(jì)方案進(jìn)行造模，和針刺預(yù)防治療后，斷頭取中腦，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，測定各組大鼠中腦P物質(zhì)及其受體NK-1 mRNA的表達(dá)量。結(jié)果 與A組比較，B、C、D組SP mRNA、NK-1 mRNA表達(dá)量明顯增高（P＜0.05）。與B組比較，C、D組SP mRNA、NK-1 mRNA表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。與D組比較，C組SP mRNA、NK-1 mRNA表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論 針刺能通過下調(diào)急性期偏頭痛大鼠中腦SP及NK-1基因表達(dá)水平，發(fā)揮預(yù)防治療偏頭痛的作用，且腧穴針刺療效更佳。

偏頭痛 針刺 P物質(zhì) NK-1

【Abstract】Objective：To observe the effect of electroacupuncture on the expression of substance P（SP）and its receptor Neurokinin-1 mRNA in the Mesencephalon in rats with migraine.Methods：40 adult male Wistar rats were equally randomized into 4 groups：the blank group（group A），the model （group B），acupoints electroacupuncture（group C），and non-acupoints electroacupuncture（group D），10 in each group.After modeling and electroacupunture treatment，all rats were decapitated，and Mesencephalon was removed and SP and receptor Neurokinin-1（NK-1）mRNA expression were detected by real-time quantitative PCR.Results：Compared with A group，the expression of SP mRNA and NK-1 mRNA rose obviously in the other three groups（P＜0.05）.Compared with B group，the expression of SP mRNA and NK-1 mRNA dropped obviously in group C and D （P＜0.05）.Compared with D group，the expression of SP mRNA and NK-1 mRNA of group C dropped obviously（P＜0.05）.Conclusion：Acupoints electroacupuncture can efficiently prevent and treat migraine headache by downregulating gene expression level of SP and NK-1 mRNA，and acupoints electroacupuncture has a better effect.

【Key words】Migraine；Acupuncture；Substance P；NK-1

偏頭痛多為一側(cè)或兩側(cè)顳部反復(fù)發(fā)作的搏動(dòng)性頭痛，發(fā)作前可伴視覺、體覺先兆，發(fā)作時(shí)常伴嘔吐［1］，其發(fā)病率一直居高不下，且有逐年增高的趨勢。目前，世界衛(wèi)生組織已經(jīng)將偏頭痛列為致殘疾病第19位［2］。近年大量針灸治療偏頭痛的臨床療效觀察表明針刺治療偏頭痛的治療效果顯著，且成本低、安全可靠［3-6］；但針灸治療偏頭痛作用機(jī)理尚未明確［7-8］。隨著深入研究，發(fā)現(xiàn)多種神經(jīng)肽與偏頭痛的發(fā)作有關(guān)［9-13］，其中包括SP、降鈣素相關(guān)肽（CGRP）、神經(jīng)肽Y、神經(jīng)肽M等等，越來越多地引起人們的關(guān)注，而SP與疼痛密切相關(guān)［9，12］。NK-1受體作為SP結(jié)合最為緊密的受體，與SP一起作為神經(jīng)遞質(zhì)在偏頭痛過程中的作用越來越受重視［14］。本研究以P物質(zhì)及其受體NK-1為研究點(diǎn)，通過對硝酸甘油偏頭痛大鼠模型［15］應(yīng)用實(shí)時(shí)定量 PCR （PCR）技術(shù)，定量檢測針刺對偏頭痛大鼠中腦SP及其受體NK-1mRNA表達(dá)的變化，在基因水平上探討針刺對偏頭痛的治療作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量（250±50）g，購于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。每4只一個(gè)籠子，清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)，自由攝食、飲水。飼養(yǎng)溫度（22±1）℃，濕度40%～70%，噪音＜60分貝，換氣次數(shù)10～20次/min，光照時(shí)間每天12 h（8∶00～20∶00），光照時(shí)間模擬晝夜交替；適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 主要試劑、儀器 硝酸甘油注射液由北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號(hào)20150702，1 mL：5 mg），0.9%氯化鈉注射液由江西中牧實(shí)業(yè)股份有限公司生產(chǎn) （批號(hào)1504047，20 mL），SYBR FAST qPCR Kit Master Mix （2×）Universal（美國KAPA Biosystems）。高速冷凍離心機(jī)，由Beckman公司生產(chǎn) （型號(hào)Beckman Allgre 21 R）；凝膠成像儀，由上海山富科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)（型號(hào)BioSens SC 810 B）；分光光度計(jì)，由ACTGene公司生產(chǎn)（型號(hào)NAS-99）；實(shí)時(shí)定量PCR儀，由linegene（bioer公司生產(chǎn)（型號(hào)TCP0096）；一次性無菌針，由中國蘇州醫(yī)療用品廠有限公司生產(chǎn) （批號(hào)2140080，0.25×13 mm）。電針用華佗牌電針儀，由中國蘇州醫(yī)療用品廠有限公司生產(chǎn)（型號(hào)G-6805-2）。

1.3 分組與造模 40只Wistar雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，空白對照組 （A組），模型對照組（B組），腧穴電針組（C組），偽電針組（D組），每組10只。參照文獻(xiàn)［16］中偏頭痛大鼠模型備制方法，采用背部皮下注射硝酸甘油10 mg/kg，復(fù)制其模型。觀察急性偏頭痛大鼠造模后30～60 min的行為學(xué)癥狀并記錄，以出現(xiàn)往返運(yùn)動(dòng)、撓頭、爬籠、咬尾次數(shù)增多，以及雙耳發(fā)紅癥狀為偏頭痛模型造模成功。

1.4 針刺穴位選擇 腧穴電針組根據(jù)針灸臨床治療偏頭痛經(jīng)驗(yàn)穴［17-19］，同時(shí)參照華興邦等制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》，取雙側(cè)太陽、風(fēng)池、單側(cè)太沖、足臨泣進(jìn)行針刺治療；偽電針組選擇非經(jīng)非穴點(diǎn)，本研究沿用楊旭光等［20］臨床研究選擇非穴位點(diǎn)，選擇4個(gè)非經(jīng)非穴位點(diǎn)進(jìn)行針刺治療，非穴位點(diǎn)1）臂內(nèi)前緣三角肌與肱二頭肌交界處；非穴位點(diǎn)2）肱骨內(nèi)上髁與尺骨腕部的中點(diǎn)，尺側(cè)緣；非穴位點(diǎn)3）足三里水平旁開非穴位點(diǎn)，脛骨外側(cè)緣處；非穴位點(diǎn)4）肘內(nèi)側(cè)，肘尖與腋窩連線中點(diǎn)。常規(guī)消毒，直刺0.25～0.30 mm，將G-6805-2型電針儀。疏波，頻率2～5次/s，強(qiáng)度0.1～0.2 mA，留針20 min，每日上午針灸1次。

1.5 干預(yù)方法 A組正常飼養(yǎng)7 d，不進(jìn)行任何處理，第8日皮下注射0.9%氯化鈉注射液2 mL/kg。B組正常飼養(yǎng)7 d，不進(jìn)行任何處理，第8天皮下注射硝酸甘油10 mg/kg造模。C組腧穴電針治療7 d，20 min/d，第8日皮下注射硝酸甘油10 mg/kg造模。D組非腧穴電針治療7 d，20 min/d，第8日皮下注射硝酸甘油10 mg/kg造模。造模成功后，A、B組不進(jìn)行任何處理；C組給予20 min腧穴電針1次；D組給予20 min非腧穴電針1次。

1.6 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測 治療結(jié)束后，在2～4 h內(nèi)，水合氯醛麻醉大鼠，斷頭取腦，快速剝離大腦，取中腦組織，50～100 g置于液氮中，立即保存于-70℃冰箱中備用。檢驗(yàn)中腦組織SP及NK-1 mRNA表達(dá)。1）樣本總RNA提取：取中腦組織25～30 mg，分別加入300 μL裂解液RL，按試劑說明書操作步驟進(jìn)行總RNA提取。使用紫外光分光光度計(jì)檢測樣本RNA的純度與濃度；樣本RNA在260 nm和280 nm處波長下的吸光度，讀取A260/A280比值，來檢測樣本RNA純度，要求其比值范圍在1.8～2.2之間；并計(jì)算RNA濃度為A260×40（ng/μL）。取8 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。2）cDNA：用HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系20 μL。放入eppendorf梯度PCR儀中，65℃5 min，37℃40 min，70℃10 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。得到的cDNA放置在-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?）SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR：檢索SP、NK-1特異性引物，使用ncbi-primer對引物進(jìn)行設(shè)計(jì)與調(diào)試，引物合成。目的基因引物序列（5′to 3′）如下：SPF為CTGGTCCGACAG TGACCAAA，SPR為TCTGCATTGCGCTTCTTTC，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為227 bp；NK-1 RF為GGCCTTTCCACAAGGC TACT，NK-1 RR為TGTACGCGTAGCCGATCAC，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為167 bp；Beta-actinF為CCCATCTATGAGG GTTACGC，Beta-actinR為TTTAATGTCACGCACGATT TC，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為150 bp。20 μL反應(yīng)體系，其中包括SYBR Master Mix（2×）Universal 10 μL，Primer F （10 μm）1.5 μL，Primer R（10 μm）1.5 μL，模板3 μL，ROX校正染料0.5 μL，ddH2O 3.5 μL補(bǔ)齊至20 μL。以上各樣本均做3個(gè)復(fù)孔。用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95℃10 min，（95℃10 s，59℃60 s）×45個(gè)循環(huán)。在擴(kuò)增條件中加入溶解曲線分析，分析模式為：95℃15 s，72℃15 s，95℃15 s。再采用2-△△ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以 （±s）表示，組間均數(shù)比較采用One-way ANOVA進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

各組大鼠中腦組織中SP mRNA、NK-1 mRNA表達(dá)比較 見表1。與A組比較，B、C、D組SP mRNA、NK-1 mRNA表達(dá)量明顯增高（P＜0.05）。與B組比較，C、D組SP mRNA、NK-1 mRNA表達(dá)量明顯降低 （P＜0.05）。與D組比較，C組SP mRNA、NK-1 mRNA表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。

3 討 論

針刺是中醫(yī)學(xué)經(jīng)過幾千年沉淀的經(jīng)驗(yàn)精華之一。

表1 各組大鼠中腦組織中SP mRNA表達(dá)比較（±s）

表1 各組大鼠中腦組織中SP mRNA表達(dá)比較（±s）

與A組比較，△P＜0.05；與B組比較，◆P＜0.05；與D組比較，﹟P＜0.05。

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近年許多研究者對其進(jìn)行研究，尤在鎮(zhèn)痛方面的研究頗多，且取得了一定的成就。本研究根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)選取了雙側(cè)太陽、風(fēng)池［21］，單側(cè)太沖、足臨泣；以少陽經(jīng)［22］為主，遠(yuǎn)近配穴［16］更有效的治療偏頭痛。電針選擇疏波，不斷地刺激腧穴可改善血流，舒張血管，緩解疼痛，減少發(fā)作頻率。已有研究證明電針影響痛覺傳遞，以及神經(jīng)肽的釋放，從而對偏頭痛有積極預(yù)防治療作用［23］。本研究中，通過行為學(xué)觀察，C組往返運(yùn)動(dòng)、撓頭、爬籠、咬尾癥狀較B、D組明顯緩解，且D組較B組的行為學(xué)癥狀明顯緩解；通過RT-PCR方法，檢測到C組大鼠中腦SP、NK-1 mRNA表達(dá)量均明顯降低，說明電針可以下調(diào)急性期偏頭痛大鼠中腦SP、NK-1的基因表達(dá)，達(dá)到預(yù)防治療作用；同時(shí)也證明C組相較D組療效更佳。

SP作為一級(jí)傷害性傳入纖維末梢釋放的神經(jīng)遞質(zhì)，對痛覺的傳遞也起著重要作用［24］。SP主要分布在腦內(nèi)，其中中腦含量最高，尤其中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)區(qū)（PAG）［25-26］。SP被作為是一種神經(jīng)遞質(zhì)與神經(jīng)調(diào)節(jié)，可通過多種受體 （主要是NK-1受體）參與第二信使偶聯(lián)。當(dāng)神經(jīng)受刺激后，SP與NK-1受體結(jié)合發(fā)揮生理作用，參與痛覺傳遞［27］。目前研究認(rèn)為SP既可以傳遞痛覺信息、參與信號(hào)傳導(dǎo)，又有產(chǎn)生疼痛的作用，與痛覺關(guān)系密切［28］。

本研究通過RT-PCR，對各組大鼠中腦SP、NK-1 mRNA進(jìn)行定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與A組比較，B、C、D 組SP mRNA、NK-1 mRNA表達(dá)量明顯增高。與B組比較，C、D組SP mRNA、NK-1 mRNA表達(dá)量明顯降低。與D組比較，C組SP mRNA、NK-1 mRNA表達(dá)量明顯降低。提示偏頭痛大鼠中腦SP、NK-1表達(dá)量增加；以上提示SP及NK-1與偏頭痛的發(fā)作密切相關(guān)。

本研究結(jié)果示，腧穴針刺治療急性期偏頭痛療效確切，并能緩解急性期癥狀。因此，筆者推斷急性偏頭痛的發(fā)生與SP及其受體NK-1的釋放量有關(guān)，SP通過受體NK-1傳導(dǎo)痛覺，產(chǎn)生致痛作用，促使急性期偏頭痛的發(fā)生。針刺可下調(diào)SP、NK-1基因表達(dá)水平，發(fā)揮防治偏頭痛的作用。

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Effects of Acupoint Electroacupuncture on Mesencephalon Substance P and Its Receptor Neurokinin-1 in Rats with Acute Migraine

TANG Meixia，WANG Qian，GENG Junlong，et al.Capital Medical University，Beijing 100069，China.

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R246 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

1004-745X（2016）08-1474-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.006

首都中醫(yī)藥研究專項(xiàng)（15ZY21）

（電子郵箱：13142104158@163.com）

2016-04-28）