殷　濤，劉明明

（赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古　赤峰　024000）

黃芪注射液對大鼠肝臟缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡的影響研究

殷濤，劉明明

（赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古赤峰024000）

目的：探討黃芪注射液對大鼠肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，進(jìn)一步討論其對細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制.方法：72只健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、缺血預(yù)處理組和黃芪注射液預(yù)處理組，每組按再灌注（1h，6h，24h）三個時間點分3個亞組.建立動物模型；測定組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況及肝組織凋亡指數(shù)（AI）；通過透射電鏡觀察大鼠肝細(xì)胞的形態(tài)變化.結(jié)果：與Sham組相比，IR、IP、A組肝組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)以及AI均增加（P＜0.05）；與IR組比，IP、A組肝組織Bax蛋白的表達(dá)及AI減少，而Bcl-2蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；與IP組比，A組肝組織Bax蛋白的表達(dá)及AI減少，而Bcl-2蛋白的表達(dá)增加（P＜0.05）.通過透射電鏡下對肝細(xì)胞學(xué)觀察，可見Sham組肝細(xì)胞形態(tài)基本正常，IR組損傷最重，IP 及A組肝細(xì)胞損傷程度較IR組輕，A組更輕.結(jié)論：IP及黃芪注射液都可通過抑制Bax蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，來減輕肝細(xì)胞凋亡，相比之下后者效果要更好.

缺血再灌注損傷；肝臟；黃芪注射液；凋亡

肝缺血再灌注損傷（Hepaticischemiareperfusioninjury，HIRI）常見于很多的手術(shù)過程中，如肝部分切除術(shù)、肝移植等，它直接影響到疾病的預(yù)后,在此過程中各種機(jī)制相互作用對肝細(xì)胞造成損害,進(jìn)而導(dǎo)致肝功能損害,進(jìn)一步造成肝臟衰竭.新近的研究表明，細(xì)胞凋亡可能在HIRI中起著十分重要的作用[1].細(xì)胞凋亡是由多個基因調(diào)控下的程序性細(xì)胞死亡,而Bax和Bcl-2基因是一組能對細(xì)胞凋亡能產(chǎn)生抑制和促進(jìn)作用的基因.

黃芪注射液能明顯改善大鼠腎臟,小腸等器官的缺血再灌注損傷,可能是通過預(yù)防生物膜的脂質(zhì)過氧化,減輕鈣超載，抑制凋亡等機(jī)理起到保護(hù)作用[2-3],但其能否通過抑制肝細(xì)胞凋亡來減輕肝臟缺血再灌注后的肝細(xì)胞損傷尚有待于進(jìn)一步研究.本實驗通過建立大鼠HIRI模型，在缺血前通過大鼠尾靜脈靜脈注射黃芪注射液，觀察大鼠肝缺血再灌注后肝組織中Bcl-2和Bax蛋白的變化及細(xì)胞凋亡率及通過對肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察來探討黃芪注射液對HIRI時細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)理.

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康雄性SD大鼠72只,由赤峰學(xué)院實驗動物中心提供，體重220g～240g.

1.1.2主要試劑黃芪注射液(2ml:100mg)為大理藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),產(chǎn)品批號:Z53021585.免疫組化試劑盒Bcl-2，Bax購自上海麥約爾生物科技有限公司.原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自德國羅氏公司.

1.2方法

1.2.1建立實驗動物模型各組大鼠在實驗室常規(guī)飼養(yǎng).按照規(guī)定要求術(shù)前禁食水.術(shù)前麻醉采用3%戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射方式.備皮，常規(guī)消毒皮膚.參照Pringle法[4]，建立HIRI模型，取腹正中切口，分離并顯露肝門部，剪開左中肝葉各韌帶，游離左、中肝葉的膽管及門靜脈、肝動脈分支，用無損傷血管夾夾閉供應(yīng)肝左外葉、肝中葉之門靜脈及肝動脈分支，制成70%肝缺血模型（阻斷后可見被阻斷區(qū)肝葉顏色由鮮紅色變?yōu)榘导t色表明肝臟缺血成功），40分鐘后移走動脈夾恢復(fù)肝臟供血血流.

1.2.2動物分組及處理72只大鼠隨機(jī)被分為S組、R組、IP組和A組，按再灌注1h、6h、24h三個時間點分為3個亞組.IR組：缺血前5min分別自大鼠尾靜脈緩慢注射0.9% NaCl2ml；Sham組：同IR組，但只是暴露肝中葉和左葉的肝蒂，不阻斷血流；IP組：在實驗前先阻斷肝門使其缺血5min，然后開放5min，重復(fù)3次；A組：按4g/kg用0.9%NaCl稀釋到2.0ml，再灌注前5min自尾靜脈注入.

1.2.3標(biāo)本取材及收集上述各組分別在再灌注1h、3h、24h對6只大鼠取左肝固定部位的組織，大小適中，迅速保存于-80℃冰箱中；每組上述3個時間點各取1只大鼠的左肝固定部分組織，一塊快速置于10%中性甲醛中固定；另一塊置于3%戊二醛中固定.

1.2.4實驗指標(biāo)檢測

1.2.4.1免疫組化染色及結(jié)果判定及凋亡檢測Bcl-2，Bax免疫組化試劑盒按SP法染色步驟進(jìn)行.Bcl-2，Bax的陽性表達(dá)的判定依據(jù)是細(xì)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色染色.

凋亡細(xì)胞檢測：按照試劑盒說明書嚴(yán)格進(jìn)行操作，應(yīng)用赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院病理科圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像處理分析，計算凋亡指數(shù)（AI）.

1.2.4.2電鏡檢查取出固定的肝組織塊，按照脫水，浸透，包埋，切超薄，染色，電鏡觀察，拍片等步驟進(jìn)行.

1.3統(tǒng)計分析

表1　IR后不同時間點Bcl-2蛋白表達(dá)情況（%）

（1）與S組相比，P＜0．05；（2）與IR組相比，P＜0．05；（3）與IP組相比，P＜0．05

表2　IR后不同時間點Bax蛋白表達(dá)情況（%）

（1）與S組相比，P＜0．05；（2）與IR組相比，P＜0．01；（3）與IP組相比，P＜0．05

表3　再灌注后不同時間點組肝細(xì)胞AI變化

（1）與S組相比，P＜0．01；（2）與IR組相比，P＜0．05；（3）與IP組相比，P＜0．05

四組缺血再灌注6h肝細(xì)胞凋亡圖片，見圖1-4.

2.2觀察透鏡下肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

缺血再灌注6h后，觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，見圖5～圖8.

利用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，p<0.05認(rèn)為有顯著性差異.

2　結(jié)果

2.1各組Bax，Bcl-2表達(dá)及AI變化

與Sham組相比，IR、IP、A組肝組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)、AI均增加（P<0.05）；與IR組比，IP與A組肝組織Bax蛋白表達(dá)及AI減少，而Bcl-2蛋白的表達(dá)增加（P<0.05）；與IP組比，A組肝組織Bax蛋白表達(dá)及AI減少，而Bcl-2蛋白表達(dá)增加（P<0.05）.（見表1-3）

圖1　S組HIRI6h凋亡肝細(xì)胞數(shù)（400）

圖2　IR組HIRI6h凋亡肝細(xì)胞數(shù)（400）

圖3　IR組HIRI6h凋亡肝細(xì)胞數(shù)（400）

Sham組肝細(xì)胞內(nèi)線粒體排列規(guī)則，細(xì)胞核核膜的雙重結(jié)構(gòu)清楚，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)正常，無擴(kuò)張，且排列規(guī)整；IR組線粒體明顯腫脹擴(kuò)張，嵴斷裂，部分細(xì)胞核核膜消失，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，其上的核蛋白體脫落；IP組部分線粒體輕微腫脹，無明顯擴(kuò)張或空泡變性，核膜結(jié)構(gòu)較清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無明顯擴(kuò)張，排列較規(guī)則；A組僅有少量線粒體略微腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)稍有擴(kuò)張，核膜結(jié)構(gòu)很清楚，且排列很規(guī)則.

圖4　A組HIRI6h凋亡肝細(xì)胞數(shù)（400）

圖5　Sham組肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（10000）

圖6　IR組肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（10000）

圖7　IR組肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（10000）

圖8　A組肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（10000）

3　討論

肝缺血再灌注損傷（HIRI）既是一個全身炎癥反應(yīng)的過程，也是一個細(xì)胞凋亡的過程[5].在缺血再灌注時由于鈣超載、氧自由基、炎癥因子等因素共同存在時，肝細(xì)胞的線粒體膜通透性發(fā)生變化，使得能量合成受到很大影響，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞凋亡.Bcl-2作為Bcl-2家族蛋白中重要的抗凋亡基因，在IR中起著至關(guān)重要的作用[6]，而Bax作為Bcl-2的同源體，其作用是抑制Bcl-2作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，兩者的表達(dá)水平的平衡決定了凋亡信號刺激后細(xì)胞的存活或凋亡[7].本實驗通過建立大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型，檢測肝組織中Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)及AI來反映肝細(xì)胞凋亡程度.

Bcl-2是一種原癌基因，其表達(dá)產(chǎn)物定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核膜上.Bcl-2作為重要的抑制凋亡基因，可通過其表達(dá)產(chǎn)物bcl-2蛋白調(diào)節(jié)線粒體膜上通透性轉(zhuǎn)換孔，從而調(diào)節(jié)線粒體膜通透性[8].此外，Bcl-2還可以利用抑制鈣離子釋放，來阻止促凋亡基因信號傳遞等發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用.Bax基因作為Bcl-2的同源基因，含有和Bcl-2基因一致的同源區(qū)域，其表達(dá)產(chǎn)物定位與Bcl-2相同，但其作用與Bcl-2蛋白結(jié)合形成結(jié)合體，兩者的比例關(guān)系則可以決定細(xì)胞的凋亡狀態(tài)[9].當(dāng)bax表達(dá)高于bcl-2時，形成bax-bax同源二聚體，使細(xì)胞凋亡增加；當(dāng)bcl-2表達(dá)高于bax時，bcl-2-bcl-2形成同源二聚體，凋亡受抑制；而當(dāng)bcl-2與bax表達(dá)水平相當(dāng)時，bcl-2與bax形成異源二聚體，則細(xì)胞凋亡終止.從本實驗的bax和bcl-2蛋白以及肝細(xì)胞凋亡率結(jié)果看，與IR組比較，IP、A組肝組織Bax蛋白表達(dá)及凋亡指數(shù)AI減少、Bcl-2蛋白表達(dá)增加（P<0.05）；與IP組比較，A組肝組織Bax蛋白表達(dá)及凋亡指數(shù)AI減少、Bcl-2蛋白表達(dá)增加（P<0.05）.研究表明，在肝缺血再灌注早期，IP通過誘導(dǎo)bcl-2蛋白表達(dá)增加，進(jìn)而改變bax及bcl-2蛋白的比例，形成更多的bcl-2-bcl-2同源二聚體，來抑制肝細(xì)胞凋亡.由此推斷，本研究中黃芪注射液很可能通過上述途徑來抑制肝細(xì)胞的凋亡，且效果要比IP組要好.另外，通過對缺血再灌注后肝細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)觀察，也證實在IR6h后肝細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)有很大程度的改變，而A及IP組較IR組損傷較輕，而A組更輕.這也從表明在IR早期，IP及黃芪都對肝細(xì)胞有很大的保護(hù)作用，這種微觀變化可能是通過抑制肝細(xì)胞凋亡所起的作用.黃芪所表現(xiàn)的效果顯得要更好.

筆者認(rèn)為，黃芪注射液及IP在肝臟缺血早期都可通過抑制肝細(xì)胞凋亡對肝細(xì)胞起到很好的保護(hù)作用.與IP組比較，其效果要更好.因為肝缺血再灌注損傷是多種因素共同作用的結(jié)果，加之誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的因素也很多，但具體機(jī)制可以作為我們的后續(xù)研究重點.

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R575

A

1673-260X（2016）08-0060-03

2016-06-14

劉明明（1984-），男，赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院普外二科住院醫(yī)師，學(xué)士學(xué)位