沙如意，Edwin Menledy Gbor JR，樓堅，蔡成崗，毛建衛(wèi)，劉士旺

（1浙江科技學院生物與化學工程學院/輕工學院，浙江 杭州 310023；2浙江省農產(chǎn)品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江 杭州 310023；3浙江省農業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310023）

粗纖維素酶液對微晶纖維素酶解的影響因素

沙如意1,2,3，Edwin Menledy Gbor JR1,2,3，樓堅1,2,3，蔡成崗1,2,3，毛建衛(wèi)1,2,3，劉士旺1,2,3

（1浙江科技學院生物與化學工程學院/輕工學院，浙江 杭州 310023；2浙江省農產(chǎn)品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江 杭州 310023；3浙江省農業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310023）

栗生灰黑孔菌多被用于產(chǎn)漆酶的研究，很少有利用其纖維素酶的報道。為了降低在纖維素水解中纖維素酶的使用成本，利用栗生灰黑孔菌發(fā)酵制備的粗纖維素酶液，以微晶纖維素為底物模型，研究粗纖維素酶液水解微晶纖維素的最佳pH、溫度和最佳表面活性劑助劑種類及濃度，并對不同表面活性劑存在條件下的纖維素酶解動力學、紫外和熒光光譜進行了研究。結果表明，粗纖維素酶水解微晶纖維素的最佳條件為pH 4.8，溫度50℃，最佳表面活性劑助劑為吐溫80，添加劑量為1.12mg/g底物；吐溫80的添加可提高粗纖維素酶解的最大反應速度常數(shù)Vmax，降低米氏常數(shù)Km；表面活性劑改變了纖維素酶的紫外和熒光最大吸收峰，酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶的譜峰，可能通過與纖維素酶中的氨基酸殘基發(fā)生反應影響了纖維素酶的結構，進而影響了微晶纖維素的水解反應。該研究為進一步降低纖維素水解成本提供了理論指導。

纖維素酶；微晶纖維素；表面活性劑；生物催化；生物質

隨著化石燃料的枯竭，人們對于生物質的開發(fā)日益重視。木質纖維素是地球上最廣泛的可再生的生物質能源之一，主要由纖維素、半纖維素和木質素組成［1］。纖維素必需經(jīng)過水解以后生成可發(fā)酵性的糖類物質才能夠被微生物利用，纖維素酶被廣泛用于纖維素的水解研究［2］。然而纖維素酶的高使用成本仍然是限制其工業(yè)化應用的主要因素［3］。因此，探索新的纖維素酶產(chǎn)生菌、提高纖維素酶的生產(chǎn)效率、降低纖維素酶的使用成本是工業(yè)化水平促進纖維素酶解木質纖維素的主要途徑之一［4-5］。目前研究最廣泛的纖維素酶生產(chǎn)菌是木霉屬和曲霉屬等真菌類［6-8］。栗生灰黑孔菌是一種褐腐菌，已有研究表明，栗生灰黑孔菌具有較強的產(chǎn)漆酶能力，能夠消化纖維素和半纖維素，在工業(yè)廢水處理、紙漿和造紙等工業(yè)應用潛力較大［9-11］。最近也有研究者利用栗生灰黑孔菌通過液體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，獲得的內切葡聚糖苷酶（CMCCase）活性為 21.71U/mL，β-葡聚糖苷酶為 10.69U/mL，但是幾乎無濾紙酶活性，這些研究為褐腐真菌降解木質纖維素提供理論基礎［12］。目前還未見利用栗生灰黑孔菌固體發(fā)酵法產(chǎn)纖維素酶并應用于纖維素水解的研究。為了提高纖維素酶的水解效率，吐溫、聚乙二醇、司班等系列表面活性劑常被添加于纖維素酶的水解體系，以提高葡萄糖的生成速率，降低纖維素酶的使用量和成本。本研究利用篩選到的一株栗生灰黑孔菌，通過固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)纖維素酶，研究了表面活性劑為添加助劑條件下，粗纖維素酶液降解微晶纖維素模型底物的最佳工藝條件，并從酶動力學、紫外光譜和熒光光譜的變化情況來揭示表面活性劑影響微晶纖維素酶解的機理，以期為粗纖維素酶液在生物質酶解上的應用提供理論依據(jù)。

1　實　驗

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 菌種來源

實驗室自行分離并保存。

1.1.2 主要試劑

微晶纖維素Avicel pH-101（阿拉丁）；葡萄糖、吐溫80、氫氧化鈉、硫酸、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、十二烷基硫酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、吐溫 80等，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

DNS試劑的配制：量取1416mL蒸餾水，10.6g 3,5-二硝基水楊酸，19.8g NaOH充分攪拌混勻。然后向其中分別加入 306g酒石酸鉀鈉，7.6mL苯酚（加熱至50℃），8.3g亞硫酸鈉，充分攪拌混勻。將溶液儲存于棕色瓶中，避光，4℃靜置7天后待用。

1.1.3 主要儀器

SPH-200B型恒溫搖床，SHIPING Temperature；Heraeus PICO 17型高速離心機，Themo Fisher Scientific；Allegra X-12R Centrifuge型高速冷凍離心機，BECKMAN COULTER；UV-5500PC型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；Satorius BS 124S型電子分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司；GZX-9076 MBE型電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；PHS-3C酸度計，杭州奧立龍儀器有限公司；振蕩器，WH-861；玻璃器皿等。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的分離和培養(yǎng)

從腐敗的香榧外殼分離得到絲狀真菌，發(fā)現(xiàn)具有降解纖維素的特性，于4℃保存在麥麩瓊脂斜面，培養(yǎng)基組成為：KCl 1.5g/L，NaNO33.5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5g/L，Na2HPO41.0g/L，瓊脂15.0g/L，麩皮 1.2g/L。經(jīng)送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，結合分子生物學鑒定該菌為栗生灰黑孔菌。

1.2.2 纖維素酶固態(tài)發(fā)酵和粗酶液制備及純化

將麥麩瓊脂斜面培養(yǎng)基上的栗生灰黑孔菌接種至麥麩液體培養(yǎng)基，28℃靜止培養(yǎng)4天，制備孢子懸浮液。接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基（調整孢子的濃度為1×107個/mL），組成為麥麩5.5g，鹽溶液（硫酸銨 10g/L，磷酸二氫鉀 1.5g/L），其中每克麥麩與1.2mL的鹽溶液相混合，pH 5.5，置于28℃培養(yǎng)箱靜止發(fā)酵120h。利用檸檬酸緩沖液（50mmol/L，pH 4.8）洗滌固體培養(yǎng)基，料液比為 1∶20（g/mL），提取時間為30min，提取溫度25℃。取發(fā)酵液于4℃下，8000r/min 離心10min，得到上清液經(jīng)真空濃縮為粗纖維素酶液［13］。

1.2.3 葡萄糖含量的測定

準確稱取置于 105℃烘箱烘干至恒重的葡萄糖100mg，用去離子水溶解后定容至 100mL，得到 1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。分別取標準溶液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL和1.2mL，加蒸餾水定容至2mL，再分別加入3mL DNS 試劑，混勻后沸水浴5min，立即冷卻至室溫，利用蒸餾水定容至25mL，漩渦混合后在波長540nm處測吸光值，以葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。利用DNS試劑顯色法測定還原性葡萄糖的含量，建立葡萄糖含量y和吸光度x之間的回歸方程為y=0.01509x+0.73081，其中，當葡萄糖濃度在0.1～0.8mg/mL的范圍內，R2=0.9976，具有良好的線性相關性。

1.2.4 濾紙酶活性（FPA）的測定

濾紙酶活性（FPA）根據(jù)Ghose的方法進行測定［14］，1mL適當稀釋的粗纖維素酶液與1mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.8）混合，加入一條新華濾紙（1×6cm），50℃保溫1h，加入3mL DNS試劑終止反應，沸水浴5min，冷卻至室溫，利用DNS試劑法在 540nm測吸光度，計算其中還原性葡萄糖的含量［15］。酶活利用國際酶活單位（IU）表示，IU/mL單位定義為：在50℃條件下，每1mL酶液在1min內釋放1μmol葡萄糖所需的酶量［16］。

1.2.5 內切葡聚糖苷酶活性（CMCCase）的測定

取 0.5mL適當稀釋的粗纖維素酶液與 1.5mL 10g/L CMC-Na溶液于干凈試管中，50℃水浴保溫30min后立即加3mLDNS顯色劑，沸水浴煮沸5min，取出立即冷卻，利用DNS試劑法在540nm測吸光度，計算其中還原性葡萄糖的含量。

1.2.6 溫度和pH對粗纖維素酶液水解的影響

稱取一定質量微晶纖維素與50mL不同pH的檸檬酸緩沖液（pH 4.0、pH4.4、pH 4.8、pH5.2和pH5.8），粗纖維素酶液的添加量為2.0 FPU/g底物，料液比為 1∶8（g/mL），置于不同溫度的（35℃、40℃、45℃、50℃、55℃）恒溫水浴搖床中，120r/min，分別于不同時間取樣，10000r/min離心5min，吸取上清液用 DNS法測定水解液中還原性葡萄糖的含量。

1.2.7 表面活性劑種類對粗纖維素酶液水解的影響

稱取一定質量微晶纖維素底物與50mL檸檬酸緩沖液（pH4.8），粗纖維素酶液的添加量為 2.0 FPU/g底物，料液比為 1∶8（g/mL），向其中添加10倍CMC（臨界膠束濃度）的吐溫80、司班20、司班80、十二烷基硫酸鈉（SDS）和十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）溶液，添加量分別為 0.12mg/g底物、40mg/g底物、20mg/g底物、198.4mg/g底物和 2.66mg/g底物置于 50℃恒溫水浴搖床中，120r/min，分別于不同時間取樣，10000r/min離心5min，吸取上清液用 DNS法測定水解液中還原性葡萄糖的含量。

1.2.8 不同濃度吐溫 80對粗纖維素酶液水解的影響

實驗條件如1.2.7節(jié)所示，向反應體系中添 加濃度梯度為 0.0112mg/g底物、0.056mg/g底物、0.112mg/g底物、1.12mg/g底物和11.2mg/g底物的吐溫80，考察不同濃度吐溫80助劑對微晶纖維素酶解效率的影響。

1.2.9 吐溫80對粗纖維素酶動力學的影響

利用米氏動力學方程（Michaelis-Menten），見式（1），模擬微晶纖維素的濃度分別為 65g/L、100g/L、125g/L和 200g/L條件下，添加吐溫 80（1.12mg/g底物）粗纖維素酶對微晶纖維素酶解的動力學影響。

式中，V為葡萄糖的生成速率，g/L·h；Vmax為最大反應速率，g/L·h；［S］為底物濃度，g/L；Km為米氏常數(shù)，g/L。利用Origin 8.5軟件擬合求取相應的酶解動力學參數(shù)。

1.2.10 不同表面活性劑對纖維素酶紫外光譜的影響

利用檸檬酸緩沖液（pH4.8）配制濃度為0.14g/L的吐溫80、24.8g/L的SDS和0.332g/L的CTAB溶液（即為10CMC各表面活性劑的濃度），加入到纖維素酶溶液中（終濃度為 2mg/mL）混合均勻，室溫放置 15min后，利用紫外可見光分光光度計在260～400nm掃描。以緩沖液作為對照，吐溫80、纖維素酶和緩沖液體系的紫外吸收光譜。同時掃描不同濃度吐溫80（0.14mg/L、0.7mg/L、1.4mg/L、7.0mg/L、14mg/L和140mg/L）對纖維素酶液紫外光譜的影響。

1.2.11 不同表面活性劑對纖維素酶熒光光譜的影響

利用檸檬酸緩沖液（pH 4.8）配制濃度為0.14g/L的吐溫80、24.8g/L的SDS和0.332g/L的CTAB溶液（即為10CMC各表面活性劑的濃度），加入到纖維素酶溶液中（終濃度為 2mg/mL）混合均勻，室溫放置15min后，分別以278nm和295nm波長激發(fā)，激發(fā)光柵及發(fā)射光柵寬度均為 5nm，以1200nm/min的速度掃描300～400nm處的熒光發(fā)射光譜。同時掃描不同濃度吐溫 80（0.14mg/L、0.7mg/L、1.4mg/L、7.0mg/L、14mg/L和140mg/L）對纖維素酶熒光發(fā)射光譜的影響。

2　結果與討論

2.1 固態(tài)發(fā)酵粗纖維素酶液的酶學特性

對篩選得到的菌進行鑒定為栗生灰黑孔菌，對利用固態(tài)發(fā)酵法得到的粗纖維素酶液活性進行測定，結果為FPA酶活19833U/mL，CMCCase酶活41333U/mL?？梢娫摼哂休^強的生產(chǎn) CMCCase酶的活性，而且可以高效地產(chǎn)生濾紙酶，這點有別于以往的研究報道［12］。栗生灰黑孔菌曾被研究利用液態(tài)法生產(chǎn)漆酶，其中酶活可達431U/mL［9］，但用其生產(chǎn)纖維素酶的報道尚且不多［8］。為了降低纖維素酶解中的纖維素酶使用成本，接下來的研究中采用粗纖維素酶液進行實驗。

2.2 溫度對纖維素酶液水解的影響

以微晶纖維素為模型底物，考察不同溫度對于粗纖維素酶液水解的影響，結果如圖1所示，可見較高溫度時纖維素酶具有較高的初始反應速率和最終的葡萄糖得率，在過高和過低溫度下，該粗酶催化生成的葡萄糖含量會顯著下降，各個溫度條件下，均會在72h左右進入葡萄糖生成量的穩(wěn)定期。該粗酶液最適的酶促反應溫度為50℃。這一點和其他研究者在利用里氏木霉、大腸桿菌和Trichoderma reesei ATCC 26921發(fā)酵獲得的纖維素酶等最適酶促溫度基本一致［17-19］。

圖1　溫度對粗纖維素酶液水解的影響

2.3 pH對纖維素酶液水解的影響

粗纖維素酶液在較高pH（pH5.8）和較低pH（pH4.0）的條件下，對于微晶纖維素呈現(xiàn)出相似的降解曲線，不同pH顯著影響著粗纖維素酶的初始酶解速率，且當pH為4.8時，具有最高的初始酶解反應速率和最高的葡萄糖生成量（圖2），72h葡萄糖產(chǎn)量可達 18.8g/L。最優(yōu)的酶解反應 pH為4.8，與大部分文獻報道的纖維素酶最佳作用pH相一致［20-21］。

圖2　pH對粗纖維素酶液水解的影響

2.4 表面活性劑種類對纖維素酶液水解的影響

限制木質纖維素水解成為葡萄糖的一個重要因素是過高的纖維素酶使用量，因而限制了纖維素乙醇和丁醇的工業(yè)化進程［22］。為此，許多研究者也開發(fā)出多種添加劑助劑，如吐溫系列［23］、聚乙二醇系列［24］、司班系列［25］、牛血清白蛋白［26］、木質素系列衍生物［27］等，用于提高纖維素酶的酶解效率，降低纖維素酶的使用量［28］。同樣地，本文探索了不同陰離子、陽離子和非離子型表面活性劑對粗纖維素酶液水解微晶纖維素的影響，結果如圖3所示，陰離子型表面活性劑 SDS顯著地抑制了微晶纖維素降解的初始反應速率，酶解72h后葡萄糖的產(chǎn)量僅為對照組（control）的 66.7%；陽離子表面活性劑CTAB對于酶解的效應與SDS相似，盡管最終獲得的葡萄糖產(chǎn)量高于SDS，然而仍低于對照組中還原性葡萄糖的產(chǎn)量。和對照組相比較，3種非離子表面活性劑吐溫80、司班20和司班80的添加對于微晶纖維素降解的初始反應速率無顯著性差異，然而隨著反應時間的延長，特別是催化反應 24h后，3種非離子表面活性劑可以明顯提高微晶纖維素酶解的效率。特別是吐溫80的添加，水解72h后，葡萄糖的得率增加了27.8%。與離子型表面活性劑CTAB 和SDS相比較，非離子型表面活性劑吐溫和PEG系列尤其能夠提高微晶纖維素的水解效率，這點與大部分的文獻報道相一致［29］，相反，陽離子和陰離子型的表面活性劑具有明顯的抑制效應［30］。本研究中非離子表面活性劑吐溫80、司班20和司班80提高微晶纖維素的水解效率可能是與這些添加劑能夠阻止纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附有關，增加了溶液中游離酶的含量，從而有利于吸附酶解［30-31］，但一般是認為在具有木質纖維素水解系統(tǒng)中，因添加劑阻止木質素和纖維素酶的疏水性相互作用才使得這些非離子型表面活性劑的添加更加有利于酶解。此外，水解條件、底物結構特征和纖維素酶的組成也都會影響表面活性劑對于纖維素酶解的作用，因此非離子表面活性劑也并不一定總是會促進纖維素酶的酶解［22］。

圖3　表面活性劑種類對粗纖維素酶液水解的影響

2.5 不同濃度吐溫80對纖維素酶液水解的影響

吐溫80表面活性劑在其濃度高于0.014g/L時會在水溶液中形成膠束，從而具有增溶、降低溶液表面/界面張力的作用。研究添加量為 0.0112mg/g底物和0.056mg/g底物的吐溫80對于微晶纖維素酶解的影響，所得結果如圖4所示，該濃度下對微晶纖維素的酶解幾乎無影響，這是因為吐溫80并未形成膠束，未能改變微晶纖維素的疏水或親水特征。繼續(xù)增加其濃度至 0.112mg/g底物，尤其是 1.12 mg/g底物，結果表明在此濃度下均可顯著增加微晶纖維素的初始酶解反應速率和酶解得率，然而當濃度增加到11.2mg/g底物，促進酶解的效果反而不顯著，這可能是高濃度下，吐溫80形成的膠束分子個數(shù)增多，已經(jīng)完全占據(jù)了微晶纖維素表面可能的位點。因此，在后續(xù)微晶纖維素酶解研究中，可選擇添加劑量為1.12mg/g底物的吐溫80。

2.6 吐溫80對纖維素酶動力學的影響

吐溫 80可能會通過降低纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附而提高微晶纖維素的水解效率，為了進一步研究吐溫80對纖維素酶的影響，對其作用條件下的纖維素酶動力學特性進行研究。利用Michaelis-Menten方程模擬纖維素酶在有無吐溫 80添加和不同濃度微晶纖維素條件下的酶動力學特性。結果表明未添加吐溫 80時，其Vmax為 0.492g/L/h，米氏常數(shù)為Km為31.46g/L（R2=0.96817），如圖5（a）；而在添加吐溫80時，Vmax增加到0.637g/L/h；Km則降低為12.01g/L（R2=0.95512），如圖 6（a）。隨著底物濃度的增加，不同時間內微晶纖維素水解生成葡萄糖的速率明顯增加［圖5（b），圖6（b）］，表現(xiàn)為底物濃度達到一定量時，此時酶與底物的所有結合位點會完全結合，因此，盡管底物濃度繼續(xù)增加，葡萄糖的生成速率只會趨于平衡值，這與任省濤等［32］的研究結果相一致。添加了吐溫80后葡萄糖的生成速率顯著增加。這說明吐溫80能夠增強纖維素酶的活力，表現(xiàn)為酶的最大反應速度顯著增加，能作用于游離的纖維素酶，提高其與微晶纖維素的親和力。

圖4　不同濃度吐溫80對粗纖維素酶液水解的影響

2.7 表面活性劑對纖維素酶紫外光譜的影響

為了揭示表面活性劑對粗纖維素酶解微晶纖維素影響機理，進一步研究了表面活性劑對纖維素酶紫外吸收光譜的影響。從圖7可以看出，該粗纖維素酶在280nm附近有較強的吸收峰，是由于纖維素酶中色氨酸基團對光吸收所致，與文獻報道相一致［33-34］。吐溫 80和 SDS的添加會導致纖維素酶的最大吸收峰強度增加，其中吐溫80最為明顯，CTAB則會導致纖維素酶最大吸收峰的降低。3種表面活性劑的添加使得纖維素酶的最大紫外吸收波長發(fā)生不同程度的藍移，SDS和CTAB變化不大，吐溫80有10nm的位移量。這說明3種表面活性劑是通過影響纖維素酶結構的變化進而影響其催化微晶纖維素水解的效率。

不同濃度吐溫80的添加均會顯著增加纖維素酶的最大吸收峰強度，如圖8所示，其中最大吸收峰強度基本隨著吐溫80濃度的增加而增加，不同濃度吐溫80（0.14～14mg/L）的添加使得纖維素酶的最大紫外吸收波長發(fā)生約5nm藍移，其中140mg/L影響最大，具有10nm的位移量。結果表明不同表面活性劑是通過改變纖維素酶中芳香族氨基酸殘基如色氨酸所處的微環(huán)境，進而改變了纖維素酶的分子結構。

圖5　未添加吐溫80纖維素酶的動力學特性及不同底物和時間下葡萄糖生成速率

圖6　添加吐溫80纖維素酶的動力學特性及不同底物和時間下葡萄糖生成速率

圖7　不同種類表面活性劑對纖維素酶紫外光譜的影響

圖8　不同濃度吐溫80對纖維素酶紫外光譜的影響

2.8 表面活性劑對纖維素酶熒光光譜的影響

纖維素酶因含有苯環(huán)結構或共軛性的雙鍵組成的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基，因此能夠吸收發(fā)射熒光而具有內源性熒光，其中苯丙氨酸殘基貢獻的熒光強度非常弱［35］。圖9（a）結果表明以278nm 和295nm波長光激發(fā)時，對照組、CTAB、SDS和吐溫80存在條件下，該纖維素酶的熒光發(fā)射波長分別為1842nm、2256nm、1802nm、2054nm；以295nm波長光激發(fā)時，對照組、CTAB、SDS和吐溫80存在條件下，該纖維素酶的熒光發(fā)射波長則分別為950nm、1176nm、907nm和1066nm［圖9（b）］。在不同的激發(fā)波長下，其中吐溫80最顯著地增加了纖維素酶的熒光發(fā)射峰強度，而SDS則其熒光強度影響不顯著，這可能有助于進一步解釋本研究中吐溫80非離子型表面活性劑是通過改變纖維素酶的結構而提高其催化微晶纖維素的效率。

圖9　不同表面活性劑對纖維素酶熒光發(fā)射光譜的影響

圖10　不同濃度吐溫80對纖維素酶熒光發(fā)射光譜的影響

在激發(fā)波長為278nm時，隨著吐溫80濃度的增加，纖維素酶的最大熒光發(fā)射峰強度呈現(xiàn)出增加的趨勢，其中14.0mg/L和140mg/L的吐溫80引起的最大紅移量分別為191nm和212nm［圖10（a）］。在激發(fā)波長為295nm時，隨著吐溫80濃度的增加，纖維素酶的最大熒光發(fā)射峰強度也在增加，但各個濃度下的變化并不明顯，其中14.0mg/L和140mg/L的吐溫 80引起的最大紅移量分別為 107nm和116nm ［圖10（b）］。添加的吐溫80可能與纖維素酶中的色氨酸和酪氨酸殘基發(fā)生相互作用，改變了這兩種氨基酸殘基所處的疏水性環(huán)境，從而影響了纖維素酶的構象。在利用不同的波長激發(fā)纖維素酶時，278nm條件下得到的最大熒光發(fā)射峰強度明顯強于295nm處的激發(fā)，這可能是因為較低波長下激發(fā)的是色氨酸和酪氨酸殘基，而較高波長下激發(fā)的僅為色氨酸殘基［36-37］。這些現(xiàn)象有助于進一步解釋本研究中觀察到的10CMC吐溫80最有助于微晶纖維素的酶解。

此外，為了進一步探索脫溫80對于纖維素酶結構可能的影響。向纖維素酶溶液中分別添加 0.014 g/L和0.07g/L的吐溫80，利用紅外光譜進行分析，一維譜圖結果表明，纖維素酶酰胺Ⅰ帶（1700～1600cm-1）的峰位向高波數(shù)移動，即從1625cm-1分別移向1632cm-1和1637cm-1，酰胺Ⅰ帶譜峰明顯變寬。而且酰胺Ⅲ帶（1330～1200cm-1）的一維紅外光譜顯示，分別添加了兩種劑量的吐溫80后，其出峰位置分別由1261cm-1移向1265cm-1和1269cm-1，且譜峰強度明顯增加。以上說明了表面活性劑吐溫80的添加可能改變了纖維素酶的結構，這與ECKARD等［38］研究吐溫20對纖維素酶的結構結果相一致。

3　結　論

利用栗生灰黑孔菌發(fā)酵制備的粗纖維素酶液，水解微晶纖維素的最佳條件為pH 4.8，溫度50℃，最佳表面活性劑助劑為吐溫80。當吐溫80添加劑量為1.12mg/g底物時，可顯著提高粗纖維素酶解的最大反應速度常數(shù)Vmax，降低米氏常數(shù)Km。表面活性劑的添加可改變纖維素酶的紫外、熒光最大吸收峰、酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶的譜峰，可能是通過改變纖維素酶的結構進而影響了微晶纖維素的水解反應。

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Influence factors of microcrystalline cellulose hydrolysis by crude cellulase solution

SHA Ruyi1,2,3，MENLEDY Gbor JR Edwin1,2,3，LOU Jian1,2,3，CAI Chenggang1,2,3，MAO Jianwei1,2,3，LIU Shiwang1,2,3
（1School of Biological and Chemical Engineering/School of Light Industry，Zhejiang University of Science and Technology，Hangzhou 310023，Zhejiang，China；2Zhejiang Provincial Key Lab for Chemical and Biological Processing Technology of Farm Products，Hangzhou 310023，Zhejiang，China；3Zhejiang Collaborative Innovation Center of Chemical and Biological Manufacturing for Agricultural Biological Resources，Hangzhou 310023，Zhejiang，China）

Melanoporia castanea was often used as laccase-producing strain，but little study was reported about the production of cellulase by this strain.In order to reduce the cost of cellulase in the hydrolysis of cellulose，the crude cellulase solution prepared by the fermentation of Melanoporia castanea.Then microcrystalline cellulose（MCC）was used as a model substrate，and the conditions of microcrystalline cellulose hydrolysis by crude cellulase solution was optimized，including pH，temperature，and type and concentration of surface active agents.Then crude cellulase solution hydrolysis kinetics，and ultraviolet and fluorescence spectrum were studied with the surfactant agents.The results showed that the optimum hydrolysis conditions of microcrystalline cellulose with crude cellulase solution were pH 4.8，temperature 50℃，and surfactant Tween-80 at dosage of 1.12mg/g substrate.It demonstrated that Tween-80 additioncould improve the maximum reaction velocity constants Vmaxof crude cellulase solution and reduce Michaelis constant（Km）.Both maximum absorbance peaks of ultraviolet and fluorescence were changed after addition of surfactants，with amideⅠand Ⅲ bands infrared spectrum changed，showing that the aromatic amino acid residues in cellulose were reacted with surfactants and then influenced the hydrolysis of microcrystalline cellulose.The study provides a theoretical guide for further reducing the cost of cellulose hydrolysis.

cellulase；microcrystalline cellulose；surfactants；biocatalysis；biomass

TS 201.2

A

1000-6613（2016）09-2766-09

10.16085/j.issn.1000-6613.2016.09.019

2016-04-27；修改稿日期：2016-05-12。

國家級星火計劃（2014GA690036、2015GA690057、2015GA700079）、浙江省重點研發(fā)計劃（2015C02031）、浙江省教育廳科研項目（Y201327551、Y201224264）及浙江科技學院科研啟動基金（F501103C01）項目。

沙如意（1982—），男，博士研究生。聯(lián)系人：毛建衛(wèi)，教授，研究領域為農業(yè)生物資源利用。E-mail zjhzmjw@163.com。