吉圣珺，　鄭勁平

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科，廣州　510120

?

低氧聯(lián)合TNF-α對人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的影響*

吉圣珺，鄭勁平△

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科，廣州510120

目的探討低氧聯(lián)合腫瘤壞死因子α(TNF-α)對人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HPMVECs)氧化應(yīng)激及凋亡的影響。方法低氧6、12、24 h及10、20、50、100 ng/mL TNF-α分別處理HPMVECs，使用MTT比色法檢測各組的細(xì)胞活性；選用最佳的低氧時(shí)間及TNF-α劑量作為聯(lián)合干預(yù)組，檢測各組上清液的丙二醛(MDA)含量、乳酸脫氫酶(LDH)及超氧化物歧化酶(SOD)活力及細(xì)胞凋亡率。結(jié)果低氧及TNF-α聯(lián)合干預(yù)組的MDA含量、LDH活力及細(xì)胞凋亡率明顯高于單獨(dú)作用組(均P<0.05)，而SOD活力低于單獨(dú)作用組(均P<0.05)；且低氧24 h+TNF-α 100 ng/mL聯(lián)合干預(yù)組的細(xì)胞凋亡率最高(P<0.05)。結(jié)論低氧聯(lián)合TNF-α作用于HPMVECs后，細(xì)胞的氧化應(yīng)激及凋亡率明顯增加。

人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞；氧化應(yīng)激；凋亡

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是常見的嚴(yán)重危害人類健康的呼吸系統(tǒng)疾病。肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension，PH)作為其主要并發(fā)癥之一，被認(rèn)為是影響COPD預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]，而其發(fā)生機(jī)制又與肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)[2]。低氧及炎癥因子的持續(xù)存在是慢性阻塞性肺疾病具有的重要特征，兩者均可通過介導(dǎo)和調(diào)控肺血管重構(gòu)，參與肺動(dòng)脈高壓的形成[3-4]。既往許多關(guān)于肺動(dòng)脈高壓模型的研究，無論是動(dòng)物還是體外細(xì)胞模型，大部分以低氧、野百合堿或者炎癥因子作為單一誘導(dǎo)因素[5-6]，然而，對于COPD患者的肺動(dòng)脈高壓而言，低氧與炎癥因素往往同時(shí)存在。當(dāng)兩者同時(shí)作用于人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HPMVECs)后，將產(chǎn)生何種效應(yīng)，目前尚未明確。本文擬通過低氧和腫瘤壞死因子α(TNF-α)對HPMVECs進(jìn)行單獨(dú)或聯(lián)合刺激，進(jìn)一步探討兩者作為聯(lián)合誘導(dǎo)因素在致HPMVECs損傷過程中的作用。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

電熱恒溫培養(yǎng)箱、低氧細(xì)胞培養(yǎng)箱購自上海博訊實(shí)業(yè)公司、臺(tái)式高速離心機(jī)購自中科中佳科學(xué)儀器有限公司；美國BD Accuri C6流式細(xì)胞儀、恒溫水浴鍋購自上海有典儀器設(shè)備公司；722型分光光度計(jì)、微量移液槍購自賽默飛世爾科技公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、胎牛血清、高糖培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、HPMVECs購自上海細(xì)胞庫，甲基噻唑基四唑鹽(MTT)、細(xì)胞培養(yǎng)液購自Gibco公司，Annexin Ⅴ-FITC試劑盒為凱基公司產(chǎn)品，四乙氧基丙烷、2，4-二硝基苯肼及冰乙酸購自上海榕柏生物技術(shù)有限公司。

1.2人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)

從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入37℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化，將細(xì)胞懸液移入15 mL離心管，加入5 mL培養(yǎng)液，離心(1 000 r/min，5 min)，用培養(yǎng)液混懸沉淀細(xì)胞，每2～3 d換液1次，待細(xì)胞生長至80%融合時(shí)用胰酶消化法，按1/2(體積比)分瓶傳代，用第4代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。HPMVECs在37°C、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組及構(gòu)建缺氧損傷模型

實(shí)驗(yàn)分為4組：①空白對照組；②低氧干預(yù)組，分別低氧6 h、12 h、24 h；③TNF-α干預(yù)組，分別加入TNF-α 10、20、50、100 ng/mL進(jìn)行干預(yù)；④低氧+TNF-α聯(lián)合干預(yù)組，具體濃度根據(jù)②③MTT結(jié)果設(shè)定。構(gòu)建缺氧損傷模型：按實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞并待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞放入特制容器中，容器外接2根管道，其中一根管道進(jìn)氣，另一根管道出氣，向進(jìn)氣口中持續(xù)通入含5%CO2、0～5%(體積分?jǐn)?shù))O2的混合氣體，并將出氣口通入水中防止外界O2進(jìn)入容器中，容器其他部位均密封。將容器放入水浴鍋中，調(diào)節(jié)水浴鍋溫度，實(shí)時(shí)監(jiān)測容器中實(shí)際溫度，保證容器中溫度為(37±2)℃。

1.4細(xì)胞生長抑制率的檢測

MTT比色法測定各組細(xì)胞的活性。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)；以4000個(gè)/孔細(xì)胞接種到96孔板中。37℃、5%CO2條件下孵育1 d；棄去培養(yǎng)液，分別加入蒸餾水溶解，提取5%FBS培養(yǎng)液200 μL，每個(gè)濃度重復(fù)3個(gè)平行樣，37℃、5%CO2條件下孵育48 h，倒置顯微鏡下觀察。按上述實(shí)驗(yàn)分組方法處理細(xì)胞。吸干培養(yǎng)液，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO溶液，置搖床上低度振蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長各孔的吸光度(A)值。細(xì)胞活力=(處理組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

1.5細(xì)胞丙二醛(MDA)含量、乳酸脫氫酶(LDH)及超氧化物歧化酶(SOD)活力的測定

取造模后各組培養(yǎng)液，用黃嘌呤氧化酶法測定細(xì)胞培養(yǎng)液的SOD含量，改良硫代巴比妥法測定細(xì)胞培養(yǎng)液的MDA含量，比色法測定細(xì)胞上清液中LDH含量，分別讀取各組培養(yǎng)液吸光度值，根據(jù)試劑盒說明書計(jì)算各培養(yǎng)液中MDA含量、SOD及LDH活力。

1.6人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的檢測

每組取3個(gè)6孔板的培養(yǎng)孔，胰酶消化法(不含EDTA)收集細(xì)胞，1 000 g離心5 min，棄上清，PBS液重懸細(xì)胞后，離心，重復(fù)2次后棄上清。分別加入緩沖液200 μL重懸并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至105個(gè)/mL。取200 μL細(xì)胞懸液，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC混勻，室溫避光孵育10 min。再加入5 μL PI染液混勻，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞生長抑制率的檢測

2.1.1低氧干預(yù)組低氧6 h、12 h組與空白對照組的相對細(xì)胞活力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但顯示有逐步下降的趨勢，而低氧24 h組的相對細(xì)胞活力明顯低于空白對照組(P=0.041)，見表1。

表1　不同低氧刺激時(shí)間組HPMVECs的活力比較

與空白對照組比較，*P<0.05

2.1.2TNF-α干預(yù)組10、20、50 ng/mL TNF-α處理組與100 ng/mL TNF-α處理組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，而TNF-α 100 ng/mL的相對細(xì)胞活力明顯低于空白對照組(P=0.006)，TNF-α對細(xì)胞活力的抑制與TNF-α濃度呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，見表2。

2.1.3低氧聯(lián)合TNF-α干預(yù)組根據(jù)以上結(jié)果，選擇低氧24 h及TNF-α 100 ng/mL作為聯(lián)合干預(yù)組，與低氧24 h、TNF-α 100 ng/mL單獨(dú)作用組比較，低氧24 h+TNF-α 100 ng/mL聯(lián)合干預(yù)組的相對細(xì)胞活力更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.002、0.005)，見表3。

表2　不同TNF-α濃度刺激組HPMVECs的活力比較

與空白對照組比較，aP<0.05；與TNF-α 10 ng/mL組比較，bP<0.05；與TNF-α 20 ng/mL組比較，cP<0.05；與TNF-α 50 ng/mL組比較，dP<0.05

2.2細(xì)胞MDA含量、LDH和SOD活力的測定結(jié)果

與空白對照組相比，低氧24 h組、TNF-α 100 ng/mL組、低氧24 h+TNF-α 100 ng/mL聯(lián)合干預(yù)組的MDA含量及LDH活力均升高(均P<0.05)，SOD活力均降低(均P<0.05)，其中聯(lián)合干預(yù)組的MDA含量和LDH活力升高更明顯，而SOD活力則更低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表4。

表3　各實(shí)驗(yàn)組HPMVECs的活力比較

與空白對照組比較，aP<0.05；與低氧24 h組比較，bP<0.05；與TNF-α 100 ng/mL組比較，cP<0.05

表4　各實(shí)驗(yàn)組MDA含量、LDH和SOD的活力比較

與空白對照組比較，aP<0.05；與低氧24 h組比較，bP<0.05；與TNF-α 100 ng/mL組比較，cP<0.05

2.3Annexin Ⅴ-PI法檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果

與空白對照組相比，低氧24 h組、TNF-α 100 ng/mL組及低氧24 h+TNF-α 100 ng/mL聯(lián)合干預(yù)組均可導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡率升高，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，其中低氧24 h+TNF-α聯(lián)合干預(yù)組與低氧或TNF-α 單獨(dú)作用組相比，細(xì)胞凋亡率增加更為明顯(P值分別為0.0007、0.0008)，見圖1。

A：空白對照組；B：低氧24 h組；C：TNF-α 100 ng/mL組；D：低氧24 h+TNF-α 100 ng/mL聯(lián)合干預(yù)組；與空白對照組比較，*P<0.05；與低氧24 h組比較，#P<0.05；與TNF-α 100 ng/mL組比較，△P<0.05圖1　各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率的比較Fig.1 Comparison of the apoptosis rate in different groups

3　討論

肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，對于COPD患者而言，低氧以及炎癥因子的刺激被認(rèn)為是主要影響因素之一，兩者均可通過引起肺血管收縮及重構(gòu)導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生；在進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)，兩者引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，繼而肺血管內(nèi)皮的損傷，是肺動(dòng)脈高壓發(fā)生的重要機(jī)制和起始環(huán)節(jié)[7-8]。

氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)是指機(jī)體組織或細(xì)胞內(nèi)的氧自由基生成增加或清除能力降低，引起氧化損傷的過程。SOD可反映細(xì)胞清除氧自由基的能力，MDA是氧自由基與生物膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其水平可反映細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度，因此在氧化應(yīng)激過程中伴有MDA、LDH的釋放增加及SOD的含量減少。已有研究顯示，低氧可通過減少NO生成、鈣超載等引起氧化損傷[9-10]，而COPD的氧化應(yīng)激還與TNF-α炎癥途徑密切相關(guān)，已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)肺動(dòng)脈高壓的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)TNF-α表達(dá)明顯增加[11]。我們的研究結(jié)果顯示，低氧24 h組、TNF-α 100 ng/mL組均出現(xiàn)MDA含量、LDH活力的升高以及SOD活力的降低，其中低氧24 h+TNF-α聯(lián)合干預(yù)組的MDA含量及LDH活力最高，而SOD活力則最低。

內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在血管生理性和病理性重構(gòu)以及逆轉(zhuǎn)重構(gòu)中起著重要作用，與肺動(dòng)脈高壓的形成密切相關(guān)[12]。無論在肺動(dòng)脈高壓的動(dòng)物模型還是低氧、野百合堿(Monocrotaline，MCT)等相關(guān)危險(xiǎn)因素誘發(fā)肺動(dòng)脈高壓的體外細(xì)胞模型中[5-6]，均可發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡數(shù)量明顯增加，而通過減少某些促凋亡因素(如低氧血癥、心房利鈉肽等)，可使HPMVECs凋亡率降低，從而減輕缺氧所造成的HPMVECs損傷，延緩肺動(dòng)脈高壓的發(fā)展[13]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，低氧24 h后，細(xì)胞生長率明顯受到抑制，而TNF-α組中，細(xì)胞生長抑制率與TNF-α濃度呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。根據(jù)以上結(jié)果，選擇了低氧24 h及TNF-α 100 ng/mL作為聯(lián)合干預(yù)組，在進(jìn)一步的細(xì)胞凋亡檢測中發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)作用組相比，低氧24 h+TNF-α聯(lián)合干預(yù)組的細(xì)胞凋亡率最高。

綜上所述，低氧聯(lián)合TNF-α作用于HPMVECs后，可使細(xì)胞的氧化應(yīng)激及凋亡率明顯增加，證實(shí)了低氧聯(lián)合TNF-α作為復(fù)合因素刺激比其單一因素刺激，對HPMVECs損傷更明顯，該體外細(xì)胞模型的建立，更客觀地呈現(xiàn)出COPD患者肺動(dòng)脈高壓時(shí)HPMVECs的真實(shí)狀態(tài)。盡管目前有許多研究證實(shí)了PI3K、P38MARK、ERK、STAT3等信號通路在血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用，但是，在不同刺激因素及不同血管內(nèi)皮細(xì)胞模型下，是否存在不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及信號通路間是否存在交叉反應(yīng)，尚需要更深入的研究進(jìn)一步闡明。

[1]Seeger W W，Adir Y Y，BarberJ J，et al.Pulmonary hypertension in chronic lung diseases[J].J Am Coll Cardiol，2013，62(25 Suppl)：D109-D116.

[2]Weir-Mccall J J，Struthers A A，Lipworth B B，et al.The role of pulmonary arterial stiffness in COPD[J].Respir Med，2015，109(11)：1381-1390.

[3]Zhu R R，Bil L，Wu S S，et al.Iptakalim attenuates hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension in rats by endothelial function protection[J].Mol Med Rep，2015，12(2)：2945-2952.

[4]Chen J J，Zhang H H，Zhang R R，et al.Transfer of human hepatocyte growth factor reduces inflammation and prevents pulmonary arterial remodeling in monocrotaline-induced[J].Int J Clin Exp Hypn，2014，7(12)：8763-8769.

[5]Taraseviciene-Stewart L L，Kasahara Y Y，Alger L L，et al.Inhibition of the VEGF receptor 2 combined with chronic hypoxia causes cell death-dependent pulmonary endothelial cell proliferation and severe pulmonary hypertension[J].FASEB J，2001，15(2)：427-438.

[6]Zhao Y Y，Campbell A A，Robb M M，et al.Protective role of angiopoietin-1 in experimental pulmonary hypertension[J].Cir Res，2003，92(9)：984-991.

[7]Lawrie A A.The role of the osteoprotegerin/tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand axis in the pathogenesis of pulmonary arterial hypertension[J].Vascul Pharmacol，2014，63(3)：114-117.

[8]Liu H H，Yang E E，Lu X X，et al.Serum levels of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand correlate with the severity of pulmonary hypertension[J].Pulm Pharmacol Ther，2015，33(8)：39-46.

[9]Ho J J，Man H H，Marsden P P.Nitric oxide signaling in hypoxia[J].J Mol Med，2012，90(3)：217-231.

[10]El-Ani D D，Philipchik I I，Stav H H，et al.Tumor necrosis factor alpha protects heart cultures against hypoxic damage via activation of PKA and phospholamban to prevent Calcium overload[J].Can J Physiol Pharmacol，2014，92(11)：917-925.

[11]Fujita M M，Shannon J J，Irvin C C，et al.Overexpression of tumor necrosis factor-alpha produces an increase in lung volumes and pulmonary hypertension[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2001，280(1)：L39-L49.

[12]Xu W W，Erzurum S S.Endothelial cell energy metabolism，proliferation，and apoptosis in pulmonary hypertension[J].Compr Physiol，2011，1(1)：357-372.

[13]Stefanec T T.Endothelial apoptosis：could it have a role in the pathogenesis and treatment of disease?[J].Chest，2000，117(3)：841-854.

(2015-10-27收稿)

Influence of Hypoxia Combined with Tumor Necrosis Factor-α on the Apoptosis and Oxidative Stress in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

Ji Shengjun，Zheng Jingping△

DepartmentofRespiratoryDiseases，TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou510120，China

ObjectiveTo explore the influence of hypoxia combined with tumor necrosis factor-α(TNF-α)on the apoptosis and oxidative stress in human pulmonary microvascular endothelial cells(HPMVECs).MethodsHPMVECs were treated by hypoxia for 6，12，or 24 h and then with TNF-α at concentration of 10，20，50，or 100 ng/mL.MTT was used to detect the cell viability in each group.The contents of malondialdehyde(MDA)，activities of lactate dehydrogenase(LDH)and superoxide dismutase(SOD)，and the apoptosis rate were determined in the combined treatment group which had the optimal treatment time of hypoxia and concentration of TNF-α.ResultsThe contents of MDA，the activities of LDH and the apoptosis rate were significantly higher and the activity of SOD was significantly lower in the combined treatment group than in single treatment group(P<0.05 for all).The apoptosis rate was highest in the 24 h hypoxia+100 ng/mL TNF-α treatment group.ConclusionThe oxidative stress and apoptosis rate are significantly increased in HPMVECs treated with hypoxia and TNF-α combined.

human pulmonary microvascular endothelial cells；oxidative stress；apoptosis

，Corresponding author，E-mail：jpzhenggy@163.com

R322.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.010

*廣東省佛山市衛(wèi)生及計(jì)生委醫(yī)學(xué)科研立項(xiàng)課題(No.2015255)

吉圣珺，女，1982年生，主治醫(yī)師，E-mail：670942334@qq.com