錢春生，　張　斌，　錢騰達，　何云文，　李益歡，　董吉榮

1江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院神經(jīng)外科，常州　2132002中國人民解放軍101醫(yī)院，無錫　214000

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老年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后血管再生調(diào)節(jié)因子表達與腸黏膜、腸屏障功能的變化

錢春生1，張斌1，錢騰達1，何云文1，李益歡1，董吉榮2

1江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院神經(jīng)外科，常州2132002中國人民解放軍101醫(yī)院，無錫214000

目的觀察老年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后血管再生調(diào)節(jié)因子表達與腸黏膜、腸屏障功能的變化。方法選擇體重為500～600 g，17～20個月月齡的健康老年雄性SD大鼠，制備老年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型，按損傷時間分為傷后3、12、24、72 h和5 d，假手術(shù)組為對照組，每組10只。記錄和比較各組大鼠行為學(xué)、腦組織含水量、腸黏膜顯微特征、腸屏障功能和腦組織中VEGF和CD34蛋白表達。結(jié)果與對照組比較，創(chuàng)傷性顱腦損傷3 h～5 d，隨著損傷時間的延長，大鼠的行為學(xué)評分、腦組織含水量、腦組織中VEGF和CD34蛋白表達均明顯增高(均P<0.05)，腸絨毛高度、絨毛中段直徑、隱窩深度和絨毛表面積均明顯降低(均P<0.05)；腸黏膜絨毛的破壞度明顯，絨毛間質(zhì)疏松，腸絨毛排列不規(guī)則甚至斷裂，絨毛上皮壞死脫落，變矮，間距增寬，固有層出現(xiàn)不同程度水腫，上述異常在傷后24～72 h達到高峰(均P<0.05)。結(jié)論密切關(guān)注老年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后24～72 h的病情轉(zhuǎn)歸對降低病殘和致死率應(yīng)有積極意義，增高VEGF和CD34表達，促進血管再生可能是治療創(chuàng)傷性腦損傷后繼發(fā)性腦損害的新思路。

老年大鼠；創(chuàng)傷性腦損傷；血管再生調(diào)節(jié)因子；腸黏膜；腸屏障功能

導(dǎo)致創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)相關(guān)的致殘或致死與創(chuàng)傷性顱腦損傷后腸道功能改變有關(guān)，因為腸道功能改變可導(dǎo)致多器官功能衰竭(multiple-organ pathology，MOF)，這一點在老年創(chuàng)傷性顱腦損傷患者表現(xiàn)得尤為明顯。美國每年創(chuàng)傷性顱腦損傷的人數(shù)超過170萬，死亡率超過2‰，死亡人數(shù)中老年人超過半數(shù)[1-2]。但腸道功能改變導(dǎo)致MOF或死亡的機制尚不明確?，F(xiàn)有的研究顯示創(chuàng)傷性腦損傷后血管再生可減輕或修復(fù)繼發(fā)性腦損傷，有助于挽救神經(jīng)元和恢復(fù)腦缺血區(qū)血供，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和分化簇抗原34(cluster of differentiation 34，CD34)蛋白是2種研究較為成熟的血管再生調(diào)節(jié)因子[3-4]。因此本課題擬制備老年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型，分析腸道功能改變特征及VEGF和CD34蛋白的變化，為研究和治療老年創(chuàng)傷性腦損傷提供參考。

1　材料和方法

1.1受試動物

選擇體重為500～600 g，17～20個月月齡的健康老年雄性SD大鼠。動物來源：上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號SCXK(滬)2008-0016，晝夜節(jié)律飼養(yǎng)，自由飲食飲水，實驗室內(nèi)適應(yīng)飼養(yǎng)1周后再進行試驗。

1.2試劑與儀器

兔抗鼠CD34一抗，兔抗鼠單克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒和抗原修復(fù)液均由武漢博士德生物公司提供，DAB顯色試劑盒由福建邁新生物技術(shù)有限公司提供，甲醛、二甲苯、乙醇、PBS和蘇木精等均由常州市緯凱化工化學(xué)試劑有限公司提供。奧林巴斯顯微鏡、奧林巴斯電子顯微鏡為日本奧林巴斯公司產(chǎn)品，EG1150 C包埋機為德國LEICA公司產(chǎn)品，微量電子天平為瑞士儀器公司產(chǎn)品。

1.3實驗方法

1.3.1老年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型的制備采用Feeney方法制作大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型。老年大鼠全麻后，將頭部固定在立體定向儀上，沿正中線切開頭皮剝離骨膜，在前囟后3.5 mm和中線右旁2.5 mm處鉆開直徑約5 mm的圓形骨窗，采用撞擊器的撞桿頭端置于骨窗處，40 g重量擊錘外周套管自由落下15 cm沖撞桿，采用牙托粉封閉骨窗并縫合頭皮。

1.3.2分組將老年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型按損傷時間分為傷后3、12、24、72 h和5 d組，將僅切開頭皮，不進行自由落體打擊處理的大鼠作為對照組，每組10只。

1.3.3指標(biāo)檢測①動物行為學(xué)觀察：從大鼠的運動(1～6分)、感覺(0～2分)、平衡(0～6分)和反射能力(0～4分)對行為學(xué)評價，總分為18分，分?jǐn)?shù)越低則腦損傷程度越輕。輕度：1～6分，中度：7～12分，重度：13～18分。②腦組織含水量：分別于各組時間點處死大鼠，每組取5例，迅速剝離大腦，吸去表面血跡及液體并稱重，放入恒溫干燥箱100℃，至恒重，記錄干重，計算每只大鼠的腦組織含水量(%)。③腸黏膜：取各組大鼠的小腸腸黏膜，采用甲醛固定，HE染色，顯微鏡下觀察。④腸屏障功能指標(biāo)：取空腸3 cm，在光鏡下記錄空腸腸絨毛高度、絨毛中段直徑和隱窩深度，并計算絨毛表面積(絨毛表面積=×腸絨毛高度×絨毛中段直徑)。⑤腦組織中VEGF和CD34蛋白表達：分別于各時間點處死大鼠，每組取5只，標(biāo)記額側(cè)腦組織，置于多聚甲醛中固定，石蠟包埋、切片。采用免疫組織化學(xué)法檢測腦組織中，VEGF和CD34蛋白表達。取病理切片，用3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS水洗，分別于一抗(兔抗鼠VEGF和CD34)，二抗及過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素和抗體孵育，PBS替代一抗為陰性對照，DAB染色15 min，蘇木精復(fù)染，封片觀察。VEGF蛋白存在于神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞，CD34蛋白存在于內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)，棕黃色為陽性，測定陽性細(xì)胞的吸光度(A)值。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計數(shù)資料用頻數(shù)、百分比進行描述；采用t檢驗、方差分析和χ2檢驗進行統(tǒng)計分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1創(chuàng)傷性顱腦損傷對大鼠行為和腦組織含水量的影響

與對照組比較，創(chuàng)傷性顱腦損傷大鼠3 h～5 d，隨著損傷時間的延長，大鼠的行為學(xué)評分和腦組織含水量明顯增高(均P<0.05)，傷后24～72 h達到高峰(均P<0.05)，見表1。

表1　創(chuàng)傷性顱腦損傷對大鼠行為的影響±s)

與對照組比較，*P<0.05；與傷后3 h比較，△P<0.05；與傷后12 h比較，▲P<0.05；與傷后24 h比，#P<0.05

2.2創(chuàng)傷性顱腦損傷對大鼠腸黏膜顯微結(jié)構(gòu)的影響

對照組大鼠腸黏膜形態(tài)正常，腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)完整，絨毛排列整齊，上皮細(xì)胞排列整齊，間質(zhì)無水腫；創(chuàng)傷性顱腦損傷大鼠3 h～5 d，隨著損傷時間的延長，腸黏膜絨毛的破壞越明顯，絨毛間質(zhì)越疏松、腸絨毛排列不規(guī)則甚至斷裂，絨毛上皮壞死脫落，變矮，間距增寬，固有層出現(xiàn)不同程度水腫，見圖1。

A：對照組；B：傷后3 h；C：傷后12 h；D：傷后24 h；E：傷后72 h；F：傷后5 d圖1　創(chuàng)傷性顱腦損傷對大鼠腸黏膜的影響(蘇木精-伊紅染色，×100)Fig.1 Impact of traumatic brain injury on the intestinal mucosa of aged rats(HE staining，×100)

2.3創(chuàng)傷性顱腦損傷對大鼠腸屏障功能的影響

創(chuàng)傷性顱腦損傷后不同時間大鼠的腸絨毛高度、絨毛中段直徑、隱窩深度和絨毛表面積均有不同程度的減少，上述指標(biāo)在傷后3 h變化最小，傷后24～72 h減少最為明顯(均P<0.05)，傷后5 d雖然有減少，減少趨勢較小，見表2。

表2　創(chuàng)傷性顱腦損傷對大鼠腸屏障功能的影響±s)

與對照組比較，*P<0.05；與傷后3 h比較，△P<0.05；與傷后12 h比較，▲P<0.05；與傷后24 h比，#P<0.05

2.4創(chuàng)傷性顱腦損傷對大鼠腦內(nèi)VEGF和CD34蛋白表達的影響

與對照組大鼠相比，創(chuàng)傷性顱腦損傷后不同時間大鼠VEGF和CD34蛋白表達均有不同程度的增高，傷后3 h變化最小，傷后24～72 h達到高峰(均P<0.05)，見表3和圖2。

表3　創(chuàng)傷性顱腦損傷對大鼠腦內(nèi)VEGF和CD34蛋白表達的影響±s)

與對照組比較，*P<0.05；與傷后3 h比較，△P<0.05；與傷后12 h比較，▲P<0.05；與傷后24 h比，#P<0.05

A：對照組；B：傷后3 h；C：傷后12 h；D：傷后24 h；E：傷后72 h；F：傷后5 d圖2　創(chuàng)傷性顱腦損傷對大鼠腦內(nèi)VEGF和CD34蛋白表達的影響(DAB染色，×100)Fig.2 Impact of traumatic brain injury on the expression of VEGF and CD34 in brain tissues of aged rats(DAB staining，×100)

3　討論

創(chuàng)傷性顱腦損傷是常見的神經(jīng)外科急癥，是外傷中可致傷殘或死亡的頭號重癥。因為創(chuàng)傷性顱腦損傷主要傷及腦部神經(jīng)，臨床病理表現(xiàn)較為復(fù)雜[5-8]。

創(chuàng)傷性顱腦損傷的應(yīng)激狀態(tài)使得內(nèi)臟血流灌注量降低，低氧、缺血-再灌注損傷的刺激可影響腸黏膜屏障功能，表現(xiàn)在腸黏膜通透性升高、炎癥介質(zhì)的釋放、細(xì)菌移位/失衡和腸源性感染[7]。本研究結(jié)果也顯示了老年大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后5 d內(nèi)腸絨毛高度、絨毛中段直徑、隱窩深度和絨毛表面積均有不同程度的減少，伴隨腸黏膜絨毛破壞，絨毛間質(zhì)疏松、腸絨毛排列規(guī)則甚至斷裂，絨毛上皮壞死脫落，變矮，間距增寬和固有層出現(xiàn)不同程度水腫，以上腸病理變化均證實了創(chuàng)傷性顱腦損傷與腸道病理損傷密切相關(guān)。

繼發(fā)性腦損傷對于評估創(chuàng)傷性顱腦損傷預(yù)后具有重要的參考價值。腦水腫是腦損傷的重要參數(shù)，創(chuàng)傷性顱腦損傷急性期的腦水腫病理本質(zhì)在于血管源性水腫，呈漸進性發(fā)展，重度腦水腫則具有致命性。本研究結(jié)果顯示，損傷后3 h的腦含水量較對照組已明顯增高，提示創(chuàng)傷性顱腦損傷導(dǎo)致的腦內(nèi)微血管頭痛與胞質(zhì)和基底膜間的細(xì)胞間隙滲出的水分有關(guān)。

VEGF是最重要的內(nèi)源性血管再生因子，可通過激活Flk-1來實現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的主要生理功能，也可以通過結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGF受體，促進內(nèi)皮細(xì)胞的存活和增殖，因此VEGF幾乎可干擾血管生成過程的所有階段，可增大新生血管管腔，增多分支，促進內(nèi)皮細(xì)胞間、內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的連接，維持新生血管的結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性，增加血管通透性[9]。有研究認(rèn)為VEGF表達增高與腦組織含水量增高有關(guān)，因此主張給予抗VEGF治療創(chuàng)傷性顱腦損傷[10]，但筆者對此并不認(rèn)可，因為與增加通透性相比，VEGF對于保護、穩(wěn)定和建立新生血管具有明顯優(yōu)勢，有利于腦損傷恢復(fù)的功能更明顯。本研究顯示創(chuàng)傷性腦損傷后VEGF水平可迅速升高，這是機體對腦組織缺血缺氧的代償反應(yīng)，VEGF升高有助于改善受損腦組織的血供并修復(fù)血管。類似的研究也顯示了VEGF對缺氧缺血的即時反應(yīng)，心臟驟停所致全腦缺血再灌注的大鼠腦內(nèi)VEGF mRNA和VEGF蛋白可分別在2～3 d內(nèi)達到高峰，并持續(xù)1周，缺血區(qū)VEGF表達有助于改善側(cè)支循環(huán)。與VEGF相似，當(dāng)大腦缺血缺氧情況下，CD34表達也增高，宓丹等[11]研究顯示大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血區(qū)大腦皮層CD34表達明顯增高，缺血再灌注24～72 h達到高峰，CD34表達與微血管密度同步，可見CD34具有誘導(dǎo)側(cè)支循環(huán)的建立和微血管形成的功能。總之，VEGF和CD34表達增高是刺激機體產(chǎn)生內(nèi)源性保護機制的物質(zhì)體現(xiàn)。

綜上，隨著損傷時間的延長，大鼠的行為學(xué)評分增高，腦含水量增高，腸屏障功能降低，腸黏膜破壞，VEGF和CD34表達增高，這些異常的變化可在損傷后24～72 h達到高峰，該結(jié)果也與臨床創(chuàng)傷性腦損傷后2～3 d是患者的危重時期吻合，因此密切關(guān)注并控制該時期的病情轉(zhuǎn)歸對降低病殘和致死率應(yīng)有積極意義，另外，既然VEGF和CD34表達是機體產(chǎn)生內(nèi)源性保護機制的體現(xiàn)，那么增高其表達、促進血管再生可能是創(chuàng)傷性腦損傷后繼發(fā)性腦損害治療的新思路。

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(2016-01-12收稿)

Changes of the Expression of Regulatory Factors of Angiogenesis，Intestinal Mucosa and Intestinal Barrier Function in Aged Rats with Traumatic Brain Injury

Qian Chunsheng，Zhang Bin，Qian Tengdaetal

DepartmentofNeurosurgery,JintanAffiliatedHospitalofJiangsuUniversity，Changzhou213200，China

ObjectiveTo investigate the changes of regulatory factors of angiogenesis，intestinal mucosa and intestinal barrier function in aged rats with traumatic brain injury.MethodsTraumatic brain injury models were established in healthy aged male SD rats weighing 500-600 g at age of 17-20 months.They were divided into 5 groups according to the injury time：3 h group，12 h group，24 h group，72 h group and 5 day group，with sham-operated group serving as the control group(n=10 each).The behavior，brain water content，intestinal microscopic characteristics，intestinal barrier function，VEGF and CD34 expression in brain tissues were examined and compared between groups.ResultsThe behavioral score，brain water content，VEGF and CD34 protein expression were significantly increased in brain tissues with the extension of traumatic injury(from 3 h to 5 d)(P<0.05).After the traumatic brain injury，the height of the intestinal villi，the diameter of the middle part of the villi，the crypt depth and the villus surface area were significantly decreased(P<0.05)；the intestinal mucosal villi were damaged；the villous stroma became loose；the stinal villi were irregularly arranged and even ruptured；the villous epithelial cells became necrotic，shorter，with the space widened；the lamina propria developed edema of different degree.The abnormalities reached a peak 24-72 h after injury(P<0.05).ConclusionMore attention should be paid to the period of 24-72 h after traumatic brain injury in aged rats.This period is of significance in the recovery of the condition and the decrease of the disability and the mortality.Increasing the expression of VEGF and CD34 protein and promoting the angiogenesis may help improve the second brain damage after traumatic brain injury.

aged rats；traumatic brain injury；regulatory factors of angiogenesis；intestinal mucosa；intestinal barrier function

R641；R574.4

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.005

錢春生，男，1983年生，主治醫(yī)師，E-mail：20589378@qq.com