肖淑珍， 褚海青， 趙 蘭， 張靜波， 李 冰， 郭慶蘭

鮑曼不動桿菌耐氨芐西林-舒巴坦與青霉素結(jié)合蛋白基因變異的相關(guān)性

肖淑珍1， 褚海青2， 趙 蘭2， 張靜波2， 李 冰2， 郭慶蘭3

目的 測定鮑曼不動桿菌臨床分離株對常用抗菌藥物的敏感性；分析青霉素結(jié)合蛋白（PBP）基因的變異，探索其與鮑曼不動桿菌對氨芐西林-舒巴坦耐藥的相關(guān)性。方法 收集上海市4所教學(xué)醫(yī)院臨床分離的鮑曼不動桿菌67株，采用瓊脂稀釋法測定其對常用抗菌藥物的最低抑菌濃度。擴(kuò)增所有臨床株的7種PBP基因并測序。比較該菌氨芐西林-舒巴坦敏感組與耐藥組之間核苷酸序列差異。結(jié)果 臨床分離鮑曼不動桿菌對常用抗菌藥物耐藥率高，對氨芐西林-舒巴坦耐藥率為67.6%。測序結(jié)果顯示敏感株及耐藥株間未發(fā)現(xiàn)PBP的氨基酸變異。結(jié)論 臨床分離鮑曼不動桿菌對氨芐西林-舒巴坦耐藥率較高。其耐藥機(jī)制與PBP變異無相關(guān)性。

鮑曼不動桿菌； 青霉素結(jié)合蛋白； 氨芐西林-舒巴坦

鮑曼不動桿菌屬不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌，根據(jù)CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測資料顯示，自2010年起鮑曼不動桿菌在醫(yī)院感染中占第3位，成為僅次于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的重要革蘭陰性桿菌［1-3］。近年來，鮑曼不動桿菌耐藥趨勢日益嚴(yán)重，部分菌株僅對β內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑、黏菌素、替加環(huán)素敏感。

舒巴坦是對鮑曼不動桿菌具有抗菌活性的β內(nèi)酰胺酶抑制劑，當(dāng)多重耐藥鮑曼不動桿菌感染時，舒巴坦是一種合適的選擇［4-6］。含舒巴坦復(fù)方制劑是國內(nèi)治療鮑曼不動桿菌感染常用的抗菌藥物。近年國內(nèi)外研究顯示舒巴坦復(fù)方制劑（氨芐西林-舒巴坦及頭孢哌酮-舒巴坦）對鮑曼不動桿菌抗菌活性明顯下降［1-3］。

本研究旨在測定鮑曼不動桿菌臨床分離株對常用抗菌藥物的敏感性，分析青霉素結(jié)合蛋白（PBP）基因的變異，初步探索與氨芐西林-舒巴坦耐藥的相關(guān)性。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 收集2011年7月—2012年5月上海市4所教學(xué)醫(yī)院臨床分離的鮑曼不動桿菌67株，剔除同一患者重復(fù)菌株，其中包括仁濟(jì)醫(yī)院5株，第六人民醫(yī)院7株，華山醫(yī)院27株，瑞金醫(yī)院28株。所有菌株經(jīng)檢測blaoxa-51-like及16S-23S rRNA基因［7-8］測序鑒定證實。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC 25922，銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1.1.2主要藥物和試劑 亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、哌拉西林、頭孢他啶、米諾環(huán)素、環(huán)丙沙星、氨芐西林-舒巴坦、舒巴坦、頭孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、黏菌素、替加環(huán)素、甲氧芐啶-磺胺甲唑等抗菌藥物（上?？萍阉帣z器材公司）；dNTP、Taq DNA酶（TaKaRa，大連）。

1.1.3主要儀器 PCR擴(kuò)增儀ABI 2700及RTPCR擴(kuò)增儀ABI PRISM 7500（ ABI，美國）；電泳儀、凝膠成像儀及紫外線投射凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）。

1.2方法

1.2.1抗菌藥物敏感性試驗 采用瓊脂稀釋法檢測67株鮑曼不動桿菌對15種抗菌藥物的最低抑菌濃度（MIC），計算MIC范圍、MIC50、MIC90。結(jié)果判定參照2012年美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)［9］。多重耐藥（MDR）是指對下列5類抗菌藥物中至少3類耐藥的菌株，包括：頭孢菌素、碳青霉烯類抗生素、含有β內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)合制劑（包括哌拉西林-他唑巴坦、頭孢哌酮-舒巴坦、氨芐西林-舒巴坦）、氟喹諾酮類抗菌藥物、氨基糖苷類抗生素。

1.2.2PCR檢測基因 從平皿上挑取3～4個菌落置于300 μL ddH2O中，100 ℃煮沸15 min后12 000 g離心15 min，取上清液即為DNA模板。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列及反應(yīng)體系見參考文獻(xiàn)［10］。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，以鮑曼不動桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17978作為參照菌株進(jìn)行堿基序列比對。

2　結(jié)果

2.1藥敏結(jié)果

67株鮑曼不動桿菌對常用抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果見表1。參考2012年CLSI標(biāo)準(zhǔn)，鮑曼不動桿菌對常用抗菌藥物的耐藥率較高，對頭孢菌素類如頭孢他啶的耐藥率為82.0%；對碳青霉烯類如亞胺培南、美羅培南的耐藥率分別為65.6%、41.8%；對氨基糖苷類如阿米卡星耐藥率67.1%；對酶抑制劑復(fù)方制劑氨芐西林-舒巴坦和哌拉西林-他唑巴坦的耐藥率分別為67.6%和73.1%。根據(jù)氨芐西林-舒巴坦的藥敏結(jié)果將細(xì)菌分組，包括耐藥組（46株）、中介組（6株）和敏感組（15株）。耐藥組細(xì)菌對其他抗菌藥物也普遍表現(xiàn)為耐藥（除黏菌素外），MDR率達(dá)69.6%；而敏感組細(xì)菌耐藥譜則相對較窄，未發(fā)現(xiàn)MDR菌株。

表1　常用抗菌藥物對67株鮑曼不動桿菌抗菌活性Table 1 Activity of antimicrobial agents against 67 strains of Acinetobacter baumannii

2.2PBP基因擴(kuò)增及測序

67株鮑曼不動桿菌均成功擴(kuò)增到7種PBP基因并進(jìn)行測序。與標(biāo)準(zhǔn)菌株比對，敏感組與耐藥組間存在核苷酸序列差異，但兩者未發(fā)現(xiàn)氨基酸序列的差異，見表2。7種基因氨基酸序列見圖1。

表2　不同菌株中堿基序列變異分析Table 2 Analysis of gene mutations in different strains

圖1　臨床菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株氨基酸序列對比Figure 1 Deduced amino acid sequences of several genes compared between clinical strains and reference strains

3　討論

近年來，鮑曼不動桿菌對舒巴坦復(fù)方制劑的敏感率逐年下降。CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示2007—2009年，鮑曼不動桿菌對氨芐西林-舒巴坦的敏感率分別是 39.6%、37.6%和37.1%［11-13］。國外文獻(xiàn)也報道，含舒巴坦復(fù)方制劑對鮑曼不動桿菌抗菌活性明顯下降［1-3］。不同地區(qū)不同醫(yī)院鮑曼不動桿菌的耐藥率也有不同，2010年安徽、北京、重慶、昆明等地報道的耐藥率分別是58.0%、60.6%、67.1%及71.7%［1］。本研究中，鮑曼不動桿菌對氨芐西林-舒巴坦的耐藥率為67.6%，提示上海地區(qū)耐藥水平較高。

PBP是細(xì)菌細(xì)胞膜的重要組成成分，主要參與細(xì)菌細(xì)胞壁的合成［10］。不同細(xì)菌中PBP的種類及含量均不相同，如糞腸球菌中有5種PBP，肺炎鏈球菌中有分子量43～100 ku的7種PBP，在鮑曼不動桿菌中存在7種PBP［14-15］。有研究表明PBP在某些細(xì)菌耐藥中起著重要作用，其基因突變或者與抗菌藥物親和力下降將導(dǎo)致細(xì)菌對某些藥物耐藥［16-18］。

GEHRLEIN等［19］發(fā)現(xiàn)在1株亞胺培南耐藥的鮑曼不動桿菌中，外膜蛋白沒有異常，也未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶，作者推測PBP的變異直接導(dǎo)致了細(xì)菌的耐藥。近期有國外學(xué)者對臨床分離鮑曼不動桿菌中PBP進(jìn)行分析，在26株菌株中均檢測到7種PBP基因，與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比較后發(fā)現(xiàn)臨床菌株中存在堿基高突變區(qū)域，但氨基酸序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株則保持高度的一致性［19］。本研究提示氨芐西林-舒巴坦耐藥與敏感組菌株中均未發(fā)現(xiàn)PBP存在氨基酸有義突變，因此推測氨芐西林-舒巴坦耐藥與PBP變異沒有相關(guān)性。

本研究顯示，臨床分離鮑曼不動桿菌對氨芐西林-舒巴坦耐藥率較高，其耐藥機(jī)制與PBP變異無相關(guān)性。

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Correlation between ampicillin-sulbactam resistance and penicillin-binding protein gene variation in Acinetobacter baumannii

XIAO Shuzhen， CHU Haiqing， ZHAO Lan， ZHANG Jingbo， LI Bing， GUO Qinglan. （Department of Clinical Microbiology， Ruijin Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， Shanghai 200025， China）

Objective To determine the susceptibility of Acinetobacter baumannii isolates to commonly used antibiotics，characterize mutation status of penicillin-binding protein （pbp） gene and analyze the association between pbp gene and ampicillinsulbactam resistance. Methods A total of 67 A. baumannii strains were collected from four teaching hospitals in Shanghai. The minimum inhibitory concentrations of antibiotics were determined for A. baumannii by agar dilution method. PCR and gene sequencing were conducted to analyze 7 pbp genes in all stains. The nucleotide sequence was compared between the strains susceptible to ampicillin-sulbactam and the strains resistant to ampicillin-sulbactam. Results The A. baumannii isolated from patients showed high resistance rate to common antibiotics， 67.6% resistant to ampicillin-sulbactam. Sequencing analysis showed that no amino acid variation was found for all 7 pbp genes whether the strains were susceptible or resistant. Conclusions Clinical isolates of A. baumannii are highly resistant to ampicillin-sulbactam， while pbp gene is not involved in the mechanism of ampicillinsulbactam resistance.

Acinetobacter baumannii； penicillin-binding protein； ampicillin-sulbactam

·論著·

R378

A

1009-7708（2016）01-0057-04

10.16718/j.1009-7708.2016.01.013

上海市科學(xué)技術(shù)委員會自然科學(xué)基金項目（12ZR1426200），上海市科學(xué)技術(shù)委員會醫(yī)學(xué)引導(dǎo)項目（14411962900）。

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海 200025；

2. 上海同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院呼吸科；

3. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所。

肖淑珍（1988—），女，碩士研究生，主要從事微生物耐藥機(jī)制研究。

褚海青，E-mail： chu_haiqing@126.com。

2015-06-11

2015-07-09