陳 柳，余 斌，倪 征，華炯鋼，葉偉成，云 濤，張 存

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021）

表達(dá)小鵝瘟病毒VP2蛋白重組鴨瘟病毒的構(gòu)建及其生物學(xué)特性

陳 柳，余 斌，倪 征，華炯鋼，葉偉成，云 濤，張 存

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021）

【目的】鴨瘟和小鵝瘟是番鴨和鵝的兩種重要傳染病，鴨瘟最主要的防治措施是定期接種鴨瘟病毒減毒活疫苗。根據(jù)2012年國際病毒分類委員會（ICTV）的報(bào)告，DEV被歸為皰疹病毒科的α皰疹病毒亞科馬立克氏病毒屬。皰疹病毒如偽狂犬病毒、馬立克氏病毒、火雞皰疹病毒等已廣泛用于病毒活載體的研究，而近幾年也有關(guān)于鴨瘟病毒（DEV）作為疫苗活載體的報(bào)道。為了為免疫防控鴨瘟和小鵝瘟提供新手段，本研究擬在鴨瘟病毒疫苗株感染性克隆的基礎(chǔ)上，構(gòu)建表達(dá)小鵝瘟病毒（GPV）主要免疫原蛋白VP2的重組病毒rDEV-VP2，并研究其生物學(xué)特性，進(jìn)而探討重組病毒rDEV-VP2作為防治DEV和GPV的二聯(lián)重組活載體疫苗的可能性?！痉椒ā繉⒚艽a子優(yōu)化的 GPV VP2基因通過常規(guī)基因克隆的方法插入轉(zhuǎn)移載體 pEP-BGH-end，構(gòu)建含有 GPV VP2表達(dá)框pCMV-VP2-BGH-pA的重組表達(dá)質(zhì)粒。在鴨瘟病毒（DEV）疫苗株細(xì)菌人工染色體克隆pDEV-EF1的基礎(chǔ)上，通過“Red E/T”兩步重組法將GPV VP2基因表達(dá)框插入到DEV US7和US8基因之間構(gòu)建了突變體克隆pDEV-VP2。利用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞（CEFs）拯救獲得重組病毒rDEV-VP2和刪除Bac質(zhì)粒序列的rDEV-VP2-Cre，并對重組病毒細(xì)胞體外生長曲線、蝕斑大小和VP2蛋白表達(dá)情況進(jìn)行測定。將rDEV-VP2接種番鴨，在不同時間采集血清，采用間接ELISA法檢測血清中GPV VP2抗體產(chǎn)生情況?！窘Y(jié)果】間接免疫熒光檢測和Western blot分析表明，外源蛋白VP2在CEFs細(xì)胞成功表達(dá)。病毒生長曲線和蝕斑大小測定結(jié)果顯示，rDEV-VP2在CEFs細(xì)胞上的增殖滴度與親本株相比無顯著差異，表明外源基因VP2的插入不影響rDEV重組病毒的增殖。動物試驗(yàn)結(jié)果表明，7日齡雛番鴨接種rDEV-VP2可以誘導(dǎo)產(chǎn)生針對GPV VP2的抗體，免疫后3周抗體陽性率為50%（4/8）?！窘Y(jié)論】將小鵝瘟病毒的主要免疫原基因VP2插入到DEV疫苗株基因組的US7和US8基因間構(gòu)建了表達(dá)該免疫原性基因的重組鴨瘟病毒細(xì)菌人工染色體，繼而在雞胚成纖維細(xì)胞（CEFs）上拯救獲得了重組病毒rDEV-VP2，病毒細(xì)胞生長特性與親本株基本一致，且能誘導(dǎo)鴨體產(chǎn)生GPV VP2特異性的抗體。該研究為研制DEV-GPV二聯(lián)重組活載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。

鴨瘟病毒；鵝細(xì)小病毒；VP2；重組病毒

0　引言

【研究意義】鴨瘟（即鴨病毒性腸炎），是鴨、鵝、天鵝的一種急性、熱性、敗血性傳染病。其病原體為鴨瘟病毒（duck plaque virus，DPV），又稱鴨腸炎病毒（duck enteritis virus，DEV）；小鵝瘟是由鵝細(xì)小病毒（goose parvovirus，GPV）引起的雛鵝和雛番鴨的一種急性或亞急性的敗血性傳染病，死亡率高。目前，已有新型GPV感染櫻桃谷鴨的病例出現(xiàn)。迄今為止，接種弱化疫苗仍是預(yù)防和控制致死性 DEV和GPV感染的主要途徑。與常規(guī)弱化疫苗相比，以鴨瘟病毒作為載體表達(dá) GPV抗原的新型重組活載體疫苗不僅可一針防兩病，節(jié)約成本，也可減少免疫副反應(yīng)，更便于鑒別診斷。因此，本研究擬在建立的鴨瘟病毒疫苗株反向遺傳操作平臺的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索以DEV作為載體表達(dá)GPV抗原、研發(fā)GPV-DEV二聯(lián)苗的可能性。【前人研究進(jìn)展】DEV在分類上屬皰疹病毒科，α-皰疹病毒亞科。α-皰疹病毒是一類極具開發(fā)前景的病毒活載體，不僅具有基因組大、非必需基因多、能插入外源基因的容量大、遺傳穩(wěn)定、受母源抗體干擾小、體內(nèi)存活時間較長等優(yōu)點(diǎn)，而且已成功研制了許多基因缺失疫苗株，是作為病毒活載體極佳的候選之一［1，2］。表達(dá)雞傳染性法氏囊病（IBD）病毒VP2蛋白的火雞皰疹病毒（HVT）活載體疫苗，可以有效防控IBD和馬立克氏病，疫苗已經(jīng)在養(yǎng)禽業(yè)得到廣泛應(yīng)用［3］。此外，以HVT、偽狂犬病病毒（PRV）、馬立克氏病毒（MDV）、馬1型皰疹病毒（EHV- 1）、牛1型皰疹病毒（BHV-1）和牛皰疹病毒4型（BHV-4）等作為載體的重組病毒研究已經(jīng)非常廣泛，這些皰疹病毒成為表達(dá)其他病毒性疾病保護(hù)性抗原基因比較理想的動物病毒活載體［4-17］。鴨瘟疫苗具有良好的免疫效果和安全性，疫苗生產(chǎn)和應(yīng)用技術(shù)成熟。近年來，隨著鴨瘟病毒基因組全序列的解析和反向遺傳系統(tǒng)技術(shù)的建立［18-20］，鴨瘟病毒作為疫苗活載體研究取得了顯著的進(jìn)展。WANG等分別以UL44（gC）基因缺失的鴨瘟病毒強(qiáng)毒株和疫苗株為載體，表達(dá)了H5N1禽流感病毒的HA基因［19，21］；ZOU等也以鴨瘟病毒疫苗株為載體表達(dá)了同源和異源高致病性H5N1禽流感病毒的HA基因，攜帶HA基因的重組鴨瘟病毒能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)答H5病毒的體液反應(yīng)和T細(xì)胞免疫，且對H5N1和DEV感染產(chǎn)生快速、持久的保護(hù)［22］；LIU等研究證實(shí)，在DEV疫苗株UL41基因內(nèi)部插入外源基因既不影響病毒復(fù)制表型，也不增加鴨瘟病毒疫苗株對鴨的毒力［23］；LIU等成功構(gòu)建了US2基因缺失或gI/gE雙基因缺失的重組鴨瘟病毒，并以之為載體表達(dá)了鵝H5亞型禽流感病毒的HA基因［25］；CHEN等分別以 DEV作為載體表達(dá)了鴨坦布蘇病毒的主要抗原蛋白，重組病毒皆能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生鴨坦布蘇病毒的中和抗體［26-28］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前關(guān)于以鴨瘟病毒作為載體表達(dá)鵝細(xì)小病毒抗原基因的研究仍是空白，研制出這兩種病毒的重組疫苗對生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬將GPV的主要保護(hù)性抗原基因VP2插入到DEV疫苗株基因組的US7和US8基因間，構(gòu)建表達(dá)該免疫原性基因的重組鴨瘟病毒細(xì)菌人工染色體，繼而在雞胚成纖維細(xì)胞（CEFs）上拯救獲得了重組病毒rDEV-VP2，并對其在CEFs細(xì)胞上的生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究，該研究為研制GPV-DEV基因重組活載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

試驗(yàn)于2013年1月至2014年7月在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所完成。

1.1菌株、質(zhì)粒和病毒株

pEP-BGH-end質(zhì)粒、鴨瘟病毒感染性克隆質(zhì)粒pDEV-vac和pDEV-EF1，大腸桿菌菌株GS1783和鴨瘟病毒重組病毒株 rDEV-Cre均由浙江省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所構(gòu)建并保存［20，28］。

1.2主要試劑

快速連接試劑盒、限制性內(nèi)切酶、DNA凝膠純化試劑盒，均購于大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒提取純化試劑盒購于OMEGA公司；DMEM、胎牛血清均購于 Gibcol BRL公司；磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒購于Promega公司。GPV VP2多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG和FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購于中杉金橋生物公司。

1.3序列優(yōu)化、引物設(shè)計(jì)、及合成

鵝細(xì)小病毒 VP2基因序列參考 GenBank （U25749.1），由GenScript公司以禽為宿主進(jìn)行優(yōu)化合成。DEV和GPV VP2引物分別參考序列GenBank （EU082088.2）、GPV VP2優(yōu)化序列設(shè)計(jì)，由生工公司合成，序列見表1。pDEV vac-in-s和pDEVvac-in-as用于將表達(dá)框pCMV-VP2-BGH-pA插入到DEV基因組的 US7和 US8基因之間。下劃線部分與pEP-BGH-VP2同源，粗體部分分別與位于US7和US8基因間插入位點(diǎn)上、下游的序列同源。引物Rec-JD-F 和 Rec-JD-R用于外源基因插入 BAC基因組中的驗(yàn)證。

1.4pEP-BGH-VP2質(zhì)粒的構(gòu)建

以禽為宿主進(jìn)行優(yōu)化合成的GPV VP2基因合成時在其5′和3′端分別引入了KpnI和Not I酶切位點(diǎn)，將片段用 KpnI和 Not I進(jìn)行雙酶切之后插入到pEP-BGH-end相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中。通過PCR和酶切鑒定篩選獲得陽性克隆，送Invitrogen生物公司測序。

1.5pDEV-VP2突變體的構(gòu)建

通過RedE/T重組將Pcmv-VP2-BGH-pA表達(dá)框插入到egfp基因CMV啟動子替換為EF1的鴨瘟病毒疫苗株BAC克隆pDEV-EF1［28］。獲得的Bac質(zhì)粒命名為pDEV-VP2。以 pEP-BGH-VP2質(zhì)粒為模板，用引物pDEVvac-in-s和pDEVvac-in-as（序列見表1）擴(kuò)增長度約為3 913 bp的片段，膠回收后電轉(zhuǎn)化至pDEV-EF1/ GS1783感受態(tài)細(xì)胞。最后以pDEV-VP2為模板，用引物Rec-JD-F和Rec-JD-R（序列見表1）擴(kuò)增，獲得大小約3 408 bp的片段，膠回收后克隆至pMD18-T載體，選取陽性克隆送至Invitrogen公司測序。

表1　本文所用引物Table 1 Primers used in this study

1.6重組病毒在CEFs細(xì)胞中的拯救

用堿裂解法分別提取 pDEV-vac、pDEV-EF1和pDEV-VP2質(zhì)粒，根據(jù)Promega磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染 CEFs，于 37℃ 5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)，待出現(xiàn)70%—80%病變后收取病毒，拯救的病毒分別命名為rDEV-BAC、rDEV-EF1和rDEV-VP2。

為了去除 rDEV-VP2病毒基因組上的 mini-F序列，將4 μg pDEV-VP2和1 μg Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-NLS/Cre以磷酸鈣法共轉(zhuǎn)染至CEFs細(xì)胞，第二天鋪上含有1.5%甲基纖維素的DMEM培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，直至出現(xiàn)病毒蝕斑，挑取非熒光蝕斑進(jìn)行稀釋和繼代，經(jīng)過幾輪重復(fù)，直至獲得純化的非熒光蝕斑病毒。抽提病毒DNA，采用18F/15R引物對病毒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定mini-F序列是否去除。鑒定正確的病毒命名為rDEV-VP2-Cre。

1.7重組病毒的細(xì)胞增殖特性

1.7.1重組病毒蝕斑大小的測定 將105.5TCID50rDEVBAC、rDEV-EF1和rDEV-VP2病毒凍存液按照10的倍數(shù)進(jìn)行稀釋，接種于12孔板中的單層CEFs上，2 h后，換上含有1.5%甲基纖維素的DMEM培養(yǎng)基，放于CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)48 h，在熒光顯微鏡下每種病毒各拍100張蝕斑照片，用Image J軟件來測量不同病毒的蝕斑面積，計(jì)算各病毒的平均值，將rDEV-BAC蝕斑面積設(shè)成 100%，其他病毒蝕斑面積以之為標(biāo)準(zhǔn)換算成百分比。

1.7.2病毒生長曲線 以常規(guī)病毒學(xué)方法測定rDEV-BAC、rDEV-EF1和rDEV-VP2的體外增殖特性。CEFs細(xì)胞單層接種0.02MOI病毒后，依次吸附90 min，PBS（pH 7.2）洗滌2次，以冰浴的CBS緩沖液（40 mmol·L-1檸檬酸鈉、10 mmol·L-1氯化鉀、135 mmol·L-1氯化鈉，pH3.0）處理3 min，PBS（pH 7.2）洗滌2次，加入1 mL維持液繼續(xù)培養(yǎng)。接種后0、12、24、36、48、60、72 h分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞，細(xì)胞用PBS（pH 7.2）洗滌2次。收集的上清和細(xì)胞凍存于-80℃直至進(jìn)行滴度測定。分別取100 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液按照常規(guī)的方法測定TCID50，每個稀釋度重復(fù)接種3孔。計(jì)算上述各時間點(diǎn)收獲的病毒毒價(jià)，繪制病毒在體外的多步生長曲線。

1.8GPV VP2蛋白的表達(dá)分析

1.8.1間接免疫熒光檢測（IFA）蛋白表達(dá) 分別接種rDEV-VP2-Cre和對照毒株rDEV-Cre［26］于96孔板的CEFs細(xì)胞中，培養(yǎng)72 h，PBS（pH7.0）洗滌3次，用預(yù)冷的甲醇/丙酮（1∶1）固定液于-20 ℃固定 30 min，PBS-1%NP40洗滌。一抗采用小鼠抗GPV VP2多克隆抗體（1∶100），于37 ℃濕盒中孵育1 h，洗滌3次之后，滴加伊文斯蘭溶液稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶100），再次于37 ℃孵育1 h，同樣洗滌之后，堿性甘油封片，于Olympus熒光顯微鏡下觀察。

1.8.2Western blot方法檢測蛋白表達(dá) 蛋白樣品于SDS-PAGE電泳完畢，采用半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，取出PVDF膜，放入封閉液中4 ℃封閉過夜。以小鼠抗GPV VP2多克隆抗體（1:500稀釋）作為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1:5 000稀釋）作為二抗于37 ℃孵育1 h，最后用DAB顯色法進(jìn)行顯色。

1.9動物試驗(yàn)

將24只7日齡無鴨瘟抗體的雛番鴨隨機(jī)分為3組（n = 8），飼養(yǎng)于不同的房間。分別接種 1×106TCID50rDEV-EF1、1×106TCID50rDEV-VP2，并設(shè)立細(xì)胞培養(yǎng)物作為陰性對照組。免疫后1、2和3W采血，分離血清，以大腸桿菌 PET28a（+）/BL21系統(tǒng)表達(dá)，His-tag凝膠純化的GPV VP2重組蛋白為一抗、HRP標(biāo)記的抗禽IgG單克隆抗體為二抗進(jìn)行間接ELISA，測定VP2抗體水平。

2　結(jié)果

2.1pDEV-VP2突變體的鑒定

分別提取pDEV-vac、pDEV-EF1、pDEV-kanVP2 和pDEV-VP2 DNA，經(jīng)過BamH I和Xhol I酶切鑒定，電泳圖譜與預(yù)測結(jié)果基本一致（圖1），且以引物對Rec-JD-F和Rec-JD-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段測序結(jié)果也與預(yù)期一致，說明外源基因GPV VP2按照預(yù)期結(jié)果插入。

2.2重組病毒的拯救

磷酸鈣轉(zhuǎn)染細(xì)胞 48 h后熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)rDEV-BAC、rDEV-EF1和rPRV-VP2孔內(nèi)均出現(xiàn)熒光噬斑，待細(xì)胞80%以上出現(xiàn)熒光時收獲病變細(xì)胞培養(yǎng)物，即獲得拯救病毒（圖2-A-C）。

將 pDEV-VP2和 pCAGGS-NLS/Cre共轉(zhuǎn)染至CEFs細(xì)胞，經(jīng)過3輪非熒光蝕斑挑選和PCR鑒定，獲得了去除載體序列的病毒rDEV-VP2-Cre（圖2-D）。

2.3病毒蝕斑大小測定

rDEV-BAC、rDEV-EF1和rDEV-VP2感染細(xì)胞2 d后，各拍攝病毒蝕斑照片100個，并用ImageJ軟件測量各個蝕斑面積并計(jì)算平均值。將 rDEV-VP2蝕斑面積分別與rDEV-BAC和rDEV-EF1進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)rDEV-VP2蝕斑面積較rDEV-BAC增加了0.3% （P = 0.119），較rDEV-EF1減少了12.2%（P =0.061）（圖3），差異不顯著，表明VP2基因的插入，對鴨瘟病毒細(xì)胞間感染能力無顯著影響。

圖1　重組克隆pDEV-VP2的BamH I和Xhol I酶切鑒定Fig.1 Indentification of pDEV-VP2 by BamH I and Xhol I digestion

圖2　拯救重組病毒Fig.2 Rescued recombinant viruses （100×）

圖3　rDEV-BAC、rDEV-EF1和rDEV-VP2在CEFs上的蝕斑面積測定及比較Fig.3 Plaque area measurement of rDEV-BAC，rDEV-EF1 and rDEV-VP2 on CEFs

2.4重組病毒的體外增殖特性

測定重組病毒 rDEV-VP2的生長曲線，并與rDEV-BAC和rDEV-EF1進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4所示，rDEV-VP2在細(xì)胞內(nèi)的滴度從12 h到72 h穩(wěn)步增加，并于60 h達(dá)到最高，12 h到 48 h之內(nèi)病毒滴度較rDEV-EF1和rDEV-BAC稍有降低，而60 h時高于后兩者。對36 h和60 h病毒滴度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明rDEV-VP2較rDEV-BAC（P = 0.105，P = 0.100）和rDEV-EF1（P = 0.100，P = 0.080）的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rDEV-VP2病毒在上清中的滴度，從12 h到72 h穩(wěn)步增加，與對照rDEV-BAC和rDEV-EF1無明顯差異，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明該結(jié)論具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

圖4　rDEV-BAC、rDEV-EF1和rDEV-VP2在CEFs細(xì)胞上的體外生長曲線Fig.4 Multi-step growth curves of rDEV-BAC，rDEV-EF1 and rDEV-VP2

2.5外源蛋白VP2表達(dá)分析

將rDEV-VP2-Cre和對照rDEV-Cre感染CEFs，以鼠抗GPV VP2多抗為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行間接免疫熒光檢測，結(jié)果表明rDEV-VP2-Cre感染細(xì)胞中檢測出特異的綠色熒光（圖5 A），而對照病毒感染細(xì)胞呈陰性（圖5 B），表明VP2蛋白在重組病毒感染細(xì)胞中獲得了表達(dá)。

圖5　IFA檢測重組病毒rDEV-VP2-Cre感染細(xì)胞中蛋白表達(dá)Fig.5 Detection of VP2 expression in rDEV-VP2-Cre -infected cells by IFA

Western blot檢測結(jié)果顯示rDEV-VP2和rDEVVP2-Cre感染的細(xì)胞樣品較rDEV-EF1感染的細(xì)胞樣品在72 kD處有一條特異性條帶，與預(yù)期蛋白大小一致（圖6），說明VP2蛋白獲得了有效表達(dá)。

2.6重組病毒接種鴨抗體生成情況

為了明確重組病毒rDEV-VP2感染鴨是否能產(chǎn)生針對VP2蛋白的抗體，3組7日齡雛番鴨均于免疫后1W、2 W和3 W采血檢測GPV VP2抗體，rDEV-VP2重組病毒免疫抗體陽轉(zhuǎn)率分別為1/8、3/8 和4/8，而rDEV-EF1組和細(xì)胞培養(yǎng)液組VP2抗體均為陰性。

圖6　Western blot檢測病毒感染細(xì)胞中VP2的表達(dá)Fig.6 Detection of VP2 expression in rDEV-VP2 -infected cells by Western blot

3　討論

鴨瘟病毒和鵝細(xì)小病毒（GPV）可以引起番鴨、鵝小鵝瘟、鴨和半番鴨“喙萎縮綜合征”，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的危害。VP2是GPV的主要結(jié)構(gòu)蛋白和保護(hù)性抗原，是目前GPV疫苗亞單位疫苗研究的主要候選基因之一［29］。因此，用鴨瘟病毒疫苗株為活載體來表達(dá)GPV VP2基因，構(gòu)建rDEV-VP2研制小鵝瘟-鴨瘟活載體疫苗具有重要實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

構(gòu)建表達(dá)載體存在兩方面的難題：一是將目的基因插入到病毒載體基因組；二是插入基因是否可以在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)。本文是在鴨瘟病毒疫苗株全基因組感染性克隆基礎(chǔ)上，采用“Red E/T”兩步重組法對基因組進(jìn)行基因替換、外源基因插入等序列修飾，該技術(shù)不需要特定的酶切位點(diǎn)，僅需35—50 bp堿基序列作為同源臂，從而實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物或寡核苷酸可以直接作為供體分子對目標(biāo)DNA進(jìn)行打靶修飾。“Red E/T”兩步重組技術(shù)不僅簡化了同源重組的操作過程，也提高了重組的效率，同時，因?yàn)橥幢鄄皇軌A基序列的組成限制，可以人為隨意選擇，所以運(yùn)用該技術(shù)可以方便地對各種DNA分子尤其是基因組或染色體大分子進(jìn)行修飾。該技術(shù)不僅操作簡單、省時、省力，而且可以精準(zhǔn)地在全長感染性克隆的基礎(chǔ)上進(jìn)行序列修飾［30-31］。

rDEV-VP2與rDEV-BAC毒株相比，其蝕斑面積和生長曲線皆無顯著差異，說明外源基因VP2的插入不影響DEV病毒在CEFs細(xì)胞上的增殖特性。本試驗(yàn)中，IFA和Western blot結(jié)果皆表明VP2獲得了表達(dá)，但Western blot分析顯示VP2蛋白分子量約72 kD。根據(jù)ORF推測，GPV VP2分子量為61 kD，但李茂祥等的研究表明VP2分子量位于60—72 kD之間［32］，JU等用桿狀病毒表達(dá)的GPV VP2其分子量為75 kD［29］，與筆者獲得的72 kD大小相近。對VP2 氨基酸序列的糖基化、乙酰化、磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明VP2序列上存在上述位點(diǎn)，說明VP2蛋白存在不同程度的翻譯后修飾。對照野生型鵝細(xì)小病毒 VP2蛋白分子量與本試驗(yàn)結(jié)果的一致更驗(yàn)證了筆者的分析。VP2插入不影響病毒增殖特性以及VP2蛋白在DEV病毒載體中成功表達(dá)，為動物試驗(yàn)誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生提供了保證。

體液免疫在抵抗小鵝瘟病毒感染過程中發(fā)揮著主要作用。經(jīng)過GPV感染康復(fù)的雛鵝以及曾經(jīng)隱性感染的成年鵝，均能產(chǎn)生高水平的抗體，并持續(xù)較長時間，而且能將抗體通過卵黃傳給后代，使孵出的雛鵝獲得抵抗GPV感染的能力。通過免疫母鵝或用高免血清注射雛鵝都對此病有預(yù)防作用［33］。JU等利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中分別表達(dá)了GPV 結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3，它們皆能自組裝成病毒樣顆粒（VLPs），且具有良好的免疫原性［29］。LEE等利用昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)GPV VP2，加以佐劑免疫9日齡鴨，首次免疫后14d進(jìn)行二次免疫，能產(chǎn)生良好的抗體應(yīng)答［34］。CHEN等同樣利用昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了密碼子優(yōu)化的GPV VP2基因，VP2能組裝成VLPs，且VLPs保持了良好的免疫原性和免疫反應(yīng)原性［35］。筆者的研究表明rDEV-VP2感染雛番鴨能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對VP2蛋白的特異性抗體，推測其對小鵝瘟具有免疫保護(hù)能力。本研究是在鴨瘟病毒疫苗株BAC基礎(chǔ)上開展，具有良好的安全性，且由該 BAC拯救出來的病毒rDEV-BAC和rDEV-Cre兩病毒株皆對鴨瘟強(qiáng)毒株的攻擊具有100%保護(hù)作用［26］，推測本研究構(gòu)建的重組病毒也具有保護(hù)鴨瘟強(qiáng)毒株攻擊的能力，但攻毒保護(hù)試驗(yàn)有待進(jìn)一步研究。

4　結(jié)論

成功構(gòu)建了表達(dá)鵝細(xì)小病毒VP2蛋白的重組鴨瘟病毒。該重組病毒細(xì)胞生長特性與親本毒株基本一致，且重組病毒在感染細(xì)胞中能表達(dá)外源蛋白VP2，接種雛番鴨能誘導(dǎo)VP2特異性抗體生成，具有研制小鵝瘟-鴨瘟二聯(lián)活載體疫苗的潛力。

References

［1］ 韋平. 重要動物病毒分子生物學(xué). 北京: 科學(xué)出版社，2008: 501-516. WEI P. Molecular Biology of Important Animal Virus. Beijing: Science Press，2008: 501-516. （in Chinese）

［2］ 劉光清. 動物病毒反向遺傳學(xué). 2版. 北京: 科學(xué)出版社，2014: 493-536. LIU G Q. Reverse Genetics of Animal Virus. 2nd edition. Beijing: Science Press，2014: 493-536. （in Chinese）

［3］ DARTEIL R，BUBLOT M，LAPLACE E，BOUQUET J F，AUDONNET J C，RIVIèRE M. Herpesvirus of turkey recombinant viruses expressing infectious bursal disease virus （IBDV） VP2 immunogen induce protection against an IBDV virulent challenge in chickens. Virology，1995，211（2）: 481-490.

［4］ LIU S，SUN W，CHU J，HUANG X，WU Z，YAN M，ZHANG Q，ZHAO P，IGIETSEME JU，BLACK CM，HE C，LI Y. Construction of recombinant HVT expressing PmpD，and immunological evaluation against Chlamydia psittaci and Marek's Disease Virus. PLoS One，2015，10（4）: e0124992.

［5］ KAPCZYNSKI D R，ESAKI M，DORSEY K M，JIANG H，JACKWOOD M，MORAES M，GARDIN Y. Vaccine protection of chickens against antigenically diverse H5 highly pathogenic avian influenza isolates with a live HVT vector vaccine expressing the influenza hemagglutinin gene derived from a clade 2. 2 avian influenza virus. Vaccine，2015，33（9）: 1197-1205.

［6］ KLINGBEIL K，LANGE E，TEIFKE J P，METTENLEITER T C，F(xiàn)UCHS W. Immunization of pigs with an attenuated pseudorabies virus recombinant expressing the haemagglutinin of pandemic swine origin H1N1 influenza A virus. Journal of General Virology，2014，95（Pt 4）: 948-959.

［7］ 鄧曉輝，陳柳，葉偉成，李軍星，崔尚金，余斌，云濤，崔言順，孫元，仇華吉，張帥，張存. 共表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2蛋白和豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的重組偽狂犬病毒的構(gòu)建及其鑒定. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，34（4）: 251-256. DENG X H，CHEN L，YE W C，LI J X，CUI S J，YU B，YUN T，CUIY S，SUN Y，QIU H J，ZHANG S，ZHANG C. Construction and characterization of a recombinant pseudorabies virus expressing VP2 of porcine parvovirus and Cap of porcine circovirus type 2. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，2012，34（4）: 251-256. （in Chinese）

［8］ GIMENO I M，CORTES A L，F(xiàn)AIZ N M，HERNANDEZ-ORTIZ B A，GUY J S，HUNT H D，SILVA R F. Evaluation of the protection efficacy of a serotype 1 Marek's disease virus-vectored bivalent vaccine against infectious laryngotracheitis and Marek's disease. Avian Diseases，2015，59（2）: 255-262.

［9］ ZHANG Z，MA C，ZHAO P，DUAN L，CHEN W，ZHANG F，CUI Z. Construction of recombinant Marek's disease virus （rMDV） coexpressing AIV-H9N2-NA and NDV-F genes under control of MDV's own bi-directional promoter. PLoS One，2014，9（3）: e9067.

［10］ SAID A，LANGE E，BEER M，DAMIANI A，OSTERRIEDER N. Recombinant equine herpesvirus 1 （EHV-1） vaccine protects pigs against challenge with influenza A（H1N1）pmd09. Virus Research，173（2）: 371-376.

［11］ SAID A，DAMIANI A，MA G，KALTHOFF D，BEER M，OSTERRIEDER N. An equine herpesvirus 1 （EHV-1） vectored H1 vaccine protects against challenge with swine-origin influenza virus H1N1. Veterinary Microbiology，2011，154（1-2）: 113-123.

［12］ VAN DE WALLE G R，MAY M A，PETERS S T，METZGER S M，ROSAS C T，OSTERRIEDER N. A vectored equine herpesvirus type 1 （EHV-1） vaccine elicits protective immune responses against EHV-1 and H3N8 equine influenza virus. Vaccine，2010，28（4）: 1048-1055.

［13］ REN X G，XUE F，ZHU Y M，TONG G Z，WANG Y H，F(xiàn)ENG J K，SHI H F，GAO Y R. Construction of a recombinant BHV-1 expressing the VP1 gene of foot and mouth disease virus and its immunogenicity in a rabbit model. Biotechnology Letters，2009，31（8）: 1159-1165.

［14］ SCHRIJVER R S，LANGEDIJK J P，KEIL G M，MIDDEL W G，MARIS-VELDHUIS M，VAN OIRSCHOT J T，RIJSEWIJK F A. Immunization of cattle with a BHV1 vector vaccine or a DNA vaccine both coding for the G protein of BRSV. Vaccine，1997，15（17-18）: 1908-1916.

［15］ DONOFRIO G，CAVIRANI S，SIMONE T，VAN SANTEN V L. Potential of bovine herpesvirus 4 as a gene delivery vector. Journal of Virological Methods，2002，101（1-2）: 49-61.

［16］ CAPOCEFALO A，MANGIA C，F(xiàn)RANCESCHI V，JACCA S，VAN SANTEN V L，DONOFRIO G. Efficient heterologous antigen gene delivery and expression by a replication-attenuated BoHV-4-based vaccine vector. Vaccine，2013，31（37）: 3906-3914.

［17］ DONOFRIO G，F(xiàn)RANCESCHI V，LOVERO A，CAPOCEFALO A，CAMERO M，LOSURDO M，CAVIRANI S，MARINARO M，GRANDOLFO E，BUONAVOGLIA C，TEMPESTA M. Clinical protection of goats against CpHV-1 induced genital disease with a BoHV-4-based vector expressing CpHV-1 gD. PLoS One，2013，8（1）: e52758.

［18］ LI Y，HUANG B，MA X，WU J，LI F，AI W，SONG M，YANG H. Molecularcharacterization of the genome of duck enteritis virus. Virology，2009，391: 151-161.

［19］ WANG J，OSTERRIEDER N. Generation of an infectious clone of duck enteritis virus （DEV） and of a vectored DEV expressing hemagglutinin of H5N1 avian influenza virus. Virus Research，2011，159（1）: 23-31.

［20］ CHEN L，YU B，HUA J，YE W，NI Z，YUN T，DENG X，ZHANG C. Construction of a full-length infectious bacterial artificial chromosome clone of duck enteritis virus vaccine strain. Virology Journal，2013，10: 328.

［21］ WANG J，GE A，XU M，WANG Z，QIAO Y，GU Y，LIU C，LIU Y，HOU J. Construction of a recombinant duck enteritis virus （DEV）expressing hemagglutinin of H5N1 avian influenza virus based on an infectious clone of DEV vaccine strain and evaluation of its efficacy in ducks and chickens. Virology Journal，2015，12: 126.

［22］ ZOU Z，HU Y，LIU Z，ZHONG W，CAO H，CHEN H，JIN M. Efficient strategy for constructing duckenteritisvirus-based live attenuated vaccine against homologous and heterologous H5N1 avian influenza virus and duckenteritisvirus infection. Veterinary Microbiology，2015，46: 42.

［23］ LIU J，CHEN P，JIANG Y，WU L，ZENG X，TIAN G，GE J，KAWAOKA Y，BU Z，CHEN H. A duck enteritis virus-vectored bivalent live vaccine provides fast and complete protection against H5N1 avian influenza virus infection in ducks. Journal of Virology，2011，85（21）: 10989-10998.

［24］ LIU J，CHEN P，JIANG Y，DENG G，SHI J，WU L，LIN Y，BU Z，CHEN H. Recombinant duck enteritis virus works as a single-dose vaccine in broilers providing rapid protection against H5N1 influenza infection. Antiviral Research，2013，97（3）: 329-333.

［25］ LIU X，WEI S，LIU Y，F(xiàn)U P，GAO M，MU X，LIU H，XING M，MA B，WANG J. Recombinant duck enteritis virus expressing the HA gene from goose H5 subtype avian influenza virus. Vaccine，2013，31（50）: 5953-5959.

［26］ CHEN P，LIU J，JIANG Y，ZHAO Y，LI Q，WU L，HE X，CHEN H. The vaccine efficacy of recombinant duck enteritis virus expressing secreted E with or without PrM proteins of duck tembusu virus. Vaccine，2014，32（41）: 5271-5277.

［27］ ZOU Z，LIU Z，JIN M. Efficient strategy to generate a vectored duck enteritis virus delivering envelope of duck Tembusu virus. Viruses，2014，6（6）: 2428-2443.

［28］ 陳柳，余斌，倪征，華炯鋼，葉偉成，云濤，張存. 表達(dá)鴨坦布蘇病毒 E蛋白的重組鴨瘟病毒的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，27（11）: 1889-1895. CHEN L，YU B，NI Z，HUA J，YE W，YUN T，ZHANG C. Construction and characterization of a recombinant duck enteritis virus expressing E protein of duck Tembusu virus. Acta Agriculturae Zhejiangensis，2015，27（11）: 1889-1895. （in Chinese）

［29］ JU H，WEI N，WANG Q，WANG C，JING Z，GUO L，LIU D，GAO M，MA B，WANG J. Goose parvovirus structural proteins expressed by recombinant baculoviruses self-assemble into virus-like particles with strong immunogenicity in goose. Biochemicaland Biophysical Research Communications，2011，409（1）: 131-136.

［30］ TISCHER B K，VON EINEM J，KAUFER B，OSTERRIEDER N. Two-step red-mediated recombination for versatile high-efficiency markerless DNA manipulation in Escherichia coli. Biotechniques，2006，40（2）: 191-197.

［31］ TISCHER B K，SMITH G A，OSTERRIEDER N. En passant mutagenesis: a two step markerless red recombination system. Methods Molecular Biology，2010，634: 421-430.

［32］ 李茂祥，李俊寶，鄭玉美. 小鵝瘟病毒純化及其理化特性的研究.病毒學(xué)報(bào)，1990，6（2）: 155-159. LI M X，LI J B，ZHENG Y M. Purification and physico-chemical characteristics of a goslin plaque virus. Chinese Journal of Virology，1990，6（2）: 155-159. （in Chinese）

［33］ 殷震. 動物病毒學(xué). 2版. 北京: 科學(xué)出版社，1997: 1165-1168. YIN Z. Aminal Virology. 2nd edition. Beijing: Science Press，1997: 1165-1168. （in Chinese）

［34］ LEE J W，LIN Y M，YEN T Y，YANG W J，CHU C Y. CpG oligodeoxynucleotides containing GACGTT motifs enhance the immuneresponses elicited by a goose parvovirus vaccine inducks. Vaccine，2010，28: 7956-7962.

［35］ CHEN Z，LI C，ZHU Y，WANG B，MENG C，LIU G. Immunogenicity of virus-like particles containing modified goose parvovirus VP2protein. Virus Research，2012，169: 306- 309.

（責(zé)任編輯 林鑒非）

Construction and Characterization of a Recombinant Duck Enteritis Virus Expressing VP2 Gene of Goose Parvovirus

CHEN Liu，YU Bin，NI Zheng，HUA Jiong-gang，YE Wei-cheng，YUN Tao，ZHANG Cun
（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021）

【Objective】Duck enteritis virus （DEV） and goose parvovirus （GPV） are considered to be two of the most important and widespread viruses infecting ducklings，Muscovy ducklings and goslings. According to the most recent virus taxonomy reported in 2012 by the International Committee on Taxonomy of Viruses （ICTV），DEV （also referred to Anatid herpesvirus 1） is classifiedinto the genus Mardivirus，the subfamily Alphaherpesvirinae of Herpesviridae. Many herpesviruses，such as Pseudorabies virus （PRV），Marek's disease virus （MDV），Herpesvirus of turkey（HVT）have been widely made as live viral vector for the expression of foreign antigens，and there were some reports about DEV as live viral vector in recent years. To control DEV and GPV infection，a recombinant vectored DEV expressing GPV VP2 was constructed in this study based on the bacterial artificial chromosome （BAC）clone pDEV-EF1 which carries DEV full-length genome （Chen L，et al. ，2015），and then the biological characteristics of the obtained recombinant virus rDEV-VP2 were analyzed to explore the possibility of rDEV-VP2 as duplex live carrier vaccine. 【Method】 The recombinant BAC clone pDEV-VP2 carrying GPV VP2 gene was generated by two-step Red/ET recombination in E. coli. pDEV-VP2 was constructed by inserting codon optimized-GPV VP2 expression cassette between DEV US7 and US8 genes on pDEV-EF1. The recombinant viruses rDEV-VP2 and rDEV-VP2-Cre without BAC sequence were rescued from chicken embryo fibroblasts （CEFs） by calcium phosphate precipitation. And the growth curve in vitro，plaque size and expression of GPV VP2 in CEFs were analyzed. The antibody level of GPV VP2 in sera of rDEV-VP2-incoculated ducklings was detected by an indirect-ELISA method based on the GPV VP2 protein. 【Result】 The recombinant viruses rDEV-VP2 and rDEV-VP2-Cre were rescued from chicken embryo fibroblasts （CEFs） by calcium phosphate precipitation. Growth curves show that the growth kinetics of rDEV-VP2 was basically consistent with those of parental virus in vitro. And the plaque size of rDEV-VP2 was slightly increased compared to the parental virus rDEV-BAC. Immunofluorescence assay and Western blot analysis showed that GPV VP2 protein is expressed in recombinant virus-infected CEFs. And the rDEV-VP2 infection could induce 7-day-old Muscovy ducklings to produce antibody specific for GPV VP2. 【Conclusion】 In this study，the antigen gene VP2 of GPV was inserted into the genome of DEV US7 and US8，and an recombinant infectious BAC clone of DEV was successfully constructed. Then the corresponding recombinant virus rDEV-VP2 was rescued，and its cellular growth characteristics were basically consistent with those of parental virus，and rDEV-VP2 could induce Muscovy ducklings to produce VP2-specific antibody. These studies have laid a foundation for developing bivalent vaccine controlling DEV and GPV infection.

duck enteritis virus； goose parvovirus； VP2； recombinant virus

2016-02-19；接受日期：2016-07-12

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目優(yōu)先主題重點(diǎn)國際科技合作合作研究項(xiàng)目（2011C14011）、浙江省自然科學(xué)基金（LY15C180002）和浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究項(xiàng)目（2016C32070）

聯(lián)系方式：陳柳，Tel：0571-86404257；E-mail：haoliuzi@126.com。通信作者張存，Tel：0571-86404182；E-mail：zhangcun@aliyun.com