趙丹丹，楊國(guó)平，刁有祥，陳 浩，提金鳳，張 璐，張 英，李川川

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271000）

鴨瘟病毒單抗的制備及膠體金試紙條檢測(cè)方法的建立

趙丹丹，楊國(guó)平，刁有祥，陳 浩，提金鳳，張 璐，張 英，李川川

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271000）

【目的】鴨瘟（DP）是由鴨瘟病毒（DPV）引起的一種急性、敗血性傳染病，以頭頸腫脹、食道黏膜和泄殖腔黏膜出血、黃白色潰瘍，頭頸部皮下有黃白色膠凍樣滲出為特征。該病一旦發(fā)生，發(fā)病急、死亡快、死亡率高，對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)危害嚴(yán)重?？焖僭\斷是控制鴨瘟的重要措施之一，可以及時(shí)確定病原，以便采取有效的防制手段。試驗(yàn)旨在建立鴨瘟病毒（DPV）膠體金快速檢測(cè)方法?！痉椒ā坷蒙飳W(xué)軟件Protean分析，選擇鴨瘟病毒抗原表位較多的一段序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增目的基因。連接到載體pMD-18T上，測(cè)序正確后再連接到原核表達(dá)載體pET-28a上。將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)的蛋白經(jīng)純化后測(cè)其濃度并經(jīng)Western blotting鑒定分析。以表達(dá)的DPV-gB蛋白作為抗原，免疫7周齡BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)間接ELISA篩選及亞克隆，獲得DPV-gB特異性單克隆抗體。采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，以制備的 H6F6單抗作為標(biāo)記抗體（標(biāo)記的最適pH為8.0—8.5，最佳標(biāo)記濃度為15倍原液稀釋?zhuān)?，將純化的A8D7單抗（濃度為2倍原液稀釋?zhuān)┖脱蚩故驣gG（濃度為10倍稀釋?zhuān)┌辉谙跛崂w維素膜（NC）上，分別作為檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，經(jīng)條件優(yōu)化建立了鴨瘟病毒膠體金試紙條檢測(cè)方法?！窘Y(jié)果】共獲得4株能穩(wěn)定分泌抗DPV-gB蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為A8D7、E6C3、H11F8、H6F6。間接ELISA檢測(cè)腹水效價(jià)分別為1∶103、1∶103、1∶105、1∶103。亞類(lèi)鑒定結(jié)果分別為IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1，輕鏈均為kappa鏈。Western blotting結(jié)果顯示4株單抗均能與DPV-gB蛋白特異性結(jié)合。IFA結(jié)果顯示制備的4株單抗是針對(duì)DPV產(chǎn)生的。建立的膠體金試紙條方法能夠特異性地檢測(cè)鴨瘟病毒，與鴨坦布蘇病毒、H9N2亞型禽流感病毒、呼腸孤病毒、減蛋綜合征病毒無(wú)反應(yīng)。陽(yáng)性尿囊液稀釋50倍后用該試紙條檢測(cè)依然為陽(yáng)性；用不同批次的試紙條重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果無(wú)差異。利用制備的膠體金試紙條和PCR方法對(duì)38份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)比較，結(jié)果顯示兩者符合率為91.6 % 。【結(jié)論】本研究建立的試紙條檢測(cè)方法具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，可用于DPV的快速檢測(cè)。

鴨瘟病毒；gB蛋白；原核表達(dá)；單克隆抗體；膠體金試紙條

0　引言

【研究意義】鴨瘟（duck plague，DP）是由鴨瘟病毒（duck plague virus，DPV）引起的一種急性、敗血性傳染病［1］，以頭頸腫脹、食道黏膜和泄殖腔黏膜出血、頭頸部皮下有淡黃色膠凍樣滲出為特征。該病一旦發(fā)生，發(fā)病急、死亡快、死亡率高，對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)危害嚴(yán)重?？焖僭\斷是控制鴨瘟的重要措施之一，可以及時(shí)確定病原，以便采取有效防制手段?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前已建立了PCR、ELISA、間接免疫熒光技術(shù)、微量中和試驗(yàn)等檢測(cè)鴨瘟的方法［2］，但上述檢測(cè)方法均需特殊的儀器設(shè)備，且耗時(shí)長(zhǎng)，不適于在基層推廣應(yīng)用。膠體金免疫層析技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的集膠體金標(biāo)記技術(shù)、蛋白層析技術(shù)于一體的新型快速免疫檢測(cè)技術(shù)［3-4］。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短，不需要特殊的儀器設(shè)備［5-6］，特別適合在基層推廣應(yīng)用［7-8］。【本研究切入點(diǎn)】鴨瘟對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)危害嚴(yán)重，目前已建立了PCR、ELISA、間接免疫熒光技術(shù)、微量中和試驗(yàn)等檢測(cè)鴨瘟的方法，但上述檢測(cè)方法均需特殊的儀器設(shè)備，且耗時(shí)長(zhǎng)，不適于在基層推廣應(yīng)用。膠體金免疫層析技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的集膠體金標(biāo)記技術(shù)、蛋白層析技術(shù)于一體的新型快速免疫檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短，不需要特殊的儀器設(shè)備，特別適合在基層推廣應(yīng)用。且目前關(guān)于鴨瘟病毒膠體金試紙條檢測(cè)方法的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究意義較大?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】原核表達(dá)DPV-gB蛋白，制備抗DPV-gB蛋白單克隆抗體，從中選取2株單抗分別用于膠體金的標(biāo)記及檢測(cè)線(xiàn)的包被，采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，建立鴨瘟病毒膠體金試紙條檢測(cè)方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株、細(xì)胞株和試驗(yàn)動(dòng)物 鴨瘟病毒（SD-Y）、鴨呼腸孤病毒（DRV）、減蛋綜合征病毒（EDS-76V）、H9亞型禽流感病毒（AIV-H9N2）、坦布蘇病毒（TMUV）由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病學(xué)研究室分離并保存。SP2/0骨髓瘤細(xì)胞由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病學(xué)研究室保存；6～8周齡SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠購(gòu)自山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2主要試劑 原核表達(dá)載體 pET-28a、大腸桿菌DH5α和Rosetta由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病學(xué)研究室保存；DNA 凝膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶、IPTG、pMD18-T 載體等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT、HT、PEG4000購(gòu)自Sigma公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、HRP標(biāo)記的羊抗鴨IgG、FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自全式金生物技術(shù)（北京）有限公司；Rapid Mouse Isotyping Kit-Gold Series購(gòu) 自RayBiotech；氯金酸（HAuCl4·3H2O）、二氯二甲基硅烷、正辛酸購(gòu)自Aladdin公司；牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；膠體金卡式套裝系列購(gòu)自上海杰一生物技術(shù)有限公司；超敏性辣根過(guò)氧化物酶 DAB顯色試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。其他試劑均為分析純。

1.1.3試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn) 2012年10月至2015年3月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病學(xué)研究室完成。

1.2DPV-gB蛋白的制備及純化

根據(jù)GenBank發(fā)表的DPV gB基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上游為gB-f ：5′-CCGGAATTCTGGGATTG GATGCCTAA-3′，含有EcoR1酶切位點(diǎn)；下游為gB-r：5′-CCGCTCGAGTATTGTACCGCCGTCTTT-3′，含有XhoL1酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增gB，回收目的基因，將其連接到 pMD-18T載體上，鑒定正確后再經(jīng)雙酶切、與pET-28a載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-gB。

將重組質(zhì)粒pET-28a-gB轉(zhuǎn)化入Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)gB蛋白。按文獻(xiàn)［9］介紹的方法純化表達(dá)的蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE及Western blotting分析。

1.3DPV-gB蛋白單抗的制備

按照常規(guī)方法進(jìn)行動(dòng)物免疫［10］。三免后14 d，尾靜脈采血，間接ELISA測(cè)定血清效價(jià)。選擇效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，采用gB蛋白腹腔注射，80 μg/只。注射后第3天，進(jìn)行細(xì)胞融合。

按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合［11］。采用間接ELISA對(duì)雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。陽(yáng)性孔再經(jīng)過(guò)3次有限稀釋法進(jìn)行亞克?。?2］，待陽(yáng)性率達(dá)到 100%時(shí)擴(kuò)大培養(yǎng)，用于制備腹水，并保存于液氮。參照文獻(xiàn)［13］進(jìn)行腹水的制備，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，離心取上清。

1.4單抗的鑒定

1.4.1單抗的純化及亞類(lèi)的鑒定 將制備的腹水從1∶100開(kāi)始做倍比稀釋?zhuān)捎瞄g接ELISA方法檢測(cè)腹水效價(jià)。利用HiTrapTMProtein G 親和層析柱純化腹水，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析；同時(shí)利用紫外分光光度法測(cè)定 260 nm和 280 nm的吸光值 A260和A280，按照蛋白質(zhì)濃度=1.45×A280-0.74×A260公式計(jì)算抗體濃度。

按照Rapid Mouse Isotyping Kit-Gold Series說(shuō)明書(shū)對(duì)單抗的亞類(lèi)進(jìn)行鑒定。

1.4.2Western blotting 鑒定 將純化的 gB蛋白和含 pET28a 空質(zhì)粒的菌體蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂乳封閉過(guò)夜，以陽(yáng)性單克隆細(xì)胞上清為一抗，二抗為 HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶5 000稀釋?zhuān)?，DAB 試劑盒顯色，進(jìn)行Western blotting鑒定［14］。

1.4.3間接免疫熒光（IFA）鑒定 按照常規(guī)方法［15］制備鴨胚成纖維細(xì)胞（DEF），傳代后將其轉(zhuǎn)到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)成單層，且面積為底部面積的70 %—80 %時(shí)，用DPV感染DEF細(xì)胞，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。待出現(xiàn)細(xì)胞病變后，用丙酮與甲醇按照1∶1的體積比進(jìn)行固定，以鑒定為陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞上清為一抗，二抗為FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（1∶200稀釋?zhuān)?，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4.4單抗的特異性 分別用 DPV、TMUV、AIVH9N2、EDS-76V、DRV作為抗原包被酶標(biāo)板，一抗為雜交瘤細(xì)胞上清液，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG （1∶5 000稀釋?zhuān)?，利用間接ELISA方法檢測(cè)單克隆抗體細(xì)胞上清。

1.4.5單抗的穩(wěn)定性 在雜交瘤細(xì)胞凍存3個(gè)月、6個(gè)月時(shí)，取出凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，并對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，以檢測(cè)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性。

1.5膠體金試紙條的研制

1.5.1標(biāo)記條件的確定 利用棋盤(pán)法［16-17］將溶液的pH分別調(diào)為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0，以確定膠體金標(biāo)記抗體的最適pH；用0.01 mol·L-1PB （pH 7.0）將單抗按照1 mL膠體金標(biāo)記抗體的量分別為30、35、40、45、50、55和60 μg，以確定抗體最適標(biāo)記量。

1.5.2膠體金探針的制備 采用檸檬酸三鈉還原法［18-19］制備粒徑約為30 nm的膠體金顆粒，以制備的一株單克隆抗體H6F6標(biāo)記膠體金，采用差速離心法［20］對(duì)膠體金探針進(jìn)行純化。

1.5.3試紙條的組裝 將制備的另一株單克隆抗體A8D7和羊抗鼠IgG包被于硝酸纖維素膜（NC膜）上，分別作為檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，按照膠體金試紙條常規(guī)構(gòu)造，在PVC底板上按照NC膜、金標(biāo)墊、樣品墊和吸水墊的順序粘貼［21］，組裝試紙條，優(yōu)化反應(yīng)條件，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6試紙條性能的評(píng)價(jià)

1.6.1特異性試驗(yàn) 用制備的膠體金試紙條分別檢測(cè)DPV、TMUV、AIV- H9N2、EDS-76V、DRV，觀察是否出現(xiàn)交叉反應(yīng)。

1.6.2敏感性試驗(yàn) 將半數(shù)致死量為 10-4.33的 DPV陽(yáng)性尿囊液分別按照1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶500稀釋?zhuān)^察試紙條檢測(cè)結(jié)果。

1.6.3重復(fù)性試驗(yàn) 用前后制備的 3個(gè)批次的試紙條對(duì)陽(yáng)性鴨瘟病毒尿囊液進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證試紙條檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性。

1.6.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 每隔一個(gè)月用保存的試紙條對(duì)陽(yáng)性鴨瘟病毒尿囊液進(jìn)行檢測(cè)，觀察其檢測(cè)結(jié)果是否穩(wěn)定。

1.6.5試紙條的初步應(yīng)用 對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的24份疑似感染鴨瘟病毒的臨床樣品和 14份陽(yáng)性尿囊液分別進(jìn)行試紙條和PCR檢測(cè)，驗(yàn)證二者的符合率。

2　結(jié)果

2.1DPV-gB蛋白單抗的制備

2.1.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 PCR擴(kuò)增gB基因后進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果顯示，在915 bp處可見(jiàn)到特異性條帶（圖1）。

圖1　重組表達(dá)載體的PCR鑒定Fig.1 The PCR identification of recombinant expression vector

2.1.2gB蛋白的純化與鑒定 將表達(dá)及純化后的蛋白經(jīng) SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)印到NC膜上，用鴨瘟陽(yáng)性血清進(jìn)行 Western blotting 鑒定。結(jié)果顯示，表達(dá)的蛋白在約34kD處可見(jiàn)特異性條帶，而菌體蛋白無(wú)條帶（圖2）。

圖2　誘導(dǎo)表達(dá)DPV-gB蛋白SDS-PAGE及Western blotting分析Fig.2 SDS-PAGE（A）and Western blotting（B）analysis of DPV-gB protein

2.1.3陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選 細(xì)胞融合后觀察，細(xì)胞融合率達(dá)90%以上，經(jīng)間接ELISA檢測(cè)及有限稀釋法克隆至陽(yáng)性率達(dá)100%，共獲得4株穩(wěn)定分泌抗gB蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為 A8D7，E6C3，H11F8，H6F6。

2.1.4單抗效價(jià)的測(cè)定 間接ELISA方法測(cè)定腹水的效價(jià)分別為 A8D7（1∶103）、E6C3（1∶103）、H11F8（1∶105）、H6F6（1∶103）。

2.1.5單抗的純化及濃度測(cè)定 利用 HiTrapTMProtein G 親和層析柱對(duì)準(zhǔn)備試驗(yàn)的兩株腹水進(jìn)行純化，SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳結(jié)果顯示，純化的單抗有兩條明顯的重鏈和輕鏈，效果較好（圖3）。

同時(shí)，利用紫外分光光度法計(jì)算4株單抗的濃度分別為：A8D7（2.0 mg·mL-1）、E6C3（1.8 mg·mL-1）、H11F8（1.65 mg·mL-1）、H6F6（1.93 mg·mL-1）

2.1.6單抗亞類(lèi)的鑒定 獲得的 4株單抗經(jīng)亞類(lèi)鑒定分別為：A8D7（IgG2b）、E6C3（IgG2a）、H11F8（IgG2b）、H6F6（IgG1），輕鏈均為kappa鏈。

圖3　單抗的純化Fig.3 Purification of monoclonal antibodies

2.1.7Western blotting 鑒定 4株單抗均可特異性識(shí)別gB蛋白，在約34kD處出現(xiàn)特異性條帶，而不與含空質(zhì)粒表達(dá)的菌體蛋白反應(yīng)（圖4）。

圖4　4株單抗的Western blotting 分析Fig.4 Western blotting analysis of four monoclonal antibodies

2.1.8IFA鑒定結(jié)果 DPV感染DEF細(xì)胞，出現(xiàn)病變后，對(duì)4株單抗進(jìn)行IFA檢測(cè)，結(jié)果顯示，4株單抗均可顯現(xiàn)特異性的綠色熒光，未感染的細(xì)胞未顯現(xiàn)綠色熒光（圖5）。

圖5　單抗與感染的DPV的DEF細(xì)胞的IFA試驗(yàn)Fig.5 The indirect immunofluorescence assay of DPV in DEF cells with the four monoclonal antibodies

2.1.9單抗的特異性 利用間接 ELISA方法用DPV、TMUV、AIV- H9N2、EDS-76V、DRV對(duì)雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，本試驗(yàn)制備的單抗僅與DPV反應(yīng)，與TMUV、AIV- H9N2、EDS-76V、DRV不發(fā)生反應(yīng)。

2.1.10單抗的穩(wěn)定性 在雜交瘤細(xì)胞凍存后 3個(gè)月，6個(gè)月時(shí)，取出凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，并對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。結(jié)果表明，凍存后的雜交瘤細(xì)胞仍能穩(wěn)定的分泌抗體。

2.2膠體金試紙條的制備

2.2.1膠體金溶液的制備 制備的膠體金溶液肉眼觀察為酒紅色或偏紫紅色，液面上無(wú)油狀物質(zhì)。在日光下觀察，溶液為均勻的介質(zhì)，顏色清亮，靜置后底部無(wú)雜質(zhì)，無(wú)死金現(xiàn)象。

2.2.2膠體金標(biāo)記條件的確定 當(dāng)pH為8.0—8.5、1 mL膠體金溶液中單抗標(biāo)記量為50 μg時(shí)，膠體金溶液穩(wěn)定，保持紅色不變。由此確定膠體金標(biāo)記單抗的最適pH為8.0—8.5，單抗的最佳標(biāo)記量為50 μg·mL-1。

2.3試紙條性能的評(píng)價(jià)

2.3.1特異性試驗(yàn) 用膠體金試紙條分別檢測(cè)DPV、TMUV、AIV- H9N2、EDS-76V、DRV，該試紙條僅與DPV反應(yīng)，與其他病毒不發(fā)生反應(yīng)（圖6）。

圖6　特異性檢測(cè)Fig.6 Detection of specificity

2.3.2敏感性試驗(yàn) 敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，半數(shù)致死量為10-4.33的DPV陽(yáng)性尿囊液稀釋50倍后仍能用試紙條檢測(cè)出來(lái)（圖7）。

圖7　敏感性檢測(cè)Fig.7 Detection of sensitivity

2.3.3重復(fù)性試驗(yàn) 用不同批次的試紙條對(duì)DPV尿囊液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果無(wú)明顯差異，表明該試紙條具有較好的重復(fù)性。

2.3.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，研制的試紙條4℃保存5個(gè)月、室溫下保存3個(gè)月后依然有效。

2.3.5試紙條的初步應(yīng)用 用制備的膠體金免疫層析試紙條對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的 24份疑似感染鴨瘟病毒的臨床樣品和14份陽(yáng)性尿囊液進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)做PCR對(duì)照檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，其中21份臨床樣品及12份尿囊液可在1—5min內(nèi)得出檢測(cè)結(jié)果；PCR可檢測(cè)出22份臨床樣品及14份尿囊液（表1）；二者符合率為91.6 %，適用于DPV的快速檢測(cè)與篩選。

表1　比較試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Comparative experiment of the result

3　討論

3.1gB蛋白是鴨瘟病毒最為保守的囊膜蛋白之一，在促進(jìn)病毒吸附細(xì)胞及在細(xì)胞間的擴(kuò)散，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，介導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮重要作用，具有良好的免疫原性及免疫保護(hù)性［22］。本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)Rosetta E. coli，表達(dá)了鴨瘟病毒 gB蛋白，原核表達(dá)系統(tǒng)相對(duì)于真核表達(dá)系統(tǒng)具有成本低、操作簡(jiǎn)便、表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，省去了傳統(tǒng)方法中的繁瑣步驟，可大大節(jié)省時(shí)間。單克隆抗體具有高度均一、生物活性單一和與抗原結(jié)合特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)［23］，可以為建立更加快速、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法提供有利的工具。本研究利用表達(dá)的 gB蛋白免疫小鼠制備的單抗，檢測(cè)結(jié)果顯示，僅與鴨瘟病毒反應(yīng)，而與其他病毒不發(fā)生反應(yīng)，表明制備的單抗具有較高的特異性。

3.2多種因素會(huì)影響膠體金標(biāo)記的效果，如膠體金顆粒的大小、標(biāo)記蛋白的濃度、溶液的 pH值以及所用容器的純凈程度等［24-25］。膠體金顆粒的大小與制備膠體金反應(yīng)的時(shí)間及所用容器的潔凈度有較大關(guān)系。反應(yīng)時(shí)間小于5 min時(shí)，氯金酸還原不徹底，膠體金顆粒大小不一；反應(yīng)時(shí)間超過(guò) 10 min時(shí)，膠體金溶液容易形成大的顆粒甚至沉淀。同時(shí)，進(jìn)入膠體金溶液內(nèi)的污物都會(huì)干擾膠體金顆粒的生成或使生成的膠體金出現(xiàn)聚積現(xiàn)象。所以，反應(yīng)時(shí)間一般控制在5—10min，容器最好經(jīng)酸洗和硅化處理。溶液的pH可影響膠體金與單抗的結(jié)合效率，pH接近和稍高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，膠體金蛋白質(zhì)的吸附力最強(qiáng)。pH偏低破壞膠體金表面靜電荷，易導(dǎo)致膠體金發(fā)生自身聚合，出現(xiàn)變色，靜置后有肉眼可見(jiàn)的顆粒性沉淀；pH偏高時(shí)，金粒子與單抗間作用力不足，結(jié)合蛋白量少，試紙條檢測(cè)顯色明顯減弱，靈敏度降低。膠體金溶液與被標(biāo)蛋白的用量是否合適也是影響標(biāo)記成功的一個(gè)重要因素。蛋白濃度過(guò)高，造成浪費(fèi)的同時(shí)引起試紙的拖帶現(xiàn)象；蛋白濃度過(guò)低，導(dǎo)致膠體金標(biāo)記不完全，從而降低試紙條的靈敏度及假陽(yáng)性現(xiàn)象的出現(xiàn)。本研究采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，通過(guò)條件優(yōu)化，以反應(yīng)時(shí)間為 5 min、單抗標(biāo)記量為 50 μg·mL-1、溶液的pH為8.0—8.5時(shí)獲得了較好的標(biāo)記效果。

3.3對(duì)鴨瘟病料及陽(yáng)性尿囊液檢測(cè)結(jié)果顯示，膠體金試紙條檢測(cè)方法與PCR方法的陽(yáng)性符合率為91.6 %，膠體金試紙條的檢出率稍低于PCR法，但膠體金試紙條檢測(cè)方法具有檢測(cè)速度快，在10 min左右即可得到檢測(cè)結(jié)果；無(wú)需特殊儀器設(shè)備；操作簡(jiǎn)單，便于基層臨床檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。

4　結(jié)論

本研究制備的DPV-gB蛋白單克隆抗體，特異、穩(wěn)定。以此為基礎(chǔ)建立的DPV膠體金檢測(cè)方法，特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好，可用于鴨瘟的臨床快速診斷。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Preparation of Monoclonal Antibodies Against DPV and Development of Colloidal Gold Strip for DPV Detection

ZHAO Dan-dan，YANG Guo-ping，DIAO You-xiang，CHEN Hao，TI Jin-feng，ZHANG Lu，ZHANG Ying，LI Chuan-chuan
（College of Animal Science and Technology，Shandong Agricultural University，Tai’an 271000，Shandong）

【Objective】 Duck plague （DP） is an acute，septic contagion，caused by duck plague virus （DPV），with the characteristics of head and neck swelling，the mucosa of esophageal and cloacal bleeding and yellowish-white ulcer，head and neck skin has a yellowish-white gelatin sample. Once an outbreak of this disease manifested by with high morbidity and high mortality，it would cause serious harm to the duck industry. The aim of this assay is to establish a method of colloidal gold strip for the detection of duck plague virus （DPV） rapidly. 【Method】 The main antigenic domain of DPV was chosen and analyzed by using of theProtean Biology software to design a pair of primer to amplify the aim gene by PCR. Then the fragment was inserted into prokaryotic expression vector pET-28a to construct recombinant plasmid. Then it was transformed into Rosetta for expression. During the experiment，the authors have groped the concentration of the IPTG and the induction time. After purification，the concentration of the aim protein was tested and was also analyzed and identified by Western blotting. Hybridoma cell lines stably secreting monoclonal antibody against gB protein of DPV were generated by fusing SP2/0 myeloma cells with splenocytes from the immunized mice，which used the gB protein of DPV，expressed and purified with prokaryotic，as the antigen. The monoclonal antibody-based colloidal gold immunochromatography strip was developed for the detection of DPV. The purified DPV-gB monoclonal antibody，named H6F6，was labeled with colloidal gold，with the appropriate pH between 8.0 and 8.5 and the concentration was 15 times dilution. The purified A8D7 monoclonal antibody，with the concentration of twice dilution，and the goat anti-mouse immunoglobulin G （IgG）antibody，with the concentration of ten times dilution，were blotted on nitrocellulose membrane as test line and control line，respectively. 【Result】 Hybridoma cell lines designated as A8D9，E6C3，H11F8，H6A10，stably secreting monoclonal antibody against gB protein of DPV. The titres of ascitic fluid was1:103，1:103，1:105，1:103，respectively by indirect ELISA and the immunoglobulin subtype of the monoclonal antibodies was IgG2b，IgG2a，IgG2b，IgG1，with the light chain of kappa. The result of western blot showed that the four monoclonal antibodies were able to specifically recognize gB protein of DPV. The result of IFA showed that the four monoclonal antibodies were specific to DPV. The detection results indicated that the strip was specific to DPV and had no cross reaction with DRV，EDS-76V，AIV-H9N2，and TMUV. The detection limit of DPV were 50 times dilution. 38 clinical suspected samples were simultaneously detected by immunochromatography strip and PCR while the results showed 91.6 % accuracy between them. The monoclonal antibodies-based colloidal gold strip was highly specific and sensitive and more convenient for the clinical diagnosis of DPV. 【Conclusion】 The colloidal gold strip was highly specific and sensitive and more convenient for the clinical diagnosis of DPV.

duck plague virus； glycoprotein B； Prokaryotic expression； monoclonal antibody； colloidal gold strip

2015-05-13；接受日期：2016-03-10

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-43-10）

聯(lián)系方式：趙丹丹，Tel：17863963319；E-mail：zhaodandan_0925@163.com。通信作者刁有祥，Tel：13605386443；E-mail：yxdiao@163.com