穆 敏，舒 娜，王 帥，郭麗雪，樊偉麗，陰祖軍，王俊娟，王德龍，葉武威

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部棉花遺傳改良重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，河南安陽 455000）

酵母耐鹽相關(guān)基因HAL1在棉花中的功能表達(dá)

穆 敏，舒 娜，王 帥，郭麗雪，樊偉麗，陰祖軍，王俊娟，王德龍，葉武威

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部棉花遺傳改良重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，河南安陽 455000）

【目的】克隆釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）耐鹽基因HAL1（halotolerance）并轉(zhuǎn)化棉花，探究該基因在棉花中的功能，進(jìn)一步探究酵母耐鹽相關(guān)基因在高等植物中的具體功能?！痉椒ā扛鶕?jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中酵母耐鹽基因HAL1的mRNA全長序列信息，利用RT-PCR技術(shù)從釀酒酵母As2.375中克隆該基因。選擇酶切位點(diǎn)XbaI和SmaI對表達(dá)載體pBI121∶∶GFP進(jìn)行雙酶切，采用In-Fusion技術(shù)構(gòu)建pBI121-ScHAL1∶∶GFP融合表達(dá)載體。以自發(fā)熒光較弱的陸地棉品種Y-2067、ZA-23、GZ-2的花粉為材料，用基因槍轟擊棉花花粉進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)研究。采用基因槍活體轉(zhuǎn)化技術(shù)將外源基因表達(dá)載體 pBI121-HAL1∶∶GFP轉(zhuǎn)化棉花鹽敏感材料中s9612，獲得T0棉花轉(zhuǎn)基因種子。用100 mmol·L-1NaCl鹽溶液對轉(zhuǎn)基因T0種子進(jìn)行耐鹽性發(fā)芽試驗(yàn)，并進(jìn)行分子檢測，對鑒定出的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行葉盤耐鹽性分析?！窘Y(jié)果】從釀酒酵母As2.375中克隆耐鹽基因ScHAL1，基因全長885 bp，共編碼294個(gè)氨基酸。對其序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)HAL1蛋白中絲氨酸所占比例最大，整個(gè)蛋白呈堿性且?guī)д?，屬于親水性蛋白。根據(jù)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，推測該蛋白的結(jié)構(gòu)功能域可能主要由無規(guī)則卷曲和β-折疊片構(gòu)成。棉花花粉瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化HAL1后，3種陸地棉花粉的綠色熒光現(xiàn)象都明顯增強(qiáng)，說明該基因可以在這3種陸地棉的花粉中表達(dá)。用100 mmol·L-1NaCl鹽溶液對轉(zhuǎn)基因棉花T0種子和受體材料中s9612自交種進(jìn)行脅迫，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因種子萌發(fā)能力明顯強(qiáng)于受體材料，表明HAL1可以提高種子耐鹽性。根據(jù)基因核苷酸序列設(shè)計(jì)2對引物對T0轉(zhuǎn)基因棉花幼苗進(jìn)行分子檢測，將純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序，測序結(jié)果證明轉(zhuǎn)基因成功。對鑒定出的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行葉盤耐鹽性分析發(fā)現(xiàn)，在600 mmol·L-1NaCl和400 mmol·L-1NaCl鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株葉盤葉綠素含量均高于對照植株，且在600 mmol·L-1NaCl溶液脅迫后，轉(zhuǎn)HAL1植株葉綠素含量反而高于400 mmol·L-1NaCl溶液處理后的葉盤。【結(jié)論】成功從釀酒酵母中克隆基因HAL1，酵母HAL1對提高棉花耐鹽性具有重要作用。

酵母；HAL1；陸地棉；花粉瞬時(shí)表達(dá)；分子檢測

0　引言

【研究意義】土壤鹽漬化已成為影響世界農(nóng)業(yè)發(fā)展的一個(gè)主要因素。據(jù)報(bào)道，鹽漬化影響著全世界約1/5的耕地，并導(dǎo)致其以每年1 000萬公頃的速度流失［1-3］。棉花是鹽堿地的先鋒作物，是開發(fā)利用鹽漬化土地的理想作物之一，通過基因工程和轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高棉花耐鹽性已經(jīng)成為當(dāng)前棉花育種的一個(gè)迫切需求和重要方向。【前人研究進(jìn)展】目前，對棉花的耐鹽機(jī)制、內(nèi)源基因克隆和功能分析方面做了大量的研究，已從棉花中分離克隆了許多抗逆相關(guān)基因。而在外源基因轉(zhuǎn)化棉花方面也有大量報(bào)道。郭三堆等［4］將來源于蘇云金芽孢桿菌具有高殺蟲活性的 Bt殺蟲基因GFM Cry1A導(dǎo)入棉花，成功培育出國產(chǎn)單價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種，使中國成為繼美國之后世界上第二個(gè)研制成功轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的國家；擬南芥抗旱基因AtHDG11可以提高煙草、水稻等轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性，將其轉(zhuǎn)化陸地棉后發(fā)現(xiàn)該基因不僅可以提高轉(zhuǎn)基因棉花的耐旱性，同時(shí)提高棉花產(chǎn)量［5］；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將山菠菜（Atriplex hortensis）AhCMO轉(zhuǎn)化泗棉3號(hào)，0.5% NaCl脅迫轉(zhuǎn)基因棉花和對照，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因棉花所受鹽害程度明顯小于非轉(zhuǎn)基因棉株，證明AhCMO可以提高轉(zhuǎn)基因棉花的耐鹽性［6］；PASAPULA等［7］將擬南芥 AVP1轉(zhuǎn)化棉花，轉(zhuǎn)基因棉花在 200 mmol·L-1NaCl條件下依然可以旺盛生長，同時(shí)在干旱條件下，轉(zhuǎn)基因植株的纖維產(chǎn)量至少提高了20%。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，HAL1 （halotolerance）是重要的耐鹽因子，其參與細(xì)胞內(nèi)離子的濃度調(diào)節(jié)［8］。1992年，GAXIOLA等［9］和RIOS等［10］通過在高鹽條件下對轉(zhuǎn)化酵母菌株進(jìn)行篩選，首次分離出HAL1并在酵母中超表達(dá)，證明其可以減少細(xì)胞內(nèi)Na+積累，同時(shí)促進(jìn)K+吸收。HAL1編碼一種可以調(diào)節(jié)單離子通道的水溶性蛋白（32 kD），它通過提高反饋調(diào)節(jié)中K+吸收的量來促進(jìn)K+的吸收［9］。相關(guān)研究表明，在高等植物中可能存在酵母HAL1的同源基因，這意味著酵母HAL1轉(zhuǎn)化高等植物后可能與植物耐鹽性相關(guān)［11-14］。已有報(bào)道證明，ScHAL1轉(zhuǎn)化甜瓜［15］、番茄［16］、擬南芥［17］、西瓜［18］、苜蓿［19］后，轉(zhuǎn)基因植株在耐鹽性方面比野生型植株均有不同程度的提高；轉(zhuǎn)化番茄后同時(shí)提高其產(chǎn)量［20］；轉(zhuǎn)化水稻后提高其耐堿性［21］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】ScHAL1轉(zhuǎn)化植物后可提高轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性，但轉(zhuǎn)化棉花的功能作用未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以釀酒酵母As2.375為材料，克隆ScHAL1并構(gòu)建表達(dá)載體，運(yùn)用基因槍活體轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化陸地棉（Gossypium hirsutum L.）中s9612，旨在進(jìn)一步探索該基因在高等植物中的確切功能，同時(shí)為獲得棉花耐鹽性新材料奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）As2.375購自上海工業(yè)微生物研究所。

1.2RNA的提取和基因全長序列克隆

使用UltraClean Microbial RNA Isolation Kit（MO BIO）試劑盒提取釀酒酵母 As2.375的 RNA，用Nanodrop 2000核酸分析儀測定總 RNA的濃度和純度，用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)基因全長引物，分別命名為HAL1-F和HAL1-R（表1）。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，用2×TransTaq-T PCR SuperMix擴(kuò)增ScHAL1全長mRNA序列。PCR程序?yàn)?4℃ 5min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。連接pMD-18 T載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取陽性克隆，測序驗(yàn)證。

1.3序列分析

Protparam（http://web.expasy.org/protparam/）在線軟件分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。ProtScale（http://web. expasy.org/protscale/）預(yù)測親疏水性。SOPMA（http:// npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/MPSA /npsa_sopma.html）分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.4構(gòu)建pBI121-ScHAL1：：GFP熒光表達(dá)載體

在線（http://bioinfo.clontech.com/infusion）設(shè)計(jì)In-Fusion引物，命名為InHAL1-F和InHAL1-R（表1）。該引物分別在基因克隆引物的上下游5′端加上載體正向酶切位點(diǎn)和反向酶切位點(diǎn)連接處15 bp的重疊堿基。以ScHAL1質(zhì)粒為模板，用In-Fusion引物進(jìn)行擴(kuò)增。選擇的酶切位點(diǎn)為 XbaI和 SmaI，對表達(dá)載體pBI121::GFP進(jìn)行雙酶切。采用In-Fusion連接技術(shù)進(jìn)行 pBI121-ScHAL1::GFP表達(dá)載體的構(gòu)建，其構(gòu)建原理基本流程如圖1所示，驗(yàn)證重組克隆并測序。

表1　試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the experiments

1.5ScHAL1在棉花花粉中的瞬時(shí)表達(dá)分析

收集陸地棉Y-2067、ZA-23和GZ-2 3種材料的花粉，便攜式基因槍 GDS-80轟擊花粉，在激光共聚焦顯微鏡FV1000（日本Olympus）下觀察花粉熒光。

1.6基因槍活體轉(zhuǎn)化棉花

提取pBI121-ScHAL1::GFP載體質(zhì)粒（1 mg·mL-1）備用，金粉和質(zhì)粒的處理參照孔靜靜［22］的試驗(yàn)步驟；參考周凱［23］的操作方法進(jìn)行基因槍活體轉(zhuǎn)化工作，即：（1）轉(zhuǎn)化的第一天下午采集花朵并計(jì)數(shù)，已去掉雄蕊的花用蠟管套住柱頭；（2）第二天上午收集花粉，將質(zhì)粒和金粉的懸浮液加入基因槍中并轟擊花粉；（3）將轟擊后的花粉人工涂抹在前一天用蠟管套住的雄蕊的柱頭，并將蠟管重新套好，以免發(fā)生雜交。（4）待種子成熟，將收獲的種子做好標(biāo)記，曬干后保存。

1.7轉(zhuǎn)基因棉花T0種子耐鹽性發(fā)芽試驗(yàn)

采用雙夾層濾紙法［22］對收獲的 T0種子進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，用100 mmol·L-1NaCl溶液處理為試驗(yàn)組，清水處理為對照組，放入光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)（培養(yǎng)條件為28℃，光照14 h；25℃，黑暗10 h），試驗(yàn)組和對照組各重復(fù)3次，7 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽結(jié)果。

1.8轉(zhuǎn)基因棉花分子檢測

根據(jù)ScHAL1在棉花基因組中的比對情況，對基因序列設(shè)計(jì)2對引物，分別命名為HAL1-F1、HAL1-R1和HAL1-F2、HAL1-R2（表1）。采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用程序?yàn)?4℃，5 min；94℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 30 s，40 cycle；72℃ 10 min。

圖1　表達(dá)載體構(gòu)建流程圖（摘自TaKaRa Clontech 技術(shù)）Fig.1 The flowing chart of construction expression vector （from TaKaRa Clontech technology）

1.9轉(zhuǎn)基因棉花葉盤耐鹽性分析

對鑒定出的轉(zhuǎn)基因植株隨機(jī)選擇6棵進(jìn)行葉盤耐鹽性分析試驗(yàn)。具體操作步驟參照張瑩［24］的方法，分別取6棵植株同一葉位的葉片進(jìn)行打孔，滅菌水、400 和600 mmol·L-1NaCl鹽水處理，同一時(shí)期中s9612植株同葉位的葉片為對照，重復(fù)3組；28℃，光照條件培養(yǎng)96 h，觀察葉盤顏色和形態(tài)變化并測定每組葉綠素含量。

2　結(jié)果

2.1ScHAL1的克隆

在 NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索得到 ScHAL1 （GenBank：EF015596.1）的全長序列信息，設(shè)計(jì)基因特異性引物，以cDNA為模板，擴(kuò)增ScHAL1完整序列。得到一條長度為885 bp編碼294個(gè)氨基酸的核苷酸序列（圖2），測序結(jié)果正確。

圖2　ScHAL1的克隆Fig.2 Cloning of ScHAL1

2.2生物信息學(xué)分析

在線分析軟件 Protparam （http://web.expasy.org/ protparam/）的結(jié)果表明，HAL1蛋白的分子式為C1443H2269N409O460S7，分子量為32.9 kD，等電點(diǎn)為9.01，基因定位在細(xì)胞質(zhì)中。其氨基酸組成中，絲氨酸（Ser）所占比例最大，為13%；其次是賴氨酸（Lys）9%（圖3-A）。帶正電荷的堿性氨基酸（Arg+Lys）有38個(gè)，帶負(fù)電荷的酸性氨基酸（Asp+Glu）有31個(gè)，該蛋白呈堿性且?guī)д?。分析其不穩(wěn)定指數(shù)為50.08，半衰期大于20 h，屬于不穩(wěn)定蛋白。分析HAL1蛋白的親疏水性發(fā)現(xiàn)，蛋白中親水性氨基酸明顯多于疏水性氨基酸（圖3-B），其親水性平均數(shù)（GRAVY）為-0.787，即整個(gè)蛋白為親水性。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（圖3-C）表明，該蛋白中無規(guī)則卷曲的氨基酸有150個(gè)，占51.02%，組成該蛋白的主體結(jié)構(gòu)；β-折疊片為73個(gè)，占24.83%；α螺旋區(qū)為39個(gè)氨基酸，占13.27% ；β-轉(zhuǎn)角占10.88%，包含32個(gè)氨基酸；推測該蛋白的結(jié)構(gòu)功能域可能主要由無規(guī)則卷曲和β-折疊片構(gòu)成。

2.3pBI121-ScHAL1：：GFP熒光表達(dá)載體的構(gòu)建

將ScHAL1插入植物表達(dá)載體pBI121::GFP中，構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆進(jìn)行測序，序列比對結(jié)果正確。選用限制性內(nèi)切酶BglⅡ酶切驗(yàn)證插入正確（圖4），表明表達(dá)載體構(gòu)建成功，命名為 pBI121-ScHAL1:: GFP。

2.4ScHAL1在棉花花粉中的瞬時(shí)表達(dá)分析

棉花花粉具有自發(fā)熒光現(xiàn)象。在波長為488 nm的激發(fā)光下，棉花花粉的自發(fā)熒光為綠色。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果［22］，選擇花粉自發(fā)熒光較弱的3種棉花材料GZ-2、Y-2067、ZA-23收集花粉，采用基因槍活體轉(zhuǎn)化技術(shù)對棉花花粉進(jìn)行轟擊，室溫下過夜培養(yǎng)，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察（圖5），發(fā)現(xiàn)3種材料的花粉綠色熒光都明顯增強(qiáng)，證明該基因在棉花花粉中得到了表達(dá)，同時(shí)證明該外源基因轉(zhuǎn)化棉花的可行性，為使用基因槍活體轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因耐鹽材料奠定基礎(chǔ)。

2.5轉(zhuǎn)基因棉花T0種子耐鹽性檢測

將釀酒酵母耐鹽相關(guān)基因ScHAL1轉(zhuǎn)入鹽敏感材料中s9612，共收獲T0種子187粒，同時(shí)選取材料中s9612自交種子作為對照，各取籽粒飽滿，均勻一致的種子20粒，采用雙夾層濾紙培養(yǎng)法，用100 mmol·L-1的NaCl溶液處理為試驗(yàn)組，0 mmol·L-1處理為對照組，然后放入光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，7 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽結(jié)果（圖6），在NaCl溶液脅迫下，轉(zhuǎn)基因種子萌發(fā)能力明顯高于對照，表明HAL1可以明顯提高種子耐鹽性。

2.6轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

將正常發(fā)芽的種子置于溫室中出苗，取幼苗葉片提取DNA進(jìn)行分子檢測。以載體質(zhì)粒為陽性對照，中s9612自交種DNA為陰性對照（圖7）。轉(zhuǎn)基因植株和質(zhì)粒中均擴(kuò)出條帶，而陰性對照中無帶。將PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序，測序結(jié)果使用DNAMAN軟件與ScHAL1的mRNA序列進(jìn)行比對（圖8），認(rèn)為酵母HAL1已成功轉(zhuǎn)入棉花中。

2.7葉盤耐鹽性分析結(jié)果

對分子檢測正確的9棵轉(zhuǎn)基因植株中隨機(jī)選擇6棵，進(jìn)行葉盤耐鹽性試驗(yàn)（圖9-A），400和600 mmol·L-1NaCl鹽水脅迫96 h后，棉花葉盤顏色逐漸變黃，葉邊緣變白，而0 mmol·L-1NaCl溶液處理下葉盤依然保持綠色；且在相同濃度鹽溶液處理下，轉(zhuǎn)HAL1植株葉盤顏色形態(tài)強(qiáng)于對照葉盤。對處理后的葉盤測定其葉綠素含量（圖9-B），結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照中s9612相比，0 mmol·L-1鹽溶液處理后轉(zhuǎn)基因植株葉盤的葉綠素含量較高，但差異并不明顯；400 mmol·L-1NaCl處理后，二者葉綠素含量都有所降低，轉(zhuǎn)基因植株葉綠素含量明顯高于對照；600 mmol·L-1NaCl處理后，轉(zhuǎn)基因棉花葉盤葉綠素含量高于對照一倍多。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株葉盤在600 mmol·L-1NaCl溶液脅迫后，葉綠素含量反而高于400 mmol·L-1NaCl溶液處理后的葉盤，推測釀酒酵母HAL1在棉花耐受高鹽脅迫方面發(fā)揮巨大作用。

圖3　ScHAL1蛋白生物信息學(xué)分析Fig.3 Bioinformatics analysis of ScHAL1 protein

圖4　pBI121-ScHAL1：：GFP表達(dá)載體酶切驗(yàn)證Fig.4 Enzyme digestion of expression vector pBI121-ScHAL1::GFP

圖5　棉花花粉的瞬時(shí)表達(dá)分析Fig.5 The transient expression analysis of cotton pollen

圖6　轉(zhuǎn)ScHAL1棉花種子發(fā)芽試驗(yàn)Fig.6 Seed germination test of ScHAL1 transgenic cotton

圖7　轉(zhuǎn)基因植株分子檢測Fig.7 The transgenic plants molecular detection

圖8　測序結(jié)果Fig.8 Sequencing result

圖9　轉(zhuǎn)基因棉花葉盤耐鹽性分析Fig.9 Transgenic cotton semal salt resistance analysis

3　討論

大量的研究表明，耐鹽真菌的相關(guān)耐鹽基因能提高微生物和植物的耐鹽能力［25-26］。ZHAO等［27］將酵母超氧化物歧化酶基因SOD轉(zhuǎn)入水稻中，轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性具有一定的提高；張麗青［28］克隆來自嗜熱毛殼菌SOD轉(zhuǎn)化煙草，除了提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽能力，對煙草赤星病和炭疽病有一定的抵抗能力；謝麗霞［29］將曲霉中分離出的耐鹽基因RPS3ae和RPL44轉(zhuǎn)化擬南芥和煙草，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株對鹽漬化的耐受型明顯高于對照野生型。

目前用于植物轉(zhuǎn)基因的方法較多，相比于農(nóng)桿菌侵染法、花粉管注射和臺(tái)式基因槍轟擊法，本研究使用的基因槍活體轉(zhuǎn)化技術(shù)操作步驟簡單，減少材料污染，大大縮短試驗(yàn)周期。

結(jié)合HAL1序列與GFP報(bào)告基因構(gòu)建融合表達(dá)載體，通過基因槍活體轉(zhuǎn)化技術(shù)在棉花花粉中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)研究，結(jié)果表明，HAL1在棉花花粉中可以表達(dá)，為下一步轉(zhuǎn)化棉花獲得轉(zhuǎn)基因新材料奠定基礎(chǔ)。利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序，縮短轉(zhuǎn)基因種子檢測的時(shí)間。而對于PCR擴(kuò)增無法獲得基因全長的結(jié)果，認(rèn)為可能是由于ScHAL1整合到棉花基因組后基因編碼鏈被打斷導(dǎo)致的，還需進(jìn)一步檢測鑒定。

張荃等［30］從啤酒酵母中克隆了HAL1并利用葉圓盤法轉(zhuǎn)化番茄，對T1轉(zhuǎn)基因番茄和對照番茄進(jìn)行鹽處理，15 d后觀察發(fā)現(xiàn)，在任何鹽濃度下，轉(zhuǎn)基因植株和對照植株的生長情況均有所緩滯，但轉(zhuǎn)基因植株的生長情況明顯優(yōu)于對照。在175 mmol·L-1NaCl處理10 d后，對照番茄葉片變黃，基部葉片脫落并伴有壞死，而轉(zhuǎn)基因植株的葉片呈深綠色，生長狀況明顯強(qiáng)于對照。鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因番茄地上部分的鮮重、干重也明顯高于對照番茄。HAL1的轉(zhuǎn)入提高了轉(zhuǎn)基因番茄的耐鹽性。100 mmol·L-1NaCl溶液對轉(zhuǎn)基因種子進(jìn)行耐鹽性發(fā)芽試驗(yàn)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因種子在鹽脅迫下的芽長度明顯比0 mmol·L-1對照組短，但比鹽脅迫后的非轉(zhuǎn)基因種子芽長度長。對轉(zhuǎn)基因植株的葉盤耐鹽性分析表明，酵母HAL1轉(zhuǎn)化棉花后提高轉(zhuǎn)基因植株葉盤的耐鹽性，且在高鹽濃度下對其耐受性提高具有重要作用，后續(xù)試驗(yàn)將對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行進(jìn)一步研究。

4　結(jié)論

克隆釀酒酵母As2.375耐鹽基因HAL1并轉(zhuǎn)化陸地棉中s9612，在100 mmol·L-1NaCl溶液脅迫下，轉(zhuǎn)HAL1的棉花種子耐鹽性明顯強(qiáng)于受體材料中 s9612自交種；不同濃度鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株葉盤葉綠素含量均高于對照植株，且在 600 mmol·L-1NaCl溶液脅迫后，轉(zhuǎn)HAL1植株葉綠素含量反而高于400 mmol·L-1NaCl溶液的處理。證明ScHAL1可以提高棉花耐鹽性。

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（責(zé)任編輯 李莉）

The Function Expression of Salt-Tolerant Yeast Gene Halotolerance （ HAL1 ） in Cotton

MU Min，SHU Na，WANG Shuai，GUO Li-xue，F(xiàn)AN Wei-li，YIN Zu-jun，WANG Jun-juan，WANG De-long，YE Wu-wei
（Institute of Cotton Research，Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Biology/Key Laboratory for Cotton Genetic Improvement，Ministry of Agriculture，Anyang 455000，Henan）

【Objective】 The objective of this study is to clone Saccharomyces cerevisiae halotolerance （ScHAL1） gene and transformed into cotton ，explore the function of the gene in cotton，to further explore function of the salt-tolerant yeast genes in higher plants. 【Method】According to total length of mRNA sequence information of ScHAL1 in NCBI，the gene was cloned using RT-PCR technology from Saccharomyces cerevisiae As2.375，double enzyme digestion was made with XbaIand SmaIforpBI121::GFP，and pBI121-ScHAL1::GFP fusion expression vector was constructed by In-Fusion technique. With weak auto-fluorescence upland cotton varieties，Y-2067，ZA-23 and GZ-2 pollen as materials，using the gene bombarding technique to study transient expression of cotton pollen. The expression vector pBI121-ScHAL1::GFP was transformed into cotton salt-sensitive material Zhong s9612 with gene gun in vivo conversion technology，T0generation cotton genetically seeds were modified. Solution with 100 mmol·L-1NaCl was used to test the salt resistance of seeds in the transgenic T0generation seed germination experiment，molecular detection was carried out，and semal salt resistance of transgenic plants was analysis. 【Result】 ScHAL1 cloned from Saccharomyces cerevisiae As2.375 and ScHAL1 is 885 bp in length，which encoding 294 amino acids. After its sequence analysis，it was found that the largest proportion of the whole HAL1 protein is serine，and it is alkaline and positively charged and it is a hydrophilic protein. According to the results of protein secondary structure prediction，it is speculated that the structure of the protein function domain may mainly made up of random curl and beta sheet. Cotton pollen instantaneous expression results showed that after conversion of HAL1 gene，three land cotton powder green fluorescence were obviously enhanced，suggesting that the gene expressed in these three upland cotton pollen. With 100 mmol·L-1NaCl，transgenic T0generation seed germination ability obviously stronger than receptor s9612 selfing seed material，which preliminary showed that HAL1 could also improve the seed salt resistance. According to the gene nucleotide sequences，two pairs of primers were designed for molecular detection of T0generation. Direct sequencing of PCR product was conducted and the sequencing results preliminarily evidence that the transgene is successful. With the semal salt resistance analysis，it was found that the chlorophyll contents of transgenic plants in 600 mmol·L-1NaCl and 400 mmol·L-1NaCl were higher than the control，and the chlorophyll contents of transgenic plants in 600 mmol·L-1NaCl were higher than that in 400 mmol·L-1NaCl. 【Conclusion】HAL1 gene was Successfully cloned from Saccharomyces cerevisiae，yeast HAL1 gene plays an important role in improving cotton salt resistance.

yeast； HAL1； upland cotton； pollen instantaneous expression； molecular detection

2016-02-15；接受日期：2016-05-23

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)（2014ZX0800504B）

聯(lián)系方式：穆敏，Tel：15890348192；E-mail：15890348192@163.com。通信作者葉武威，Tel：0372-2562283；E-mail：yew158@163.com