段仰凱，梁飛燕，談曉明，呂雪峰

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基于Ⅰ的T載體及其在合成生物學(xué)中的應(yīng)用

段仰凱1,2，梁飛燕1,2，談曉明2，呂雪峰2

1 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049 2 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所 中國(guó)科學(xué)院生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101

為了節(jié)約成本和提高實(shí)驗(yàn)效率，以商用pMD18-T載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建獲得了pFL-XS-T載體，其具有符合Biobrick標(biāo)準(zhǔn)的串聯(lián)Ⅰ-Ⅰ-Ⅰ-Ⅰ克隆序列，通過(guò)對(duì)Ⅰ的酶切處理即可以通過(guò)TA克隆方便地克隆PCR片段。克隆驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)Ⅰ處理的該載體可以與PCR片段進(jìn)行TA連接，連接效率及陽(yáng)性率均可以滿足實(shí)驗(yàn)室要求并且可以得到Biobrick標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。此外，該載體不僅可以與其余Biobrick標(biāo)準(zhǔn)元件進(jìn)行串聯(lián)，還可以作為功能DNA元件的篩選載體。

Biobrick標(biāo)準(zhǔn)，TA克隆，合成生物學(xué)

傳統(tǒng)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，由于受可用酶切位點(diǎn)的限制，許多重組后的DNA無(wú)法繼續(xù)拼裝，因而不能滿足合成生物學(xué)的大量、快速拼裝的要求。Knight發(fā)明了一套新的DNA組裝策略并將其命名為“Biobrick”。該策略利用限制性內(nèi)切酶的同尾酶，酶切后可以得到互補(bǔ)的粘性末端并且連接后形成的堿基序列無(wú)法被其中任何一種酶識(shí)別的原理，實(shí)現(xiàn)了DNA片段的循環(huán)組裝[1-3]。經(jīng)典的Biobrick拼接方法，需要先通過(guò)PCR克隆的方式，將目的片段克隆到兩翼帶有RⅠ-Ⅰ、Ⅰ-Ⅰ等酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒上。這就需要在擴(kuò)增目的片段的引物末端加上Ⅰ和Ⅰ等酶切位點(diǎn)，引物上額外的酶切位點(diǎn)的添加使得合成成本升高且步驟相對(duì)繁瑣。

PCR是分子生物學(xué)中獲得體外DNA片段的最常用的方法，用DNA聚合酶PCR擴(kuò)增得到片段的3′端突出一個(gè)A堿基[4]，TA克隆是DNA聚合酶擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與載體連接最快速最有效的方法之一[5-8]。商用T載體，如pMD18-T，載體兩端有Ⅰ等多個(gè)酶切位點(diǎn)可用，然而通常條件下克隆得到的質(zhì)粒并不具有Biobrick特征，在載體的一端缺少Ⅰ的同尾酶Ⅰ。若要利用TA克隆的方式獲得Biobrick特征質(zhì)粒，需要在目的片段的一端加入Ⅰ酶切位點(diǎn)且片段插入后需確保pMD18-T載體引入的Ⅰ和目的片段引入的Ⅰ酶切位點(diǎn)位于插入片段的兩端。該方法雖然克隆效率高，但擴(kuò)增片段的引物末端還需加入Ⅰ酶切位點(diǎn)且克隆后需要鑒定插入方向，這使得引物合成成本升高且步驟仍然相對(duì)繁瑣。

由此可見(jiàn)，獲得一個(gè)帶有Biobrick酶切位點(diǎn)的T載體就可以解決傳統(tǒng)Biobrick組件獲取方法所面臨的問(wèn)題。許多研究報(bào)道過(guò)利用限制性內(nèi)切酶可以構(gòu)建T載體[9-11]，其中Ⅰ構(gòu)建T載體的研究尤其得到了廣泛關(guān)注[12-16]。Ⅰ為一種Ⅱ型限制性內(nèi)切酶，識(shí)別位點(diǎn)為5′-CCANNNNN | NNNNNTGG-3′，如果設(shè)計(jì)第5個(gè)N為T(mén)，Ⅰ酶切后在3′端突出一個(gè)T，可以與聚合酶反應(yīng)產(chǎn)物上的3′端單A突出配對(duì)，直接進(jìn)行亞克隆或測(cè)序。但是目前還沒(méi)有利用Ⅰ構(gòu)建符合Biobrick規(guī)范T載體的研究報(bào)道。事實(shí)上，pMD18-T與符合Biobrick規(guī)范T載體的主要區(qū)別只是在pMD18-T的d Ⅲ一端缺少Ⅰ酶切位點(diǎn)。因此，將一段一端帶有Ⅰ酶切位點(diǎn)，另一端帶有Ⅰ和Ⅰ酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體經(jīng)過(guò)TA克隆連接，會(huì)得到一個(gè)符合Biobrick規(guī)則的T載體質(zhì)粒，得到的質(zhì)粒再經(jīng)過(guò)Ⅰ酶切便可以得到符合Biobrick規(guī)范的T載體 (圖1)，該載體不僅可以與DNA片段進(jìn)行TA克隆連接，而且克隆后的片段還可以利用Biobrick規(guī)則進(jìn)行后續(xù)組裝 (圖1)。因此，本文按照該方法構(gòu)建了Biobrick-T載體并對(duì)該載體的克隆效率及應(yīng)用的有效性進(jìn)行了驗(yàn)證。

圖1 基于XcmⅠ的T載體構(gòu)建及其在合成生物學(xué)中應(yīng)用示意圖

1 材料與方法

1.1 試劑

pMD18-T載體和感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于TaKaRa (日本)。其余用于分子克隆的試劑盒購(gòu)于Omega (美國(guó))。內(nèi)切酶Ⅰ購(gòu)于NEB (美國(guó))，其余所用的限制性內(nèi)切酶和分子克隆所用到的相關(guān)的酶購(gòu)于Thermo (加拿大)。

1.2 菌株和質(zhì)粒的構(gòu)建

本研究所用的引物見(jiàn)表1，用到的質(zhì)粒見(jiàn)表2。

表1 本研究中所用的引物

Table 1 Primers used in this study

Underlined nucleotides represent the restriction enzyme sites

表2 本研究中所用的質(zhì)粒

Table 2 Plasmids used in this study

1.2.1 使用pMD18-T載體構(gòu)建Biobrick標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒

以pRL271[17]為模板，Cm-F (含Ⅱ酶切位點(diǎn))/Cm-R (含Ⅰ酶切位點(diǎn)) 為引物PCR擴(kuò)增得到約1 kb的氯霉素抗性基因片段，隨后將該片段連接到pMD18-T載體中得到質(zhì)粒pXT170c，形成Ⅰ和Ⅰ同尾酶的Biobrick標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒。隨后用Ⅰ酶切pRL57[18]，得到的帶有壯觀霉素抗性編碼基因的Omega片段與用Ⅱ和Ⅰ酶切并補(bǔ)平的pXT170c片段連接，得到有Biobrick標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒pXT170s。用QucikChange方法消除壯觀霉素抗性片段中的Ⅰ位點(diǎn) (用引物Omega-qc-F/Omega-qc-R進(jìn)行突變)得到質(zhì)粒pXT170′。

1.2.2 Biobrick-T載體pFL-XS的構(gòu)建

以pRL271[17]為模板，X-F1/X-R1為引物PCR擴(kuò)增得到約1 kb的氯霉素抗性片段，隨后將該片段連接到pMD18-T載體中得到質(zhì)粒pXcm-XS。用Ⅰ酶切該質(zhì)粒并用T4 DNA聚合酶補(bǔ)平，自連接，最終得到消除Ⅰ的質(zhì)粒pFL-XS。

1.2.3 利用Biobrick規(guī)則進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建

如圖2所示，使用Ⅰ和Ⅰ酶切質(zhì)粒BBa_E0240得到綠色熒光報(bào)告基因片段 (eGFP)，使用Ⅰ和Ⅰ酶切pFL-XS得到載體片段，將兩個(gè)片段分別回收后連接得到質(zhì)粒pXT238。用Ⅰ和Ⅰ酶切pXT238得到的載體與用Ⅰ和Ⅰ酶切pXT170′得到的壯觀霉素抗性片段連接得到質(zhì)粒pXT244′。

圖2 利用Biobrick規(guī)則構(gòu)建質(zhì)粒pXT244′流程圖

1.2.4 用于大腸桿菌中檢測(cè)啟動(dòng)子活性的質(zhì)粒構(gòu)建

用Ⅰ酶切pXT244′得到有3′-T突出的2.7 kb的DNA片段，該片段可作為T(mén)載體。lacI-R/PlacO-R為引物，質(zhì)粒pRL59EH[19]為模板用DNA聚合酶PCR得到3′端帶有堿基A的lacI-Ptac片段，lacI-R/PlacO-R為引物，質(zhì)粒pXT181b為模板用DNA聚合酶PCR得到3′端帶有堿基A的lacI-Ptrc片段，將兩個(gè)啟動(dòng)子片段分別與pXT244′得到的載體進(jìn)行TA克隆分別得到含有Ptac啟動(dòng)子的質(zhì)粒pFL75和含有Ptrc啟動(dòng)子的質(zhì)粒pFL76。

1.3 pFL-XS-T載體克隆效率及陽(yáng)性率測(cè)定

pFL-XS質(zhì)粒用Ⅰ (NEB) 酶切并使用膠回收試劑盒 (OMEGA) 回收得到2.7 kb的pFL-XS-T載體 (40 μg/μL)，實(shí)驗(yàn)中對(duì)照載體使用的是商業(yè)載體pMD18-T (TaKaRa，50 μg/μL)。

首先，實(shí)驗(yàn)使用插入片段 (pMD18-T試劑盒內(nèi)置對(duì)照片段，50 μg/μL) 與兩個(gè)載體分別進(jìn)行連接。連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，分別隨機(jī)挑取20個(gè)單克隆，使用通用引物RV-M和M13-47對(duì)20個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆的標(biāo)準(zhǔn)是菌落PCR可以得到約660 bp的PCR產(chǎn)物。

其次，為了驗(yàn)證pFL-XS-T對(duì)隨機(jī)克隆的PCR產(chǎn)物的連接效率，PCR擴(kuò)增來(lái)源于集胞藻PCC 6803 (sp. PCC 6803) 328 bp和來(lái)源于聚球藻PCC 7942(sp. PCC 7942) 2 199 bp兩段DNA片段。用膠回收試劑盒(OMEGA)回收，分別與pFL-XS-T載體連接過(guò)夜隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α。分別隨機(jī)挑取24個(gè)單克隆，用上述通用引物對(duì)單克隆進(jìn)行菌落PCR。檢驗(yàn)出陽(yáng)性克隆的標(biāo)準(zhǔn)是菌落PCR可以分別得到約500 bp和2 350 bp的PCR產(chǎn)物。

1.4 大腸桿菌轉(zhuǎn)化

將質(zhì)粒pFL75、pFL76和pFL77轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，分別得到重組大腸桿菌FL178、FL179和FL180。

1.5 熒光顯微鏡觀察

將重組大腸桿菌FL178、FL179和FL180接種到LB培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)加入1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)。IPTG誘導(dǎo)后5 h，對(duì)不同菌的培養(yǎng)液取樣并進(jìn)行熒光顯微鏡 (Olympus BX51, 日本) 觀察[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 T尾Biobrick載體的獲得

構(gòu)建得到pFL-XS質(zhì)粒經(jīng)過(guò)內(nèi)切酶Ⅰ可以得到Biobrick-T載體。由圖3可以清楚地看出，內(nèi)切酶Ⅰ可以有效地將pFL-XS質(zhì)粒酶切成一個(gè)2 722 bp的載體片段和一個(gè)962 bp的氯霉素抗性片段，并且兩個(gè)片段的大小可以確保在回收膠上得到有效分離 (圖3)，其中2 722 bp片段為Biobrick-T載體片段。該載體以pMD18-T載體為基本框架，不僅具備各種多克隆位點(diǎn)，而且在載體兩端分別帶有RⅠ-Ⅰ和Ⅰ-Ⅰ Biobrick酶切位點(diǎn)，使得與該載體進(jìn)行TA克隆后的DNA片段獲得Biobrick特征(圖1)。

圖3 pFL-XS-T載體的XcmⅠ限制性內(nèi)切酶酶切檢測(cè) 結(jié)果

2.2 pFL-XS-T載體克隆效率及陽(yáng)性率

商業(yè)載體pMD18-T轉(zhuǎn)化平板上的單克隆數(shù)量 (大于200個(gè)) 遠(yuǎn)高于pFL-XS-T載體轉(zhuǎn)化平板上的單克隆數(shù)量 (32個(gè))，但是自制pFL-XS-T濃度略低于商用載體濃度 (40 μg/mL VS 50 μg/mL)，如果提高pFL-XS-T載體的濃度，轉(zhuǎn)化后的單克隆數(shù)目有再增多的可能。但是在該濃度下，pFL-XS-T為載體的轉(zhuǎn)化平板上的單克隆數(shù)目足夠應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室條件下目的克隆的獲得。

本研究以菌落PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化子插入片段的方法來(lái)驗(yàn)證陽(yáng)性克隆并計(jì)算陽(yáng)性率，分別選用pMD18-T載體的商用插入片段和藍(lán)藻基因組隨機(jī)片段作為待測(cè)片段。在插入商用片段的實(shí)驗(yàn)中，隨機(jī)挑取20個(gè)單克隆PCR鑒定，pMD18-T載體重組質(zhì)粒的陽(yáng)性率為100% (圖4A)，即所有單克隆中都成功得到了含有插入商業(yè)片段的重組質(zhì)粒；pFL-XS-T載體重組質(zhì)粒的陽(yáng)性率為90% (20個(gè)單克隆中18個(gè)為陽(yáng)性)，即有10%的單克隆中沒(méi)有成功得到含有插入商業(yè)片段的重組質(zhì)粒 (圖4B)。假陽(yáng)性的出現(xiàn)是因?yàn)閜FL-XS質(zhì)粒在DNA瓊脂膠上條帶的位置與pFL-XS-T線性載體的條帶基本重合 (數(shù)據(jù)未列出)，與之前文獻(xiàn)報(bào)道類似[21-22]，受Ⅰ酶切效率的限制，有少量的沒(méi)有受到Ⅰ酶切的質(zhì)?；烊肓溯d體片段中，該質(zhì)粒含有氯霉素和氨芐青霉素的抗性，因此轉(zhuǎn)化得到的克隆可以在氨芐青霉素的抗性板上生長(zhǎng)，因此推測(cè)影響重組陽(yáng)性率的主要因素是pFL-XS質(zhì)粒的酶切完全程度。這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)增加填充片段(本研究為氯霉素)的長(zhǎng)度，使得載體片段和未被酶切的質(zhì)粒在電泳膠上易于分開(kāi)回收以及引入藍(lán)白斑篩選來(lái)提高連接效率[21,23-25]。

圖4 商用插入片段與pFL-XS-T載體的TA克隆效率及陽(yáng)性率檢測(cè)

T載體的廣泛應(yīng)用是因?yàn)槟軌蛑苯优c實(shí)驗(yàn)室條件下用DNA聚合酶PCR得到的產(chǎn)物連接并進(jìn)行后續(xù)的亞克隆和測(cè)序工作。為了驗(yàn)證pFL-XS-T對(duì)隨機(jī)克隆的PCR產(chǎn)物的連接效率，用DNA聚合酶分別PCR克隆了來(lái)源于藍(lán)藻基因組的328 bp和2.2 kb的基因片段，純化后直接與pFL-XS-T載體連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化。各隨機(jī)挑取24個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)兩者的陽(yáng)性率都高于75% (圖5)。

圖5 隨機(jī)插入片段與pFL-XS-T載體的TA克隆效率及陽(yáng)性率檢測(cè)

以上結(jié)果說(shuō)明該載體可以有效地通過(guò)TA克隆的方式連接DNA片段，這些片段連接以后形成的質(zhì)粒即為Biobrick標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒，這樣便可以省去PCR擴(kuò)增中為了加入Biobrick所需要的酶切位點(diǎn)而增加的引物長(zhǎng)度。因此通過(guò)該方法可以很便捷的建立Biobrick元件庫(kù)。

2.3 不同方式獲得的符合Biobrick標(biāo)準(zhǔn)的基因元件的組裝和應(yīng)用驗(yàn)證

為了驗(yàn)證得到的pFL-XS在實(shí)際應(yīng)用中是否可以與符合Biobrick標(biāo)準(zhǔn)的元件有效拼接。我們先將質(zhì)粒pFL-XS與Biobrick標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒庫(kù)中的質(zhì)粒BBa_E0240進(jìn)行Biobrick規(guī)則組裝 (詳見(jiàn)材料與方法1.2.3)，得到了含有報(bào)告基因的質(zhì)粒pXT238，該質(zhì)粒仍然具有Biobrick特征。隨后我們又將pXT238與之前構(gòu)建的具有Biobrick特征的質(zhì)粒pXT170′再次進(jìn)行了Biobrick規(guī)則組裝，最終得到了帶有報(bào)告基因且仍然具有Biobrick特征的質(zhì)粒pXT244′。質(zhì)粒pXT244′構(gòu)建過(guò)程不僅證明了本研究得到的pFL-XS載體質(zhì)粒不僅具有Biobrick特征并且可以與其余Biobrick規(guī)則的片段及質(zhì)粒進(jìn)行連續(xù)的Biobrick規(guī)則組裝。

另外，之前有研究將T載體用于高通量篩選[26]，由于本研究得到的pFL-XS-T載體也具有T載體的特點(diǎn)，前面我們已經(jīng)驗(yàn)證了該載體連接的有效性，為了進(jìn)一步驗(yàn)證該載體應(yīng)用的有效性，我們將該載體可進(jìn)行TA克隆的特性用于啟動(dòng)子篩選。質(zhì)粒pXT244′源于質(zhì)粒pFL-XS，是以pFL-XS為載體，利用Biobrick規(guī)則與其余片段組裝獲得，該質(zhì)粒經(jīng)過(guò)Ⅰ酶切后可以得到含有報(bào)告基因的T載體，因此需要篩選的啟動(dòng)子片段只需要經(jīng)過(guò)PCR和TA克隆便可以得到啟動(dòng)子篩選質(zhì)粒。我們分別構(gòu)建了含有Ptrc和Ptac啟動(dòng)子的篩選質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒 (見(jiàn)材料與方法) 并將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。培養(yǎng)的重組大腸桿菌在加入IPTG誘導(dǎo)以后，在日光中就可以看到含有Ptrc和Ptac啟動(dòng)子的菌株有熒光出現(xiàn) (圖6C)。在熒光顯微鏡下觀察，很明顯可以看出含有Ptrc和Ptac啟動(dòng)子的菌株可以發(fā)出綠色熒光 (圖6A和圖6B)。

圖6 重組大腸桿菌FL178、FL179和FL180的表型分析

因此，基于pFL-XS-T載體構(gòu)建的質(zhì)粒不僅可以實(shí)現(xiàn)與其他來(lái)源的Biobrick元件進(jìn)行拼裝，而且還可以作為T(mén)載體，通過(guò)TA克隆的方式對(duì)其中的元件進(jìn)行建庫(kù)及高通量篩選。

3 結(jié)果與討論

標(biāo)準(zhǔn)化生物學(xué)元件可以大大簡(jiǎn)化生物基因工程過(guò)程。本研究通過(guò)利用Ⅰ對(duì)商業(yè)化載體pMD18-T的改造獲得了具有Biobrick標(biāo)準(zhǔn)的pFL-XS-T載體，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該載體與片段的連接及重組效率均可以滿足實(shí)驗(yàn)需求。另外本研究獲得的載體同時(shí)具備了Biobrick標(biāo)準(zhǔn)元件和T載體的功能，不僅可以與其他的Biobrick標(biāo)準(zhǔn)元件進(jìn)行裝配還可以作為T(mén)載體用于功能DNA元件的篩選，簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)Biobrick方法，減少了引物合成成本，為以后合成生物學(xué)研究提供了一種可選擇的平臺(tái)工具。

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AnⅠ-generated T vector and its applications in synthetic biology

Yangkai Duan1,2, Feiyan Liang1,2, Xiaoming Tan2, and Xuefeng Lü2

1 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 2 Key Laboratory of Biofuels, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, Shandong, China

For more economical and efficient DNA clonging, pFL-XS-T, a Biobrick-T vector was constructed based on pMD18-T vector, carrying clonging regions ofⅠ-Ⅰ-Ⅰ-Ⅰ. The results revealed that PCR products could be conveniently inserted into pFL-XS-T vevtor digested byⅠby means of TA cloning. The positive frequency of recombination can meet the experimental requirements and all the plasmids obtained meet Biobrick standard. Moreover, the pFL-XS-T is compatible with other Biobrick parts, and serves as a vector for functional DNA fragments screening.

Biobrick standard, TA cloning, synthetic biology

October 23, 2015; Accepted: November 16, 2015

段仰凱, 梁飛燕, 談曉明, 等. 基于Ⅰ的T載體及其在合成生物學(xué)中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(7): 956–965.

Duan YK, Liang FY, Tan XM, et al. AnⅠ-generated T vector and its applications in synthetic biology. Chin J Biotech, 2016, 32(7): 956–965.

Supported by: Natural Science Foundation of Shandong Province (No. ZR2013CQ045).

Corresponding authors: Xuefeng Lü. Tel: +86-532-80662629; Fax: +86-532-80662712; E-mail: lvxf@qibebt.ac.cn

山東省自然科學(xué)基金 (No. ZR2013CQ045) 資助。

(本文責(zé)編 郝麗芳)