陳亞軍,高 巖,楊春娟,蘇曉琳,王 蒙,王知斌(黑龍江中醫(yī)藥大學,教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室,黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎研究重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150040)
葡聚糖凝膠Sephadex LH -20 在天然產(chǎn)物分離純化中的應用*
陳亞軍,高巖,楊春娟,蘇曉琳,王蒙,王知斌*
(黑龍江中醫(yī)藥大學,教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室,黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎研究重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150040)
凝膠過濾色譜法是分離純化天然產(chǎn)物的有效方法之一,Sephadex LH-20是最常用的一種葡聚糖凝膠填料,具有操作簡便、分離純度高,適用于多種有機溶劑等優(yōu)點,可用于分離純化苯丙素、黃酮、醌類、生物堿和萜類等天然產(chǎn)物。本文對SephadexLH-20的分離原理和特性及在天然產(chǎn)物分離純化中的應用方面進行系統(tǒng)綜述,為相關的分離純化研究和實際生產(chǎn)提供了重要的參考依據(jù)。
SephadexLH-20;苯丙素;醌類;黃酮;生物堿;萜類
天然產(chǎn)物是藥物的重要組成部分,在預防和治療人類疾病等方面做出了巨大貢獻。而天然產(chǎn)物之所以能夠防病治病與其中所含的有效成分密切相關,因此,進一步分離和純化天然藥物中的有效成分是保證藥物臨床效果的關鍵。近年來天然產(chǎn)物常用的吸附劑主要是硅膠、氧化鋁、聚酰胺等,但其分離效果欠佳,遠達不到人們所期望的純度。在二十世紀60年代開始使用一批新型吸附劑,羥丙基葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)是一種淋洗速度快、可循環(huán)使用、無損失的分離和純化填充材料,對多種天然產(chǎn)物有很好的分離和純化效果[1],所以使用SephadexLH-20作吸附劑,水、甲醇等做流動相,對天然產(chǎn)物進行分離純化,是一種值得深入探究的實驗方法。
1.1Sephadex LH-20的特性
交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex gel)是具有多孔性三度空間網(wǎng)狀結構的高分子化合物,屬于軟性凝膠,其微孔能吸入大量的溶劑,溶脹至干體積的多倍,Sephadex LH-20為葡聚糖凝膠經(jīng)羥丙基化處理后得到的產(chǎn)物,它既有親水性,又有親脂性,不僅可在水中應用,也可在極性有機溶劑或它們與水組成的混合溶劑中膨潤使用,如丁醇、氯仿、四氫呋喃等。SephadexLH-20除了保留葡聚糖凝膠原有的分子篩特性,可按分子量大小分離物質(zhì)外,在由極性與非極性溶劑組成的混合溶劑中也能起到分配色譜的效果,適用于不同類型天然產(chǎn)物的分離。
1.2Sephadex LH-20的分離原理
Sephadex LH-20的分離原理主要有兩方面:(1)利用分子排阻色譜原理,根據(jù)凝膠的孔徑和被分離化合物分子的大小達到分離目的。凝膠是具有多孔隙網(wǎng)狀結構的固體物質(zhì),被分離物質(zhì)的分子大小不同,它們能夠進入凝膠內(nèi)部的能力也就不同,當混合物溶液通過凝膠柱時,小分子可自由進入凝膠內(nèi)部,大分子不能進入凝膠內(nèi)部,只能通過凝膠顆粒間隙。因此,分子大小不同的物質(zhì)在凝膠過濾色譜中的移動速率出現(xiàn)差異,而達到分離。(2)Sephadex LH-20對化合物還起分配色譜的作用,若Sephadex LH-20在有機溶劑中膨潤,則極性大的化合物保留弱,先被洗脫下來,極性小的化合物保留強,后出柱。
1.3Sephadex LH-20洗脫溶劑的選擇及樣品處理
要根據(jù)被分離物質(zhì)的極性選擇 Sephadex LH-20的洗脫溶劑:以甲醇-水系統(tǒng)最為常見,先用水,逐漸增加甲醇比例,最后用100%甲醇沖柱。對于樣品的處理,如果樣品極性大,則選用反相溶劑洗脫,將樣品用盡可能少的甲醇-水溶解,過濾后,濕法上樣。如果樣品極性小,則選用正相溶劑洗脫,樣品用最少體積的氯仿-甲醇溶解,過濾后,濕法上樣。
2.1使用前溶脹
Sephadex LH-20在使用之前必須要進行溶脹,而且在溶脹的過程中,要盡量避免過分攪拌,否則會破壞球形顆粒。方法:在室溫下,將凝膠溶脹于層析溶劑中至少3h,溶脹后凝膠體積的大小取決于所使用的溶劑系統(tǒng),使溶脹體積沉降后占總體積的75%,上層溶劑占25%[2]。
2.2再生與保存
Sephadex LH-20價格比較昂貴,使用過的Sephadex LH-20可以反復再生使用。再生處理方法:使用稀酸、稀堿及水反復再生處理,即可恢復樹脂的吸附能力。保存方法:短期不用時可以水洗→含水醇洗(醇的濃度逐步遞增)→醇洗,最后泡在醇中貯于磨口瓶中備用。若長期不用時,可在以上處理基礎上,減壓抽干,再用少量乙醚洗凈抽干,室溫充分揮散至無醚味后,60~80℃干燥后,保存即可。
表1 Sephadex LH-20在常用溶劑中的膨脹體積和溶劑吸收率Tab.1 Expanding volume and solvent absorption of Sephadex LH-20 in common solvents
3.1分離純化苯丙素類化合物
苯丙素是一類具有C6-C3芳香核骨架的天然產(chǎn)物,是多種天然藥物的有效成分之一,包括苯丙烯、苯丙醇、香豆素等天然芳香族化合物。佛手在我國已有400多年的種植和應用歷史,是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材。采用SephadexLH-20等方法對佛手所含化合物進行分離純化,采用氯仿-甲醇(1∶1)洗脫,結果從川佛手中分離得到6個香豆素類化合物,分別為:檸檬內(nèi)酯、6,7-二甲氧基香豆素、5-異戊烯氧基-7-甲氧基香豆、5-羥基-7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素、6-羥基-7-甲氧基香豆素、佛手柑內(nèi)酯[3,4]。綠原酸是由咖啡酸和奎寧酸組成的縮酚酸,屬于苯丙素類化合物,用Sephadex LH-20層析柱對其進行純化,洗脫條件為:先用上樣體積8倍的pH值為3.0的HCl快速沖洗,再改用10倍上樣體積的蒸餾水洗脫,其次用15倍上樣體積的0.5%乙酸乙酯水溶液洗脫,最后直接用50%乙醇洗脫到柱子干凈為止。收集乙酸乙酯分離餾分,可得純度達98.3%綠原酸,得率大于35%[5]。
3.2分離醌類化合物
醌類化合物是一類含有醌式結構的天然產(chǎn)物,主要分布在廖科、茜草科、豆科等植物中。茜草有涼血、祛瘀、止血、通經(jīng)之效,對其化學成分進行分離研究,采用SephedexLH-20凝膠柱色譜等方法從茜草根莖乙醇提取物中分離鑒定了12個蒽醌類化合物,經(jīng)鑒定,分別為:1-羥基-2-甲基蒽醌、1,4-二羥基-2-甲基蒽醌、2,3-二甲基-1,4-二羥基蒽醌、1,3-二羥基 -2-乙氧基甲基 9,10-蒽醌、ω-hydroxypachybasin,cordifoliol[6]。白花丹參對血栓閉塞性脈管炎具有獨特療效,對白花丹參的化學成分進行分離研究,采用SephedexLH-20柱層析等方法從該植物中分離得9個丹參酮類化合物:二氫丹參酮I、次甲丹參醌、1,2一二氫丹參醌、次甲二氫丹參醌、1,2,15,16-四氫丹參醌、丹參新醌乙、Arucadiol、丹參酮IIB、羥基次甲丹參醌[7]。
3.3分離純化黃酮類化合物
黃酮類化合物主要是指基本母核為2-苯基色原酮的一系列化合物,這類化合物大多呈黃色或淡黃色。大豆中的大豆異黃酮主要成分是染料木苷和黃豆苷,二者的結構相似,利用Sephadex LH-20柱可以有效分離純化染料木苷和黃豆苷。分離過程中選用40%的甲醇水溶液做洗脫劑,上樣前,凝膠柱用兩倍柱容積的10%甲醇平衡。流速恒定為1mL·min-1。其中最佳分離條件為40%的甲醇水溶液做洗脫劑,上樣量為100mL。分離得染料木苷和黃豆苷,經(jīng)分析得到了單一峰,二者最終純度均大于90%[8]。黃酮為鳳尾草所含的主要化學成分之一,應用Sephadex LH-20柱色譜對鳳尾草化學成分進行分離、純化,結果從鳳尾草乙酸乙酯分離了9個黃酮類化合物,分別為芹菜素,芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷,野漆樹苷,芹菜素7-O-β-D-葡萄糖-4'-O-α-L-鼠李糖苷,新西蘭牡荊苷,木犀草素,木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷,忍冬苷,木犀草素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷[9]。
3.4分離生物堿類化合物
生物堿是一類含氮的有機化合物,分布于植物界的50多個科的120多個屬中,如毛茛科黃連、胡椒科蔞葉、石蒜科紅花石蒜等。蔞葉具有破痰積、治心腹蟲痛等作用,利用SephadexLH-20柱色譜法等分離手段,從蔞葉莖70%丙酮提取物的乙酸乙酯層中分離得到8個生物堿類化合物,鑒定為胡椒堿,墻草堿,N-isobutyl-2E,4E-dodecadienamide,piperdardine,dehydropipernonaline,piperolein-B,guineensine[10]。利用SephadexLH-20柱層析等方法對紅花石蒜中的生物堿成分進行分離純化,從中分離得6個單體化合物,分別是:小星蒜堿,二氫石蒜堿,lycoramine,6-O-ethyllycorenine,homolycorine,O-demet hylhomolycorine[11]。
3.5分離純化萜類化合物
萜類化合物就是指存在自然界中、分子式為異戊二烯單位的倍數(shù)的烴類及其含氧衍生物,存在于多種中草藥中,如柴胡、三七、楓楊等。楓楊具有抗腫瘤、抗病毒、治療牛皮癬等藥理作用,目前關于楓楊化學成分的報道卻很少,采用SephadexLH-20及重結晶等方法對楓楊樹皮、90%乙醇提取物的氯仿和乙酸乙酯萃取層進行分離純化。結果分離得到7個三萜類化合物,鑒定為:算盤子酮、羽扇豆-1β, 3β-二醇、烏蘇酸、白樺脂酸、30-norlupan-28-oic acid、楊齊墩果酸、2α,3β,19α-trihydroxurs-12-en-28-O-β-D-glucopyranoside[13]。橄欖苦苷屬于無毒的苯酚類裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類化合物,利用Sephadex LH-20分離純化橄欖苦苷,具體方法為:稱取SephadexLH-20(50~100目)20g,加入蒸餾水100mL,浸泡過夜,進行溶脹。SephadexLH-20層析柱的直徑與柱長之比為1∶1,純化流速1mL·min-1。橄欖苦苷經(jīng)過二次過柱,其純度可達82.9%[14]。
Sephadex LH-20可用于多種天然成分的提取分離,并且具有操作簡便快捷,分離純度高,得率大、可重復利用等優(yōu)點。在這里對使用Sephadex LH-20時仍需注意的問題進行了總結:(1)流速不可太快,柱子盡可能長,Sephadex LH-20柱長的增加將極大地改善分離。(2)餾分一定要接的細,可1/10,或1/20個保留體積接一餾分。洗脫體積一般為2-3個保留體積,對特殊保留強的化合物,可洗脫5個保留體積。(3)對于具有熒光性質(zhì)的化合物,可在層析柱兩端加紫外燈照射,便于檢測該類化合物的流向。(4)填料反復使用,每次用完,可用甲醇將柱子洗干凈,然后用下一次分離的起步溶劑將甲醇替換出來,待用。
本文對SephadexLH-20的特性、分離原理、使用方法及應用實例進行綜述,并完善了凝膠濾過法在藥物生產(chǎn)中的應用,為SephadexLH-20在藥物的分離純化方面的應用提供有利的參考。
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Application of dextran gel Sephadex LH-20 in separation and purification of natural products*
CHEN Ya-jun,GAO Yan,YANG Chun-juan,SU Xiao-lin,WANG Meng,WANG Zhi-bing
(Key Laboratory of Basic and Applied Research in North Medicine,Ministry of Education,Heilongjiang Key Laboratory of Drug Efficacy Study Material of Traditional Chinese Medicine and Natural Product,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)
Gel filtration chromatography is one of the effective methods to isolate and purify natural products,Sephadex LH-20 is one of the most commonly used dextran gel,It has the advantages of simple operation,high separation purity,and is suitable for many kinds of organic solvents,can be used for separation and purification of the natural products of the natural products such as,phenylpropanoids,quinones,flavonoids,alkaloids and triterpenoid Saponins.In this paper,the separation principle and characteristics of Sephadex LH-20 and its application in the separation and purification of natural products are summarized,It provides an important reference for the study of the separation and purification and the actual production.
sephadex LH-20;phenylpropanoids;quinones;flavonoids;alkaloids;terpenes?
R284.2
A
10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20160853
2016-03-25
黑龍江省省留學歸國人員科學基金(LC2012C15;LC20150 31),黑龍江中醫(yī)藥大學“優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計劃”科研項目(2012RCD05);國家自然科學基金面上項目(81573551);教育部高等學校博士學科點專項科研基金資助課題(2013232 7120002)
陳亞軍(1992-),女,在讀碩士研究生,研究方向:中藥藥效物質(zhì)基礎。
王知斌(1976-),男,副教授,主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎和新藥臨床前藥學研究。