陳江生　陳保東　凌畢益　宋明浩　李志祥

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·論著·

葛根素在減輕創(chuàng)傷性腦損傷氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用

陳江生陳保東凌畢益宋明浩李志祥

目的探究葛根素是否能有效減輕創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)中的氧化應(yīng)激反應(yīng)。方法選擇成年雄性SD大鼠60只構(gòu)建TBI模型并隨機平分為模型組，假手術(shù)組及葛根素給藥組(給藥組)，每組20只。檢測3組大鼠在不同時間點氧化應(yīng)激相關(guān)指標[超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)]活性及含量變化。結(jié)果氧化應(yīng)激相關(guān)指標檢測中，給藥組與模型組比較，其中第3、7天SOD、CAT活性以及MDA、NO含量與同時間點模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。用藥組與模型組比較，均能不同程度升高GSH含量及GSH-Px活性(P<0.05)，其中給藥組第3天及第7天GSH含量及GSH-Px活性較同時間點模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論根據(jù)對不同氧化應(yīng)激指標檢測所得結(jié)果可以看出葛根素可有效減輕創(chuàng)傷性腦損傷所帶來的氧化應(yīng)激損傷。

葛根素；創(chuàng)傷性腦損傷；氧化應(yīng)激指標；氧化應(yīng)激損傷

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是神經(jīng)外科的常見病，有高發(fā)病率，高致殘率和高病死率的特點[1]，目前已成為影響人類健康的重要原因。已有研究表明，葛根素作為一種天然抗氧劑可有效減輕TBI動物模型中的神經(jīng)功能缺損等情況[2,3]，但其具體機制尚未得知，因此本研究通過建立經(jīng)典TBI模型，研究在葛根素給藥的條件下，檢測腦內(nèi)各種氧化應(yīng)激相關(guān)指標的變化，以期了解葛根素是否通過清除氧自由基，有效減輕TBI中的氧化應(yīng)激損傷。

1　材料與方法

1.1主要試劑及儀器超氧化物歧化酶試劑盒(SOD)、 谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒 (GSH-Px)， 過氧化氫酶試劑盒(CAT)、丙二醛試劑盒(MDA)(南京建成生物工程研究所，批號：20080829，20080801，20071129，20080801)。

1.2實驗分組及TBI模型構(gòu)建[4,5]選擇健康成年雄性SD大鼠60只[廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證：SCXK(粵)2015-0035]，體重250～300 g，將所選取SD大鼠分為模型組，假手術(shù)組及葛根素治療組(給藥組)，每組20只。采用BenchmarkTM顱腦損傷撞擊器制作TBI模型，將已禁食12 h的大鼠腹腔注入2%戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉后，將老鼠俯臥固定于支架處開，將骨膜剝離，暴露出右頂骨。矢狀縫中線旁開2.5 mm，在人字縫與冠狀縫中鉆一直徑為5 mm骨孔，暴露出硬腦膜。于腦立體定位儀上安裝電磁顱腦損傷撞擊器的傳動裝置，經(jīng)使用腦立體定位儀操縱臂使撞擊頭與鼠頭矢狀面呈80°，與冠狀面平行呈垂直在大鼠硬腦膜上固定，使硬腦膜與撞擊頭末端相垂直。經(jīng)撞擊器設(shè)置，用5 mm直徑的撞擊頭，且以 3 m/s 速度，2 mm打擊深度，120 ms打擊時間中制作中度TBI。后應(yīng)立即將撞擊器移除，縫合頭皮切口。在出現(xiàn)自主呼吸恢復(fù)后，大鼠重新進入飼養(yǎng)籠，行損傷后觀察，假手術(shù)大鼠手術(shù)與麻醉程序同上，但無沖擊損傷過程。對于給藥組的大鼠，在模型制作后15 min，腹腔注射葛根素(60 mg/kg)。

1.3測定方法及指標大鼠腦損傷12 h后，提取大鼠損傷側(cè)皮層組織，置于冰上勻漿后，根據(jù)南京建成生物工程公司試劑盒說明書方法測定與氧化應(yīng)激相關(guān)指標如 SOD、GSH-Px、CAT、MDA的含量[5]。

2　結(jié)果

2.13組不同時間點大鼠腦組織中SOD、CAT活性及MDA含量變化各個時間點模型組與假手術(shù)組相比，腦組織中SOD、CAT含量明顯降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)，NO含量降低(P<0.05)，表明損傷使機體清除自由基能力下降，呈現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)。隨著實驗時間的延長，模型組SOD及CAT活性上升及MDA含量降低，提示動物體內(nèi)有一定的自身抗氧化作用。給藥組與模型組比較，其中第3、7天SOD、CAT活性以及MDA、NO含量與同時間點模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、2，圖1、2。

組別SOD1d3d6dCAT1d3d6d假手術(shù)組54.81±6.5953.66±7.1252.81±6.4396.12±66.2994.33±68.9193.00±66.33模型組32.26±4.53*35.75±5.80*40.96±7.12*70.23±59.20*72.08±60.22*79.64±60.58*給藥組29.33±5.36*44.76±5.72#50.58±7.63#70.10±62.77*85.21±61.10#89.58±66.20#

注：與假手術(shù)組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05

組別MDA(nmol·mg-1·pro·-1)1d3d6dNO(μmol·g-1·pro-1)1d3d6d假手術(shù)組1.69±0.681.74±0.881.73±0.921.53±0.241.52±0.331.53±0.32模型組2.89±0.73*2.45±0.69*2.38±0.19*1.27±0.26*1.28±0.27*1.25±0.30*給藥組2.90±0.66*2.27±0.65#1.81±0.46#1.26±0.29*1.50±0.31#1.77±0.32#

注：與假手術(shù)組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05

圖1　不同時間點3組大鼠腦組織中SOD、CAT活性變化結(jié)果

圖2　不同時間點3組大鼠腦組織MDA、NO含量變化結(jié)果

2.2不同時間點3組大鼠腦組織GSH含量、GSH-Px活性各個時間點模型組與假手術(shù)組比,腦組織GSH含量及GSH-Px活性明顯降(P<0.05),表明腦損傷造成機體清除自由基能力下降,呈現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)。隨著實驗進程延長,模型組指標有上升趨勢。各用藥組與模型組比較,均能不同程度明顯升高GSH含量及GSH-Px活性(P<0.05),其中給藥組第3天第7天兩指標均與與同時間點模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3，圖3。

組別GSH(nmol/mg)1d3d6dGSH-Px(U/mg)1d3d6d假手術(shù)組40.10±3.6839.82±1.2140.67±2.16200.31±34.67205.25±22.84192.89±31.32模型組29.76±3.22*31.15±3.74*33.92±3.30*139.41±26.10*148.27±19.09*161.58±36.41*給藥組28.92±2.21*36.83±4.37#36.83±2.15#152.73±41.0*169.63±32.95#191.52±29.42#

注：與假手術(shù)組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05

圖3　不同時間點各組大鼠腦組織GSH含量和GSH-Px活性結(jié)果

3　討論

TBI專指一類由外傷導(dǎo)致腦組織嚴重損害的疾病[6],近年來,很多研究表明,氧化應(yīng)激在TBI中發(fā)揮著重要的作用[7]。TBI后，腦組織會發(fā)生缺血缺氧等一系列繼發(fā)性癥狀，在此過程中會產(chǎn)生大量的氧自由基，當產(chǎn)生的ROS超過機體的抗氧化能力時，就會產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終引起神經(jīng)元的損傷。血管內(nèi)皮是對氧化應(yīng)激最敏感的部位，ROS主要通過對過氧化細胞膜上的脂質(zhì)及其分解產(chǎn)物丙二醛(MDA)造成對血管內(nèi)皮細胞的損傷,MDA通過增加胞內(nèi)Ca2+濃度,消耗Ca2+內(nèi)流所需ATP，降低一氧化氮的分泌，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能受損[8]。MDA，NO的含量即可間接反映細胞受損傷的程度，因此本實驗一一對各項指標進行檢測。正常血管內(nèi)皮細胞具有清除過量ROS并抗氧化的系統(tǒng),包括CAT、GSH-Px[9]、SOD等多種抗氧化酶及自由基清除劑，這些抗氧化酶在血管內(nèi)皮細胞受到氧化應(yīng)激損傷時發(fā)揮重要的保護作用。GSH是人類細胞中自然合成的一種極其重要的非酶類抗氧化物質(zhì)，可防止體內(nèi)眾多重要酶蛋白琉基被氧化。它可以作為GSH-Px催化反應(yīng)中的底物,在GSH-Px的催化下使H2O2降解,也可以通過非酶促反應(yīng)形式與氧自由基結(jié)合。從而發(fā)揮在氧化應(yīng)激反應(yīng)中保護生物大分子作用。本實驗結(jié)果顯示:模型組SOD及CAT活性上升及MDA含量降低，提示動物體內(nèi)有一定的自身抗氧化作用。給藥葛根素組與模型組比較，其中第3、7天SOD，CAT活性與同時間點模型組比活性升高且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，第3、7天MDA，NO含量與同時間點模型組相比含量降低且各用藥組與模型組比較,均能不同程度明顯升高GSH含量及GSH-Px活性(P<0.05)，這些結(jié)果均表明，給藥葛根素后，葛根素可有效的激活體內(nèi)SOD、CAT等酶的抗氧化活性，從而極大的降低了MDA對神經(jīng)元等的損傷。氧化損傷的敏感性使得機體有一套內(nèi)源性抗氧化酶防御體系用來調(diào)節(jié)體內(nèi)的氧化還原平衡，近年來有研究顯示Nrf2-ARE通路是細胞內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化防御機制之一，且Nrf2是細胞調(diào)節(jié)該抗氧化防御機制的至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，因此在接下來的研究中通過對模型組和葛根素治療組中Nrf2蛋白的表達及觀察Nrf2-ARE信號通路[10,11]下游抗氧化和解毒酶HO-1、NQO1的表達水平進行研究以探究葛根素通過何種信號通路來對抗氧化所帶來的神經(jīng)元等的損傷，為葛根素的后續(xù)研究能提供新的理論基礎(chǔ)。

1Wei L,Fraser JL,Lu ZY,et al.Transplantation of hypoxia preconditioned bone marrow mesenchymal stem cells enhances angiogenesis and neurogenesis after cerebral ischemia in rats. Neurobiol Dis,2012,46:635-645.

2Sriram N,Kalayarasan S,Sudhandiran G.Epigallocatechin-3-gallateaugments Antioxidant activities and inhibits inflammation during bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis through Nrf2-Keapl signaling.Pulm Pharmacol Ther,2009,22:221-236.

3Afonyushkin T,Oskolkova OV,Philippova M,et al. Oxidized phospholipids regulate expression of ATF4 and VEGF in endothelialcells via NRF2-dependent mechanism: novel point of convergencebetween electrophilic and unfolded protein stress pathways.Arterioscler Thromb Vase Biol,2010,30:1007-1013.

4楊彥玲,陳雅慧.大鼠大腦中動脈線栓法制備局杜性腦缺血模型的研究現(xiàn)狀.臨床神經(jīng)電生理學(xué)雜志,2007,16:374-376.

5Shuaib A,Butcher K,Mohammad AA,et al.Collateral blood vesselsin acute ischaemic stroke: a potential therapeutic target. Lancet Neurology,2011,10:909-921.

6Pizent A,Pavlovic M,Jurasovic J,et al.Antioxidants,trace elements andmetabolic Syndrome in elderly subjects.J Nutr Health Aging,2010,14:866-871.

7蔡雅衛(wèi)，張岫美，魏欣冰.乙酰葛根素對低糖低氧/復(fù)供損傷大鼠大腦皮層神經(jīng)元凋亡的影響.中國中醫(yī)藥科技，2013，20： 155-156.

8Leonarduzzi G,Sottero B,Poli G.Targeting tissue oxidative damage by means of eell signaling modulators:the antioxidant concept revisited. Pharmaeol Ther,2010,128:336-374.

9陳遠壽,劉華慶,潘貴書,等.還原型谷腕甘肽對腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元泛素蛋白結(jié)合物表達的影響.解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2010,35:1205-1208.

10催俁，馬海英，孔力． Nrf2/ARE 通路與機體抗氧化機制的研究進展.吉林大學(xué)學(xué)報醫(yī)學(xué)版，2011，37:187.

11Chen G,Fang Q, Zhang J, et al. Role of the Nrf2-ARE pathway in early brain injury after experimental subarachnoid hemorrhage.J Neurosci Res,2011,89:515-523.

Effects of puerarin on oxidative stress injury in rats with traumatic brain injury

CHENJiangsheng*,CHENBaodong,LINGBiyi*,etal.

*DepartmentofNeurosurgery,SonggangPeople’sHospital,Bao’anDistrict,Guangdong,Shenzhen518105,China

ObjectiveTo investigate the effects of puerarin on oxidative stress injury in rats with traumatic brain injury (TBI).MethodsSixty adult male SD rats were randomly divided into model group, sham-operation group and puerarin medication group,with 30 rats in each group. The oxidative stress related indexes including superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT), malondialdehyde (MDA) were detected in different time points for the three groups.ResultsThere were significant differences in the activities of SOD,CAT and the contents of MDA,NO on 3d,7d between model group and puerarin medication group (P<0.05).The contents of GSH and activities of GSH-Px in puerarin medication group were significantly increased,as compared with those in model group (P<0.05),moerover, there were significant differences in contents of GSH and activities of GSH-Px on 3d,7d between model group and puerarin medication group (P<0.05).ConclusionPuerarin can effectively decrease the oxidative stress injury caused by traumatic brain injury in rats.

puerarin; traumatic brain injury; oxidative stress indexes; oxidative stress damage

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.18.007

518105廣東省深圳市寶安區(qū)松崗人民醫(yī)院神經(jīng)外科(陳江生、凌畢益、宋明浩、李志祥)；廣東省深圳市第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科(陳保東)

R 651.15

A

1002-7386(2016)18-2748-03

2016-02-26)

項目來源：深圳市科技創(chuàng)新委員會科技計劃項目(編號：JCYJ20150403115305748)