吳周林，曾　予，賈先波，陳仕毅，王　杰，賴松家

(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，四川 溫江 611130；2 四川民族學(xué)院 環(huán)境與生命科學(xué)系，四川 康定 626001)

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家兔XKR4基因遺傳多態(tài)性及其與生長(zhǎng)性能的相關(guān)性

吳周林1，2，曾予1，賈先波1，陳仕毅1，王杰1，賴松家1

(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，四川 溫江 611130；2 四川民族學(xué)院 環(huán)境與生命科學(xué)系，四川 康定 626001)

【目的】 研究家兔XKR4基因的遺傳多態(tài)性，并分析其與家兔生長(zhǎng)速度的相關(guān)性。【方法】 以新西蘭兔(184只)和伊拉兔(193只)為研究材料，取其耳部組織，提取DNA，PCR擴(kuò)增XKR4基因，采用直接測(cè)序法尋找CDS區(qū)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，利用HRM技術(shù)對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行分型，并分析其與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】 在家兔XKR4基因內(nèi)檢測(cè)到3個(gè)SNP位點(diǎn)(內(nèi)含子1中的c.804-8C>T及外顯子3中的c.1668C>T和c.1698C>T)。針對(duì)外顯子3中的2個(gè)SNP位點(diǎn)，對(duì)40個(gè)樣本直接測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅存在CC和CT 2種基因型，且處于完全連鎖狀態(tài)。對(duì)2種兔突變位點(diǎn)的群體遺傳參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)其總雜合度為0.287 1，總有效等位基因數(shù)為1.402 7，多態(tài)性屬于中等多態(tài)，表明該群體在該位點(diǎn)的遺傳變異較高，有較大的選擇潛力，可以利用該位點(diǎn)進(jìn)行與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的標(biāo)記輔助選擇。關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，CTCT單倍型個(gè)體70日齡體質(zhì)量顯著高于CCCC單倍型個(gè)體(P<0.05)，且35到70日齡平均日增重極顯著高于CCCC單倍型個(gè)體(P<0.01)?！窘Y(jié)論】XKR4基因可作為影響家兔生長(zhǎng)性狀的候選基因。

XKR4基因；單核苷酸多態(tài)性；生長(zhǎng)速度；家兔；關(guān)聯(lián)性分析

在人類(lèi)紅細(xì)胞中，Kell蛋白是重要的Ⅱ型膜糖蛋白，屬于具有鋅肽鏈內(nèi)切酶功能的腦啡肽酶(M13)家族成員，具有內(nèi)皮素3轉(zhuǎn)化酶活性。在紅細(xì)胞膜上，Kell蛋白與XK蛋白通過(guò)共價(jià)二硫鍵而相互作用，與紅細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)，可運(yùn)輸多種血型抗原[1-3]。Kell蛋白參與多種生物學(xué)過(guò)程，主要包括通過(guò)影響血管平滑肌的增殖與收縮參與血壓調(diào)節(jié)；參與神經(jīng)細(xì)胞的遷移和分化，從而影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程等[4-6]，其突變與神經(jīng)系統(tǒng)異常有關(guān)[7-8]。

Kell血型系統(tǒng)相關(guān)亞單元家族(XKR)包括XKR4、XKR5、XKR6、XKR7、XKR8、XKR9共6個(gè)成員，其中XKR4在生物體內(nèi)除了與紅細(xì)胞膜功能、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)外，還參與到多種生物學(xué)過(guò)程中，如細(xì)胞代謝、脂肪和糖類(lèi)代謝及動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育等過(guò)程。Bolormaa等[9]和Neto等[10]研究發(fā)現(xiàn)，XKR4基因周?chē)皟?nèi)部所檢測(cè)到的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)與牛脂肪沉積的主效基因或數(shù)量性狀座位(QTL)密切相關(guān)[11-12]，是影響脂肪沉積的重要候選基因。此外，XKR4基因突變會(huì)影響牛平均日采食量、剩余采食量和平均日增重[13]，與牛的出生體質(zhì)量和成年體質(zhì)量相關(guān)[14]。然而，有關(guān)家兔XKR4基因多態(tài)性及其與生長(zhǎng)性狀關(guān)系的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)家兔XKR4基因的編碼序列(CDS)的SNP進(jìn)行了檢測(cè)，并分析其與家兔生長(zhǎng)速度的相關(guān)性，以期為提高家兔生長(zhǎng)速度提供分子育種標(biāo)記。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物為2個(gè)品種377只健康狀況良好、無(wú)患病記錄的家兔，由成都市愛(ài)華畜牧科技有限公司提供，其中新西蘭兔184只，伊拉兔193只。2品種兔在相同飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下，于28日齡斷奶后飼喂顆粒飼料(粗蛋白160 g/kg，消化能10.8 MJ/kg)，按照自由采食量的80%給料，自由飲水。記錄35日齡體質(zhì)量(W35)和70日齡體質(zhì)量(W70)，計(jì)算出35到70日齡的平均日增重(ADG)。剪取所有兔只耳組織，放入盛有體積分?jǐn)?shù)75%酒精的EP管中帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-20 ℃低溫保存。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA的提取用眼科剪剪取約綠豆大小耳組織塊，去毛后放入干凈EP管內(nèi)，充分?jǐn)囁椋肈NA提取試劑盒(TIANGEN，Beijing)提取基因組DNA，經(jīng)核酸蛋白分析儀分析，OD260/OD280值在1.7～1.8，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)無(wú)拖尾現(xiàn)象，表明其符合下一步試驗(yàn)要求。將合格的DNA于-20 ℃低溫冰箱保存，備用。

1.2.2XKR4基因的PCR擴(kuò)增參照GenBank上家兔XKR4基因的序列(GenBank登錄號(hào)為：NC_013671.1)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì) XK1～XK4共4對(duì)引物(表1)，用于XKR4基因CDS區(qū)序列的分段擴(kuò)增，引物由北京六合華大基因公司合成。

隨機(jī)選取40只個(gè)體，對(duì)其XKR4基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為10 μL，其中包括：2×TaqPCR MasterMix 5.0 μL，超純水3.2 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.4 μL，DNA模板1.0 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度依引物而定，見(jiàn)表1)，72 ℃延伸50 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.3PCR產(chǎn)物測(cè)序與SNP位點(diǎn)分析隨機(jī)取40只個(gè)體的PCR產(chǎn)物，直接送到北京六合華大基因公司測(cè)序，測(cè)序后使用DNAstar軟件進(jìn)行序列拼接，采用SeqMan軟件分析變異位點(diǎn)，確定每個(gè)個(gè)體各SNP位點(diǎn)的堿基類(lèi)型，并分析位點(diǎn)間的連鎖性。

1.2.4基因型的HRM分析高分辨率熔解曲線(HRM)是一種高分辨率、快速、不受檢測(cè)位點(diǎn)局限的主要用于SNP及突變分析的方法。針對(duì)在CDS區(qū)內(nèi)檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的HRM引物XKA(表1)，采用HRM技術(shù)對(duì)377只個(gè)體進(jìn)行基因型分析。在HRM過(guò)程中每次均設(shè)置雜合子基因型、純合子基因型以及空白樣作對(duì)照。HRM反應(yīng)體系為10 μL，其中包括：1×SosoFast Supermix 5 μL，XKA上、下游引物(10 pmol/μL)各0.4 μL，DNA模板1 μL，超純水3.2 μL。HRM反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性5 s，59.7 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃10 s后進(jìn)行熔解曲線分析，以每個(gè)循環(huán)上升0.2 ℃從65 ℃升溫至95 ℃。利用Rotor Gene Q儀器自帶的Precision Melt AnalysisTM軟件進(jìn)行基因型分析。

表 1　PCR引物、HRM引物信息Table 1　Information of the primers used for PCR and HRM analysis

1.2.5統(tǒng)計(jì)分析用SeqMan軟件分析XKR4基因的變異位點(diǎn)。通過(guò)直接計(jì)算求得等位基因頻率及基因型頻率。參照Nei等[15]的方法分析突變位點(diǎn)雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)及多態(tài)信息含量(PIC)。采用SPSS(13.0)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。各基因型對(duì)生長(zhǎng)性狀的影響采用最小二乘法分析，關(guān)聯(lián)分析采用SAS 9.2程序的一般線性模型進(jìn)行：

Yijkl=μ+Gi+Mj+Bk+eijkl。

式中：Yijkl代表各生長(zhǎng)性狀記錄值,μ為群體平均值，Gi為性別效應(yīng),Mj為XKR4基因型效應(yīng),Bk為品種效應(yīng),eijkl為隨機(jī)誤差。XKR4基因突變位點(diǎn)對(duì)表型的加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)分別用a和d表示，將 |d/a|的值用于評(píng)估不同差異水平下的基因效應(yīng)，其評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)文獻(xiàn)[16-17]，簡(jiǎn)言之，|d/a|<0.2，為加性效應(yīng)；|d/a|的值在0.2～1.2，為不完全顯性或顯性；當(dāng)|d/a|>1.2，為超顯性。

2　結(jié)果與分析

2.1家兔XKR4基因的多態(tài)性分析

對(duì)隨機(jī)選取的40只個(gè)體的XKR4基因進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，分析結(jié)果共發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNP位點(diǎn)，一個(gè)位于內(nèi)含子1內(nèi)，命名為c.804-8C>T，由于內(nèi)含子區(qū)堿基變異不會(huì)直接影響到蛋白質(zhì)的功能，因此下文未對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行基因分型；2個(gè)位于外顯子3內(nèi)，分別命名為c.1668C>T和c.1698C>T，這2個(gè)SNP位點(diǎn)均未引起氨基酸改變，屬于同義突變。針對(duì)外顯子3內(nèi)這2個(gè)同義突變SNP位點(diǎn)，在新西蘭兔和伊拉兔中均未檢測(cè)到TT基因型，僅檢測(cè)出CC和CT基因型，分析發(fā)現(xiàn)2位點(diǎn)完全連鎖，因此一共有CCCC和CTCT 2種單倍型組合，單倍型CCCC和CTCT分別代表了基因型CC和CT的遺傳信息。

2.2HRM分型結(jié)果

由圖1可知，HRM可將XKR4基因外顯子3內(nèi)c.1668C>T和c.1698C>T位點(diǎn)分為CC和CT 2種基因型，分型結(jié)果與所選40個(gè)個(gè)體直接測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果完全一致。對(duì)部分無(wú)法斷定的樣本重新分型以確定其基因型，最后通過(guò)HRM成功地確定377個(gè)個(gè)體的基因型和單倍型。

2.3家兔XKR4基因遺傳結(jié)構(gòu)及其與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性分析

根據(jù)HRM分型結(jié)果對(duì)家兔XKR4基因 c.1668C>T和c.1698C>T位點(diǎn)的群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果(表2)表明：新西蘭兔中CC和CT基因型個(gè)體分別有134和50只，伊拉兔中CC和CT基因型個(gè)體分別為112和81只；新西蘭兔和伊拉兔的優(yōu)勢(shì)基因型均為CC型，其基因型頻率分別為0.73和0.58，C等位基因的頻率分別為0.86和0.79。本研究中新西蘭兔和伊拉兔總?cè)后w雜合度(He)為0.287 1，有效等位基因數(shù)(Ne)為1.402 7，遺傳多態(tài)性(PIC=0.245 9)呈中度多態(tài)；χ2檢驗(yàn)結(jié)果表明，2品種兔群均偏離哈溫平衡狀態(tài)。

關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果(表3)表明，XKR4基因CDS區(qū)突變位點(diǎn)與家兔生長(zhǎng)性狀相關(guān)，CTCT單倍型個(gè)體70日齡體質(zhì)量(W70)為(1 745.29±17.78) g/只，顯著性高于CCCC型個(gè)體的(1 695.70±12.82) g/只(P<0.05)；CTCT單倍型個(gè)體35到70日齡平均日增重(ADG)為(27.85±0.48) g/日，極顯著高于CCCC單倍型個(gè)體的(25.98±0.34) g/日(P<0.01)?；?qū)Ρ硇椭档膶?shí)際效應(yīng)評(píng)估結(jié)果表明，W70的|d/a|=0.095，因此推斷該突變對(duì)表型值表現(xiàn)為加性效應(yīng)；ADG的|d/a|=5.07，為超顯性效應(yīng)。

圖 1　家兔XKR4基因型的HRM分析Fig.1　HRM analysis of XKR4 genotypes表 2　家兔XKR4基因外顯子3中c.1668C>T、c.1698C>T位點(diǎn)的遺傳結(jié)構(gòu)分析Table 2　Genetic structure analysis for SNP c.1668C>T and c.1698C>T of XKR4 exon 3

表 3　家兔XKR4基因外顯子3中突變位點(diǎn)各單倍型與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性分析Table 3　Associations of different mutation site haplotypes of XKR4 exon 3 with growth traits of rabbits

注：同行數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Notes:Different lowercase letters mean significant difference (P<0.05),while different uppercase letters mean extremely significant difference (P<0.01).

3　討　論

HRM首次由Witter等[18]提出，該方法采用飽和熒光染料，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物中DNA與飽和熒光染料的結(jié)合情況，來(lái)反映核酸的熔解過(guò)程，得到特征性的熔解曲線，再根據(jù)熔解曲線的變化來(lái)判斷核酸性質(zhì)的差異，其具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于SNP的檢測(cè)。由于不同DNA分子的片段長(zhǎng)度、GC含量以及堿基構(gòu)成不同，在加熱變性時(shí)，隨溫度變化而形成的特定熔解曲線不同，從而可以確定SNP的存在。用HRM技術(shù)進(jìn)行基因分型時(shí)，要求擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度在80～200 bp，且片段中只有一個(gè)變異位點(diǎn)時(shí)能獲得較好的結(jié)果。本試驗(yàn)針對(duì)家兔XKR4基因外顯子3中的2個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對(duì)HRM引物，其分型結(jié)果準(zhǔn)確性高，與直接測(cè)序的結(jié)果完全一致。這可能與XKR4基因外顯子3中的2個(gè)SNP位點(diǎn)相距較近及單倍型種類(lèi)較少有關(guān)。

XKR4基因參與紅細(xì)胞膜的組成，雖然目前對(duì)其在動(dòng)物體內(nèi)的作用機(jī)制還不清楚，但有研究預(yù)測(cè)其主要參與細(xì)胞代謝、脂肪代謝以及糖類(lèi)代謝過(guò)程[19]。大量研究證明，牛BTA14一些區(qū)段很可能包含一些與采食量、肉質(zhì)性狀、生長(zhǎng)速度等相關(guān)的QTL[20-21]，在牛上XKR4基因位于BTA14內(nèi)且與Yuri T Utsunomiya等[14]報(bào)道的SNP相距僅17.6 kb，預(yù)測(cè)其突變可能與牛的體質(zhì)量以及屠宰性狀相關(guān)。已有研究證明，XKR4基因相關(guān)SNP位點(diǎn)與采食量、日增重、皮下脂肪厚度顯著相關(guān)，XKR4基因是影響牛生長(zhǎng)發(fā)育的候選基因。本試驗(yàn)研究了家兔XKR4基因的遺傳多態(tài)性，在外顯子3內(nèi)共發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP(c.1668C>T和c.1698C>T)位點(diǎn)，通過(guò)直接對(duì)小樣本測(cè)序發(fā)現(xiàn)二者完全連鎖，這可能與家兔物種起源單一有關(guān)。本研究分析發(fā)現(xiàn)，位于XKR4基因外顯子3內(nèi)的突變對(duì)家兔的生長(zhǎng)速度有顯著影響，且缺少TT基因型，說(shuō)明TT基因型擁有非常低的頻率，這種現(xiàn)象顯示在人工選擇、遷移、遺傳漂變過(guò)程中，家兔種群中T等位基因呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)，因而在群體中不易發(fā)現(xiàn)TT突變型。同時(shí)筆者還推測(cè)，TT基因型可能是致病或致死基因型，從而在自然選擇中被淘汰。χ2適合性檢驗(yàn)是基于卡方分布的非參數(shù)檢驗(yàn)，用于判斷測(cè)定群體是否處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)。本研究所選取新西蘭兔和伊拉兔群體均偏離哈溫平衡狀態(tài)，這可能是由于新西蘭兔和伊拉兔群體規(guī)模有限所致，也可能是因?yàn)閷?duì)該群體進(jìn)行生長(zhǎng)速度等性狀的人工選擇所造成的，該結(jié)果反映出本試驗(yàn)所研究的2個(gè)位點(diǎn)容易受到人工選育、遷徙和遺傳漂變等因素的影響。同時(shí)，c.1668C>T和c.1698C>T在新西蘭兔(PIC<0.207 2)呈低度遺傳多態(tài)性，說(shuō)明新西蘭兔群遺傳多樣性偏低，這可能是由于新西蘭兔群長(zhǎng)期受到人工選擇所造成的；其在伊拉兔(PIC<0.276 6)呈中度遺傳多態(tài)性，說(shuō)明伊拉兔在這2個(gè)位點(diǎn)選擇潛力較大，可增加其分子遺傳的選擇力度，使其向人們期望的方向發(fā)展。關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果表明，XKR4的突變會(huì)顯著或極顯著提高家兔W70和ADG，這與Lindholm等[13]在牛上的研究結(jié)果一致。雖然該SNP突變位點(diǎn)沒(méi)有導(dǎo)致氨基酸的改變，可能的作用機(jī)制是同義突變影響了基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯或者蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能[22-23]，從而影響家兔的生長(zhǎng)速度，但其潛在的生物學(xué)功能對(duì)家兔上市體質(zhì)量、日增重的影響還需在更多品種和更大群體中進(jìn)一步研究。

由于本試驗(yàn)選取的家兔品種僅2個(gè)、樣本量偏小，且僅限于部分生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析，所以本結(jié)果還需進(jìn)一步驗(yàn)證，以便為家兔新品種的培育提供輔助選擇分子標(biāo)記。

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Polymorphisms of rabbitXKR4 gene and its association with growth traits

WU Zhoulin1,2,ZENG Yu1,JIA Xianbo1,CHEN Shiyi1,WANG Jie1,LAI Songjia1

(1CollegeofAnimalScienceandTechnology,SichuanAgriculturalUniversity,Wenjiang,Sichuan611130,China;2DepartmentofEnvironmentandLifeScience,SichuanMinzuCollege,Kangding,Sichuan626001,China)

【Objective】 This work aimed to investigate the polymorphisms of rabbitXKR4 gene and its association with growth traits.【Method】 New Zealand (184) and Ira (193) rabbits were selected.Genomic DNA was extracted from ear tissues for studying polymorphism ofXKR4 gene by PCR.The polymorphisms in CDS ofXKR4 were identified by direct sequencing,and the genotypes of candidate single nucleotide polymorphisms (SNPs) were confirmed by HRM method.Furthermore,the correlations with growth traits were analyzed.【Result】 A total of three SNPs (c.804-8C>T,c.1668C>T and c.1698C>T) were identified.For the two coding SNPs,there were two genotypes of CC and CT,which were completely linked by direct sequencing of 40 random rabbits from the two breeds.The total heterozygosity was 0.287 1 and the effective number of alleles was 1.402 7.The polymorphism information was at middle level in the two rabbit populations,indicating that the rabbit population had sufficient diversity for selection and improvement of production traits,and can be treated as markers.The association analysis revealed the individuals of CTCT haplotype had significantly higher body weight at 70 days than that of CCCC (P<0.05),and the average daily weight gain from 35 to 70 days was extremely significantly higher (P<0.01).【Conclusion】XKR4 is one of the candidate genes affecting growth traits of rabbits.

XKR4 gene;single nucleotide polymorphism (SNP);growth rate;rabbits;association analysis

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-07-1208:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.08.003

2015-01-04

四川省“十二五”畜禽育種攻關(guān)項(xiàng)目(2011NZ0099-4)；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-44-A-2)

吳周林(1991-)，男(土家族)，重慶萬(wàn)州人，碩士，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究。E-mail：wzlneil@126.com

賴松家(1965-)，男，成都金堂人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究。E-mail：lsj5791@263.net

S829.1

A

1671-9387(2016)08-0013-06

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