蓋林林　管立學(xué)　李海波　褚錦錦　張麗麗　譚　薇　王樂強1.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床檢驗診斷學(xué)山東省“十二五”高校重點實驗室，山東濰坊　6105；.山東省濰坊市人民醫(yī)院中心實驗室，山東濰坊　61041；.山東省濰坊市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，山東濰坊　61041

結(jié)核感染T細胞斑點試驗檢測胸腔積液和外周血對結(jié)核性胸膜炎的診斷價值

蓋林林1*管立學(xué)2*▲李海波2褚錦錦2張麗麗2譚薇3王樂強3
1.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床檢驗診斷學(xué)山東省“十二五”高校重點實驗室，山東濰坊261053；2.山東省濰坊市人民醫(yī)院中心實驗室，山東濰坊261041；3.山東省濰坊市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，山東濰坊261041

目的 評價結(jié)核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）檢測胸腔積液和外周血對結(jié)核性胸膜炎（TBP）的診斷價值。方法前瞻性納入2013年6月～2015年8月濰坊市人民醫(yī)院疑診為結(jié)核性胸腔積液患者84例，分離患者胸腔積液單個核細胞（PEMCs）及外周血單個核細胞（PBMCs）進行T-SPOT.TB檢測。比較兩種標(biāo)本MTB特異性抗原ESAT-6和CFP-10刺激后斑點形成細胞（SFCs）數(shù)量及其診斷特性，SFCs數(shù)量均值采用中位數(shù)（M）或四分位數(shù)間距（P25，P75）表示。結(jié)果 根據(jù)臨床診斷和分組標(biāo)準(zhǔn)，最終診斷TBP患者48例，非結(jié)核性胸膜炎（NTBP）患者36例；PBMCs和PEMCs T-SPOT.TB檢測診斷TBP的靈敏度為81.3%和97.9%（P＜0.05），特異性為88.9%和80.6%（P＞0.05），陽性預(yù)測值為90.7%和 87.0%（P＞0.05），陰性預(yù)測值為78.1%和97.6%（P＜0.05）。TBP患者PEMCs標(biāo)本中ESAT6和CFP10的SFCs分別為1350（103.3，2750.0）、757.5（51.3，2512.5），PBMCs中分別為49.0 （5.0，420.0）、39.5（4.3，390.5），PEMCs標(biāo)本中形成的斑點數(shù)量顯著高于PBMCs標(biāo)本（4～15倍）（Z=4.7，P＜0.05；Z =4.3，P＜0.05）。結(jié)論 PEMCs T-SPOT.TB檢測對診斷TBP的靈敏度和陰性預(yù)測值高于PBMCs，但特異性和陽性預(yù)測值低于PBMCs，PEMCs和PBMCs同步檢測臨床診斷價值更大。

結(jié)核性胸膜炎；結(jié)核感染T細胞斑點試驗；胸腔積液；外周血；診斷價值

結(jié)核性胸膜炎（tuberculous pleurisy，TBP）是一種常見的肺外結(jié)核，約占滲出性胸腔積液病因的54.8%［1］，結(jié)核分枝桿菌直接侵入胸膜或經(jīng)淋巴管血行播散至胸膜是該病的主要發(fā)病機制。TBP缺乏特異性臨床表現(xiàn)，早期診斷存在一定難度，傳統(tǒng)的實驗室診斷方法陽性檢出率低［2-3］，胸膜活檢因有創(chuàng)傷性難以廣泛應(yīng)用。結(jié)核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）是近年來發(fā)展起來的一種診斷結(jié)核病的細胞學(xué)檢測技術(shù)，它是應(yīng)用MTB特異性抗原（ESAT-6、CFP-10）體外刺激單個核細胞，通過檢測分泌γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）的特異性致敏T細胞數(shù)量來判斷是否存在結(jié)核菌感染，不受卡介苗接種和非結(jié)核分枝桿菌的影響，其敏感性和特異性均高于其他常規(guī)檢測方法［4-5］。本研究應(yīng)用 T-SPOT.TB技術(shù)檢測胸腔積液單個核細胞（Pleural effusion mononuclear cells，PEMCs）和外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中效應(yīng)T細胞數(shù)量，評價PBMCs和PEMCs標(biāo)本T-SPOT.TB檢測對TBP的臨床診斷價值。

1　資料與方法

1.1一般資料

前瞻性納入2013年6月～2015年8月濰坊市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科、胸外科、腫瘤內(nèi)科和消化內(nèi)科住院疑診TBP患者84例，其中男53例，女31例，年齡18～84歲。根據(jù)患者臨床表現(xiàn)、病史及合并癥、影像學(xué)、細菌學(xué)和組織病理學(xué)檢查、胸水常規(guī)、生化、癌胚抗原等檢查，以及抗結(jié)核治療反應(yīng)，對所有病例進行診斷評估，研究對象均無艾滋病毒感染和嚴(yán)重的肝腎功能損傷。按照最終是否診斷為TBP分為TBP組和非TBP（NTBP）組。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1TBP診斷標(biāo)準(zhǔn) ①實驗室診斷:有細菌學(xué)和病理學(xué)診斷證據(jù)，如胸腔積液結(jié)核桿菌培養(yǎng)陽性，胸膜病理活檢發(fā)現(xiàn)干酪樣壞死等結(jié)核典型改變。②臨床診斷:有結(jié)核病史；有相應(yīng)的臨床表現(xiàn)，如發(fā)熱、盜汗、疲乏、刺激性干咳、胸痛等；穿刺胸腔積液為滲出液，其中淋巴細胞增多；腺苷脫氨酶活性增高；未見腫瘤細胞，且各項腫瘤標(biāo)志物陰性；結(jié)核菌素試驗強陽性；常規(guī)治療無效，經(jīng)抗結(jié)核治療2～4周好轉(zhuǎn)，最終確診［6］。

1.2.2NTBP診斷標(biāo)準(zhǔn)臨床排除結(jié)核病，并已確診為其他疾病，隨訪1～3個月無結(jié)核病表現(xiàn)者。

1.3方法

1.3.1外周血T-SPOT.TB檢測采集靜脈血5 mL于肝素抗凝管，充分混勻，送檢；淋巴細胞分離液分離PBMSCs，最后用AIM-V配制0.5 mL含有2.5×105/mL PBMCs的細胞懸液，每份標(biāo)本設(shè)陰性、A、B和陽性4個孔，分別加入AIM-V培養(yǎng)基、A抗原、B抗原和陽性對照各50 μL，每孔加稀釋好的PBMCs細胞懸液各100 μL，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱孵育16～20 h，PBS洗板4次；然后每孔加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，2～8℃孵育1 h；PBS洗板，加底物后常溫避光顯色7 min，蒸餾水終止反應(yīng)；37℃恒溫箱干燥10 min，顯微鏡下計數(shù)IFN-γ斑點形成細胞（SFCs）數(shù)量。

1.3.2胸腔積液T-SPOT.TB檢測收集新鮮胸腔積液20～25 mL（肝素鈉抗凝），PEMCs分離、檢測和SFCs計數(shù)同PBMCs方法。

1.3.3T-SPOT.TB判斷標(biāo)準(zhǔn) 當(dāng)陰性孔斑點數(shù)為0～5個時，A或B孔斑點數(shù)減去陰性孔斑點數(shù)≥6個為TSPOT.TB陽性；當(dāng)陰性孔斑點數(shù)為6～10個時，A或B孔斑點數(shù)≥2倍陰性孔斑點數(shù)為T-SPOT.TB陽性；同時陽性孔斑點數(shù)≥20個。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布計量資料的均數(shù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗；不符合正態(tài)分布的改用中位數(shù)（M）或四分位數(shù)間距（P25，P75）表示，兩組間比較采用非參數(shù)檢驗（秩和檢驗）。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1診斷情況

根據(jù)分組標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合其他檢查指標(biāo)和隨訪結(jié)果，最終TBP組患者48例，其中男29例，女19例；年齡18～84歲，單純性胸膜炎39例（81.3%），合并陳舊性肺結(jié)核4例（8.3%），合并免疫系統(tǒng)疾病2例（4.2%），合并高血壓1例（2.1%），合并肝硬化1例（2.1%），合并心包積液1例（2.1%）。NTBP組患者36例，其中男24例，女12例；年齡22～82歲；惡性腫瘤20例（55.6%），肺炎旁胸腔積液2例 （5.6%），甲亢2例（5.6%），糖尿病7例（19.4%），特發(fā)性肺間性肺炎1例（2.8%），心包積液2例 （5.6%），結(jié)締組織病1例（2.8%），肝功能不全1例（2.8%）。

2.2PEMCs和PBMCs兩種標(biāo)本T-SPOT.TB試驗對診斷TBP特性的比較

兩種特異性抗原ESAT6和CFP10聯(lián)合（ESAT6+ CFP10）檢測，PEMCs T-SPOT.TB試驗診斷TBP的靈敏度和陰性預(yù)測值顯著高于PBMCs（均P＜0.05），但特異性和陽性預(yù)測值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。TBP組中，1例患者PEMCs T-SPOT.TB檢測結(jié)果陰性，ESAT6和PCFP10的SCFs數(shù)量均為0，而其PBMCs的T-SPOT.TB檢測結(jié)果均為陽性，ESAT6和PCFP10的SCFs分別為72、23個。PBMCs-ESAT6和PBMCs-CFP10單抗原刺激SFCs數(shù)量對診斷TBP的靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；PEMCs-ESAT6和 PEMCs-CFP10單抗原刺激SFCs數(shù)量對診斷TBP的靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

表1　PBMCs和PEMCs標(biāo)本T-SPOT.TB試驗TBP的診斷情況比較

2.3PBMCs和PEMCs標(biāo)本MTB特異性抗原ESAT-6和CFP-10刺激SFCs數(shù)量比較

TBP患者組胸腔積液PEMCs-ESAT6和PEMCs-CFP10中SFCS數(shù)量顯著高于外周血PBMCs-ESAT6 和PBMCs-CFP10的SFCs數(shù)量，為4～15倍 （均P＜0.05），SFCs的 M值分別為 1350.0、757.5和 49.0、39.5；NTBP組胸腔積液PEMCs-ESAT6和PEMCs-CFP10形的斑點數(shù)量成與外周血PBMCs-ESAT6和PBMCs-CFP10斑點數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （均P＞0.05），SFCs的M值分別為1、0和0、0。TBP組外周血PBMCs-ESAT6和PBMCs-CFP10組SFCs顯著高于NTBP組 （均P＜0.05），TBP組胸腔積液PEMCs-ESAT6和PEMCs-CFP10形成的SFCs也顯著高于NTBP組（均P＜0.05）。見表2。

表2　兩組患者PBMCs和PEMCs標(biāo)本中ESAT-6 和CFP-10刺激后SFCs數(shù)量比較［2.5×105個，M（P25，P75）］

3　討論

結(jié)核性胸膜炎病情隱匿，缺乏特異性臨床表現(xiàn)，極易造成誤診漏診［7-10］。建立快速、準(zhǔn)確的診斷方法，是及時治療和控制結(jié)核病蔓延的關(guān)鍵。MTB感染后體內(nèi)長期存在抗原特異性的記憶性T細胞，當(dāng)再次遇到MTB特異性抗原時能迅速活化增殖，并釋放IFN-γ。T-SPOT.TB技術(shù)通過檢測產(chǎn)生IFN-γ的效應(yīng)T細胞數(shù)量，不受BCG接種和大多數(shù)環(huán)境中的非MTB影響，在診斷MTB潛伏感染（LTBI）具有較高的敏感性和特異性［11-12］。Li等［13］應(yīng)用Meta分析，納入的9項研究對T-SPOT.TB試驗診斷TBP的綜合靈敏度為93%，特異性為90%，認為T-SPOT.TB試驗是診斷TBP的一種有效方法。T-SPOT.TB在不同臨床表現(xiàn)的肺外結(jié)核中其診斷性能不一樣，呈慢性經(jīng)過表現(xiàn)的肺外結(jié)核敏感性較高（95%CI:83%～97%），對結(jié)核性腦膜炎和粟粒性肺結(jié)核的診斷敏感性較低 （95%CI: 66%～87%）［14］，即使在免疫力低下的HIV陽性結(jié)核患者中，T-SPOT.TB也仍然具有較高的敏感性（90%）［15］。近年來，關(guān)于T-SPOT.TB診斷TBP的研究報道較多［4，6，11，14，16-18］，但因納入的研究病例數(shù)、既往結(jié)核感染史、臨床表現(xiàn)等因素的影響，其敏感性和特異性有較大差異，敏感性在71%～96%，特異性為60%～100%。Lee等［16］報道，胸腔積液和外周血T-SPOT.TB診斷TBP的靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為 94.7%、85.7%、85.7%、94.7%和77.8%、90.5%、87.5%、82.6%，認為T-SPOT.TB能準(zhǔn)確地診斷結(jié)核性胸膜炎，更適合于不能做胸膜活檢或胸膜活檢陰性患者的診斷。王美芳等［17］報道，胸腔積液和外周血T-SPOT.TB對診斷TBP的靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為94.4%、95.4%、97.1%、91.3%和83.3%、90.9%、93.7%、76.9%。本研究結(jié)果顯示，PEMCs T-SPOT.TB對診斷TBP的靈敏度和陰性預(yù)測值 （97.9%和97.6%）顯著高于PBMCs（81.3%和78.1%）（P＜0.05），特異性和陽性預(yù)測值 （80.6%和87.0%）則低于PBMCs（88.9%和90.7%）（P＞0.05），與Lee等［16］的研究結(jié)果基本一致。TBP組中1例患者PEMCs T-SPOT.TB結(jié)果陰性，而PBMCs T-SPOT. TB結(jié)果為陽性，抗癆治療4個月，病人康復(fù)出院。提示PEMCs和PBMCs T-SPOT.TB檢測不能相互取代，二者同步檢測臨床診斷價值會更大。TBP患者組PEMCs-ESAT6和PEMCs-CFP10組SFCs數(shù)量顯著高于外周血PBMCs-ESAT6和PBMCs-CFP10組SFCs數(shù)量（4～15倍）。這可能與急性感染期間特異性效應(yīng)T細胞主要集中在感染部位，外周血中相對較少有關(guān)［16］。PBMCs-ESAT6和CFP10及PEMCs-ESAT6 和CFP10單抗原刺激SFCs數(shù)量對診斷TBP的靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。PEMCs T-SPOT.TB特異性和陽性預(yù)測值相對較低，可能與既往結(jié)核感染史、合并結(jié)核、LTBI、藥物應(yīng)用等因素相關(guān)［19-21］，本研究中7例假陽性結(jié)果，其中3例腫瘤患者既往有結(jié)核病史，2例有明確結(jié)核接觸病史，1例腫瘤合并繼發(fā)性肺結(jié)核，PEMCs T-SPOT.TB診斷特異性低可能與此相關(guān)。

綜上所述，胸腔積液T-SPOT.TB檢測與外周血比較，對診斷TBP有較高的靈敏度和陰性預(yù)測值，但特異性和陽性預(yù)測值低于外周血，對胸腔積液渾濁和/或接受胸腔局部藥物灌注治療的患者，同時檢測外周血T-SPOT.TB臨床診斷價值更大。

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Diagnostic value of T-SPOT.TB assay performance of pleural effusion and peripheral blood for tuberculous pleurisy

GAI Linlin1*GUAN Lixue2*▲LI Haibo2CHU Jinjin2ZHANG Lili2TAN Wei3WANG Leqiang3
1.Institutional Key Laboratory of Clinical Laboratory Diagnostics，12th 5-Year Project of Shandong Province，Weifang Medical University，Shandong Province，Weifang261053，China；2.Central Laboratory，Weifang People's Hospital，Shandong Province，Weifang261041，China；3.Department of Respiratory，Weifang People's Hospital，Shandong Province，Weifang261041，China

［Abstract］Objective To investigate the diagnostic accuracy of T-cell enzyme-linked immunospot assay（T-SPOT.TB）on pleural effusion and peripheral blood for patients with tuberculous pleurisy（TBP）.Methods A total of 84 patients with clinically suspected TBP admitted from June 2013 to August 2015 in Weifang People's Hospital were enrolled in this prospective cohort study and examined with T-SPOT.TB on pleural effusion mononuclear cells（PEMCs）and peripheral blood mononuclear specific T cell sensitization nucleus cells（PBMCs）simultaneously.Cell numbers of spot forming cells（SFCs）formed after stimulated by MTB specific antigen ESAT-6 and CFP-10 in the two specimens and its diagnostic features were compared，average number of SFCs was expressed by median（M）and interquartile range （P25，P75）.Results According to the standard of diagnosis of TBP and grouping，48 patients were diagnosed with TBP，and 36 cases of the non-TBP（NTBP）.The sensitivities of T-SPOT.TB on PBMCs and PEMCs for the diagnosis of TBP were 81.3%and 97.9%，respectively（P＜0.05），and the positive prediction values were 90.7%and 87.0%（P＞0.05）. The specificities of T-SPOT.TB on PBMCs and PEMCs for the identification of NTBP were 88.9%and 80.6%，respectively（P＞0.05），and the negative prediction values were 78.1%and 97.6%（P＜0.05）.Numbers of SFCs of the early secretory antigenic target 6（ESAT-6）and CFP-10 in samples of patients with TBP were 1350（103.3，2750.0），757.5 （51.3，2512.5）on PEMCs and 49.0（5.0，420.0），39.5（4.3，390.5）on PBMCs respectively，numbers of SFCs of the ESAT-6 and CFP-10 on PEMCs samples of patients with TBP were significantly higher（4-15 times）than that on PBMCs samples（Z=4.7，P＜0.05；Z=4.3，P＜0.05），Conclusion PEMCs T-SPOT.TB assay has highly sensitivity and negative prediction value for diagnosis of TBP，but PBMCs T-SPOT.TB has highly specificity and positive prediction value.Both PEMCs and PBMCs T-SPOT.TB assay simultaneously have a greater clinical diagnostic value for TBP.

Tuberculouspleurisy；T-cell enzyme-linkedimmunospotassay；Pleural effusion；Peripheral blood；Diagnostic value

R521

A

1674-4721（2016）08（a）-0125-04

2016-04-30本文編輯:任念）

山東省濰坊市科技發(fā)展計劃項目 （衛(wèi)生部分）（2015WS005）。

*共同第一作者