張　敏，李佳益，史學(xué)偉，倪永清*

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

產(chǎn)β-葡萄糖苷酶非釀酒酵母的篩選及酶學(xué)特性研究

張敏，李佳益，史學(xué)偉，倪永清*

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

通過(guò)對(duì)新疆石河子葡萄產(chǎn)區(qū)葡萄中的酵母菌的篩選，采用酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培養(yǎng)基分離純化菌株，并對(duì)分離菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。利用對(duì)硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷為底物篩選產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶酵母菌，得到一株高產(chǎn)糖苷酶畢赤酵母屬（Pichia sp.）的非釀酒酵母菌株Y8，并研究該菌株的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶學(xué)特性。結(jié)果表明，β-葡萄糖苷酶的最適初始pH值為5.0，最適產(chǎn)酶溫度為30℃，反應(yīng)時(shí)間為15 m in，最適葡萄糖質(zhì)量濃度為15 g/100 m L。

非釀酒酵母；篩選；β-葡萄糖苷酶；酶學(xué)特性

酵母菌株決定了葡萄酒的品質(zhì)，優(yōu)良的酵母菌株能使葡萄酒的色澤、感官、風(fēng)味更受顧客的喜愛(ài)［1］，采用不同的酵母菌株會(huì)使葡萄酒的風(fēng)味有著很大的差別［2］。篩選出優(yōu)良的酵母菌種是當(dāng)今葡萄酒行業(yè)研究領(lǐng)域的熱門(mén)話題之一。由于我國(guó)的葡萄酒產(chǎn)業(yè)起步相對(duì)較晚，對(duì)于葡萄酒類(lèi)釀酒酵母的研究也相對(duì)較少［3］。

相對(duì)于釀酒酵母來(lái)說(shuō)，非釀酒酵母能產(chǎn)生更多種類(lèi)和數(shù)量的胞外酶［4］。膠質(zhì)酶可以使葡萄汁的提取量增加，使得葡萄酒更加澄清，其中的β-葡萄糖苷酶可以水解糖苷前體物質(zhì)，使其組成部分的香味物質(zhì)釋放出來(lái)，這樣可以使葡萄酒的香味更加濃郁［5］，另外胞外酶中的蛋白酶會(huì)水解葡萄汁中的蛋白質(zhì)形成溶性多肽和一些氨基酸，能讓葡萄酒的更加清澈且不易變質(zhì)，酯酶可以水解葡萄酒中的物質(zhì)釋放香氣成分，而脂肪酶能分解葡萄酒中的脂肪。所有重要的胞外酶在與葡萄汁相互反應(yīng)，釋放不同的發(fā)酵香氣［6］。而這些酶中非常重要的β-葡萄糖苷酶對(duì)于葡萄酒釀造起著至關(guān)重要的作用，它可以通過(guò)水解作用將葡萄酒中的糖苷鍵分解其非揮發(fā)性風(fēng)味前體物，產(chǎn)生風(fēng)味活性物質(zhì)［7］。相比于葡萄自身含有的葡萄糖苷酶，釀酒酵母中的糖苷酶活性不會(huì)因?yàn)槠咸烟堑拇嬖诙档停?］。所以深入研究葡萄酒的非釀酒酵母產(chǎn)生的酶的活性，對(duì)于改善葡萄酒的風(fēng)味和工藝有著重要的意義［9］。

新疆的地理環(huán)境多樣、生物種類(lèi)繁多造就了新疆豐富的生物資源，也使得酵母菌的種類(lèi)繁多，能夠篩選出更多不同種類(lèi)的釀酒酵母。經(jīng)過(guò)多年的葡萄種植，新疆一些葡萄種植園中孕育多種天然酵母菌株，也產(chǎn)生了許多適合本地生態(tài)環(huán)境和葡萄品種的優(yōu)良天然酵母菌株［10］。本研究的目的是在新疆特色葡萄、中，廣泛采集非釀酒酵母菌，應(yīng)用于新疆特色釀造發(fā)酵行業(yè)中，以期改善產(chǎn)品質(zhì)量、提高設(shè)備利用率，同時(shí)為后期的研究提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1試驗(yàn)樣品

各種品種葡萄樣品（雷司令，赤霞珠，霞多麗，貴人香）：分別采自新疆石河子143團(tuán)、152團(tuán)、新疆石河子中信葡萄酒業(yè)有限公司葡萄試驗(yàn)園。

1.1.2培養(yǎng)基［11］

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：蛋白胨2.0%，酵母浸粉1.0%，葡萄糖2.0%，蒸餾水配制，瓊脂2.0%（固體培養(yǎng)基添加），自然pH，121℃滅菌25 m in。

篩選培養(yǎng)基：蛋白胨2.0%，酵母浸粉1.0%，瓊脂2.0%，對(duì)-硝基苯基-β-葡萄糖苷酶（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG）1.0%，葡萄糖2.0%，蒸餾水配制，自然pH，121℃滅菌25 m in。

種子培養(yǎng)基［12］：葡萄糖10.0%，蛋白胨5.0%，K2HPO41.0%，MgSO40.5%，pH 7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨2.0%，酵母浸粉1.0%，硝酸銨（NH4NO3）0.3%，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.4%，葡萄糖2.0%，蒸餾水配制，自然pH，121℃滅菌25 min。在溫度降到60～70℃左右加入0.1%p-NPG。

1.1.3化學(xué)試劑

對(duì)-硝基苯基-β-葡萄糖苷酶（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG）：美國(guó)Sigma公司；對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenyl，p-NP）、葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂、檸檬酸、乙醇、醋酸、碳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、硝酸銨等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

UV-mini-1240紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；HH-42恒溫水浴箱：常州國(guó)華儀器有限公司；SS325高壓蒸汽滅菌鍋：韓國(guó)LabTech公司；SPX智能生化培養(yǎng)箱：寧波市江南儀器廠；RC5C高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；TC-512PCR擴(kuò)增儀：英國(guó)Techne公司；SW-CJ超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1菌株的分離純化

將成熟果粒破碎、帶皮進(jìn)行自然發(fā)酵。待發(fā)酵啟動(dòng)后，分別取發(fā)酵液的前、中、后期各1 m L，梯度稀釋涂布于YPD培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48 h，挑單菌落于平板上多次劃線純化，獲得純菌株。菌株純化后于斜面上進(jìn)行保存，存于4℃冰箱備用。

1.3.2酵母菌的形態(tài)特征

根據(jù)酵母菌的固體培養(yǎng)菌落特征（菌落質(zhì)地，菌落顏色，菌落表面特征，菌落邊緣，菌落高度，菌落大小等）和顯微特征（細(xì)胞形態(tài)特征，細(xì)胞單生、對(duì)生或群生，繁殖方式等）對(duì)篩選的酵母菌進(jìn)行分類(lèi)。

1.3.326S rDNA基因PCR擴(kuò)增

根據(jù)形態(tài)學(xué)特征選取生長(zhǎng)力較好且具有代表性的菌株，按徐亞男等［13］方法進(jìn)行脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取及聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechain reaction，PCR）擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。

1.3.4高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的篩選

將菌懸液接種于篩選培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)72 h，噴灑碳酸鈉（1 mol/L）進(jìn)行顯色反應(yīng)，由于p-NPG經(jīng)β-葡萄糖苷酶在碳酸鈉的作用下可形成黃色透明圈，透明圈的顏色深淺及大小可以顯示酶活性的高低，因此選取黃色透明圈明顯且黃色圈較大的菌株作高產(chǎn)糖苷酶的實(shí)驗(yàn)菌株。選取較大的單菌落接種于種子培養(yǎng)基，搖床37℃振蕩培養(yǎng)24 h，5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床37℃振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.5粗酶液的制備

發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為10m L/50m L，121℃滅菌25 m in，無(wú)菌接種種子液。30℃條件下?lián)u床勻速（150 r/m in）培養(yǎng)72 h，量取發(fā)酵液，8 000 r/min離心10 min，取上清液，即為β-葡萄糖苷酶粗酶液。

1.3.6粗酶液的酶活測(cè)定

取0.05m L粗酶液，將50m L 0.2%p-NPG溶液和0.15m L pH 5.0的醋酸緩沖液均勻混合，30℃水浴預(yù)熱10 min，立即加入0.25 mol/L（pH 10.2）碳酸鈉0.25 m L中止反應(yīng)。室溫放置5 min，在波長(zhǎng)400 nm處測(cè)定吸光度值。p-NPG酶活定義［14］：每分鐘水解p-NPG產(chǎn)生1nmol p-NP所需的酶蛋白量為一個(gè)酶活力單位（U）。酶活力計(jì)算公式如下：

式中：U為酶活力，U/m L；0.1為酶液反應(yīng)體積，m L；t為反應(yīng)時(shí)間；N為原酶液稀釋倍數(shù)；C為對(duì)硝基苯酚含量，nmol。

1.3.7粗酶性質(zhì)研究

反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶活的影響：在反應(yīng)溫度30℃、緩沖液pH 4.0、葡萄糖質(zhì)量濃度5 g/100 m L的條件下，分別反應(yīng)5 m in、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min后測(cè)定β-葡萄糖苷酶的酶活，考察不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶活的影響。

初始pH對(duì)酶活的影響：用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制不同pH緩沖液，pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，反應(yīng)溫度30℃、葡萄糖質(zhì)量濃度5 g/100m L，反應(yīng)15m in的條件下測(cè)定β-葡萄糖苷酶的酶活，考察不同初始pH值對(duì)酶活的影響。

反應(yīng)溫度對(duì)酶活的影響：在反應(yīng)初始pH 4.0、葡萄糖質(zhì)量濃度5 g/100 m L條件下，分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃反應(yīng)15 min，測(cè)定不同溫度條件下β-葡萄糖苷酶的酶活，考察反應(yīng)溫度對(duì)酶活力的影響。

葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)酶活的影響：在30℃、初始pH 4.0條件下，反應(yīng)15min，測(cè)定葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5g/100m L、10 g/100 m L、15 g/100 m L、20 g/100 m L條件下β-葡萄糖苷酶的酶活，考察葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)酶活的影響。

2　結(jié)果與分析

2.1酵母菌的分類(lèi)

本研究對(duì)葡萄樣品進(jìn)行自然發(fā)酵，分離篩選得到78株酵母菌，根據(jù)菌落的顏色和形態(tài)將其聚類(lèi)，共分為18種形態(tài)類(lèi)型，其中菌株A1、A3、A4、A5、A7、A8是從采自152團(tuán)葡萄園中的葡萄中分離出來(lái)的；菌株N1、N2、N3、N6、N8是從143團(tuán)的葡萄中分離出來(lái)的；菌株Y2、Y5、Y8、Y9、Y11、Y14、Y16是從采自新疆石河子中信葡萄酒業(yè)有限公司葡萄試驗(yàn)園中的葡萄中分離出來(lái)的，各酵母菌株形態(tài)特征見(jiàn)表1。

表1　酵母的形態(tài)特征Table1 Morphological characteristics of yeasts

由表1可知，酵母菌菌落的顏色以奶油色和乳白色居多，菌落形態(tài)主要是球形突起、突面、表面光滑、不透明、奶油狀。

2.2基于26S rDNA基因序列的酵母菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

從石河子各個(gè)葡萄園采集的葡萄樣品中分離到酵母菌株共78株，通過(guò)形態(tài)學(xué)特征歸類(lèi)為18株，選取18株非釀酒酵母菌進(jìn)行DNA提取及26S rDNA基因PCR擴(kuò)增，所得序列提交美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI），通過(guò)局部序列比對(duì)基本檢索工具（basic local alignment search tool，BLAST）工具在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與已發(fā)表的26S rDNA D1/D2區(qū)域序列進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖1。在基于26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析繪制的系統(tǒng)樹(shù)上［15］，相同的種被歸在一個(gè)主分枝內(nèi)，表明它們具有較近的親緣性，而不同的種卻在于不同的亞分枝上，顯示它們?cè)贒1/D2區(qū)域序列上具有明顯區(qū)別。由圖1可知，這18株菌都屬于雙核菌亞界，子囊菌酵母亞門(mén)。其中菌株A 1、A 7、A 8與接合酵母屬（Zygosaccharomyces spp.）親緣關(guān)系較近，基因序列相似性為99%；菌株A3、A4與假絲酵母屬（Candida sp.）親緣關(guān)系較近，基因序列相似性為99%；菌株Y8、Y9、N2與畢赤酵母屬（Pichia sp.）親緣關(guān)系近，基因序列相似性為99%；菌株N1、 Y2、Y11、Y16與釀酒酵母屬（Saccharomyces cerevisiae sp.）親緣關(guān)系較近，基因序列相似性為98%；菌株N8與孢漢遜屬（Hanseniaspora sp.）親緣關(guān)系較近，基因序列相似性為98%；菌株N3、N6、Y14與單孢釀酒酵母屬（Kazachstania sp.）親緣關(guān)系較近，基因序列相似性為97%；菌株A5、Y5與釀酒酵母屬（Saccharomyces sp.）在26S rDNA基因序列相似性為96%，表明這兩個(gè)菌株可能是新種。

圖1　基于26S rDNA序列的19株酵母菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of the 19 yeast strains based on 26S rDNA sequence

2.3高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母的篩選

在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)18株酵母，分離篩選產(chǎn)β-糖苷酶的菌株。利用p-NPG經(jīng)β-葡萄糖苷酶作用后生成的對(duì)硝基苯酚（p-NP）在碳酸鈉作用下形成黃色透明圈，可極大地提高篩選效率。

通過(guò)對(duì)酵母產(chǎn)酶的定性分析，初步篩選出高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酵母。因?yàn)橥该魅Φ念伾顪\基本可以顯示酶活性的高低。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)所用18株酵母進(jìn)行初步篩選，挑選出高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酵母，部分菌株篩選結(jié)果見(jiàn)圖2。

透明圈直徑越大且顏色越黃表明酶活越高。由圖2可知，根據(jù)透明圈的直徑大小以及顏色深淺的比較可得，菌株Y8的透明圈最大且顏色最深，結(jié)果表明，菌株Y8產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活最高。

圖2　菌株產(chǎn)透明圈比較結(jié)果Fig.2 Compa rative results of transparent circle produced by strains

2.4酶活的測(cè)定

將篩選出來(lái)的黃色透明圈明顯的菌株（A3、Y2、Y9、N8、Y 5、Y 8）按照p-NPG法分別測(cè)出β-葡萄糖苷酶的吸光度值，計(jì)算出篩選的高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酵母菌株的酶活，結(jié)果如表2所示。由表2可知，菌株酶活力大小順序?yàn)锳3＜Y2＜Y9＜N8＜Y5＜Y8，其中菌株Y8產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性最好，因此以該菌株作為試驗(yàn)菌株，研究該菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)特性。

表2　β-葡萄糖苷酶酶活測(cè)定結(jié)果Table 2 Determ ination results of the enzyme activity of β-glycosidase

2.5β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶活的影響

由圖3可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株Y 8產(chǎn)β-葡萄糖苷酶與底物的結(jié)合程度升高，酶活逐漸升高，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為15 min時(shí)，酶活力達(dá)到最高值275.390 U/m L，之后反應(yīng)時(shí)間增加酶活力下降。因此，酶活力最大的反應(yīng)時(shí)間在15 m in時(shí)。

圖3　反應(yīng)時(shí)間對(duì)β-葡萄糖苷酶酶活的影響Fig.3 Effect of reaction time on the enzyme activity of β-glycosidase

2.5.2初始pH對(duì)酶活的影響

不同種類(lèi)的微生物有其最適的生長(zhǎng)pH值，同一微生物在其不同的生長(zhǎng)階段和不同的生理、生化過(guò)程中，也有不同的最適初始pH值要求，這對(duì)挑選適宜于發(fā)酵生產(chǎn)中的菌株尤為重要［16］。

圖4　初始pH值對(duì)β-葡萄糖苷酶酶活的影響Fig.4 Effect of initial pH on the enzyme activity of β-glycosidase

由圖4可知，當(dāng)初始pH值為5時(shí)，菌株Y8產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性最大達(dá)到260.277 U/m L。培養(yǎng)基的pH值影響細(xì)胞表面基團(tuán)的解離及其微觀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響營(yíng)養(yǎng)物的吸收及代謝物的分泌，導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)和代謝發(fā)生變化。因此，當(dāng)初始pH值為5時(shí)，β-葡萄糖苷酶活性最大。

2.5.3反應(yīng)溫度對(duì)酶活的影響

圖5　溫度對(duì)β-葡萄糖苷酶酶活的影響Fig.5 Effect of tem perature on the enzyme activity o f β-glycosidase

反應(yīng)溫度是影響微生物成長(zhǎng)和代謝的重要因子。由圖5可知，當(dāng)反應(yīng)溫度為30℃時(shí)，菌株Y8所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活性最高，為230.589 U/m L，由此可知，菌株Y 8產(chǎn)β-葡萄糖苷酶最適反應(yīng)溫度為30℃。

2.5.4葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)酶活的影響

據(jù)韓北忠等［17］報(bào)道，在Aspergillus oryzae液態(tài)培養(yǎng)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶時(shí)，葡萄糖會(huì)對(duì)其產(chǎn)生抑制作用。由圖6可知，對(duì)于菌株Y8在葡萄糖質(zhì)量濃度為0～15 g/100 m L時(shí)，酶活性沒(méi)有被抑制反而明顯上升，可能是葡萄糖的作用使β-糖苷酶作用位點(diǎn)發(fā)生改變，從而增加酶活性。葡萄糖質(zhì)量濃度＞15 g/100 m L之后，酶活有所下降。因此，最適萄葡糖質(zhì)量濃度為15 g/100 m L。

圖6　葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)β-葡萄糖苷酶酶活的影響Fig.6 Effect of glucose content on the enzyme activity o f β-glycosidase

3　結(jié)論

試驗(yàn)通過(guò)對(duì)葡萄樣品中的酵母菌分離純化、篩選得到78株酵母菌，根據(jù)菌落的顏色和形態(tài)將其聚類(lèi)，共分為18種形態(tài)類(lèi)型，通過(guò)細(xì)胞核菌落形態(tài)及26S rDNA D1/D2區(qū)域序列的測(cè)定等方法，對(duì)所分離的菌株進(jìn)行較系統(tǒng)的分類(lèi)鑒定研究，鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有菌株屬于6個(gè)屬，分別為：假絲酵母屬（Candida sp.）、孢漢遜屬（Hanseniaspora sp.）、釀酒酵母屬（Saccharomyces sp.）、單孢釀酒酵母屬（Kazachstania sp.）畢赤酵母屬（Pichia sp.）和接合酵母屬（Zygosaccharomyces spp.）。

采用以p-NPG為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基的分離篩選，由于p-NPG經(jīng)β-葡萄糖苷酶作用后生成的p-NP在碳酸鈉的作用下可形成黃色透明圈，這樣可以很好的分離篩選到產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株。采用此方法分離到6株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株，其中有1株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酵母菌Y 8，屬于畢赤酵母屬（Pichia sp.），其β-葡萄糖苷酶總酶活性為276.048 U/m L。

高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株Y8的最適反應(yīng)溫度為30℃，這與β-葡萄糖苷酶的最適溫度分布在30～110℃相吻合［18］，最適反應(yīng)時(shí)間是15min，與之前實(shí)驗(yàn)最適時(shí)間有一定差異［19-20］，最適葡萄糖質(zhì)量濃度為15 g/100 m L，最佳初始pH值為4.8。

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Screening of β-glucosidase-producing non-Saccharomyces yeasts w ith and its enzymatic characteristics

ZHANG Min，LI Jiayi，SHI Xuwei，NI Yongqing*
（College of Food Science，Shihezi University，Shihezi 832000，China）

Through the screening of yeasts in grapes from Xinjiang Shihezi w ine-producing regions，the strains were isolated and purified by yeast peptone dextrose（YPD）medium，and isolated strains were identified by molecular biology method.Using p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside（p-NPG）as substrate，the β-glucosidase-producing yeasts were screened，and one strain of non-Saccharomyces yeast with high glycosidase-production was obtained and identified as Pichia sp.The β-D-glucopyranoside producing characteristics of the strain were researched.The results showed that the optimum initial pH of β-glucosidase was 5.0，the optimum temperature of enzyme production was 30℃，reaction temperature was 15 m in and the optimum content of glucose was 15 g/100 m l.

non-Saccharomyces yeasts；screening；β-glycosidase；enzymatic characteristics

Q 939．9

0254-5071（2016）05-0097-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．020

2016-03-04

兵團(tuán)工業(yè)科技攻關(guān)（2014BA 024）

張敏（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩?/p>

倪永清（1969-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。