張建文,　劉　禹,　夏建業(yè),　郭美錦,　王澤建,　莊英萍

(華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院,國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心(上海),上海 200237)

?

機(jī)械攪拌生物反應(yīng)器的CFD模擬及剪切力對(duì)紅花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

張建文,劉禹,夏建業(yè),郭美錦,王澤建,莊英萍

(華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院,國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心(上海),上海 200237)

采用計(jì)算流體力學(xué)(CFD)技術(shù)模擬5 L機(jī)械攪拌生物反應(yīng)器中不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)流場(chǎng)的影響,分別考察不同攪拌速度下,紅花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中生物量、細(xì)胞活力、pH、糖耗、DO(溶解氧)、電容、電導(dǎo)、CER(單位體積發(fā)酵液在單位時(shí)間釋放CO2的物質(zhì)的量)的變化。結(jié)果表明:紅花細(xì)胞對(duì)剪切環(huán)境有個(gè)適應(yīng)過(guò)程,在攪拌生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng),能夠耐受剪切力值εave,CFD≤0.8 W/kg,細(xì)胞可以適應(yīng)剪切環(huán)境,細(xì)胞活力能夠恢復(fù),結(jié)束延滯期快速積累生物量; 當(dāng)剪切力εave,CFD>0.8 W/kg時(shí),細(xì)胞不能耐受剪切環(huán)境,受到較大損傷,導(dǎo)致細(xì)胞活力很低,裂解死亡。

植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng); 剪切力; 生物反應(yīng)器; CFD模擬

植物細(xì)胞培養(yǎng)是生物合成次級(jí)代謝物的重要途徑之一。由于植物細(xì)胞個(gè)體較大,胞內(nèi)含有占體積很大比例的大液泡,使細(xì)胞對(duì)物理剪切壓力很敏感,其對(duì)剪切力的敏感性遠(yuǎn)大于微生物。由于通氣和攪拌的原因,植物細(xì)胞在反應(yīng)器中培養(yǎng)是完全處于流體壓力下[1],在流體壓力的影響下,植物細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和次級(jí)代謝物合成的速率往往受到影響[2],而且不同的植物細(xì)胞系對(duì)流體壓力響應(yīng)程度有一定的差別。大豆細(xì)胞在搖瓶培養(yǎng)中受到機(jī)械應(yīng)力或大力攪拌條件下,會(huì)出現(xiàn)氧迸發(fā)現(xiàn)象[3]; 水母雪蓮細(xì)胞在傾斜式攪拌槳反應(yīng)器中培養(yǎng),流變壓力使細(xì)胞聚集體分裂,影響細(xì)胞生長(zhǎng)及黃酮合成量的下降[4]; 南方紅豆杉細(xì)胞在Couette式剪切反應(yīng)器中培養(yǎng),會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生物活性喪失較大,酚類物質(zhì)大量積累,產(chǎn)生防御應(yīng)答反應(yīng)[5]。

關(guān)于剪切力對(duì)植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響,有研究只是在特定流場(chǎng)反應(yīng)器如Couette式剪切反應(yīng)器中考察植物細(xì)胞的離線生理參數(shù)[5],而在實(shí)際的反應(yīng)器培養(yǎng)中剪切力和細(xì)胞生理響應(yīng)之間的關(guān)系和在線儀器儀表在植物懸浮培養(yǎng)中的運(yùn)用是值得進(jìn)一步研究的問(wèn)題。

本文采用攪拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)紅花懸浮細(xì)胞,通過(guò)計(jì)算流體力學(xué)(CFD)軟件,模擬不同轉(zhuǎn)速下反應(yīng)器流變特性,直觀反映反應(yīng)器內(nèi)剪切力分布,并且經(jīng)計(jì)算確定反應(yīng)器中單位體積能量耗散率ε的數(shù)值,以及在線溶氧電極、活細(xì)胞電極和過(guò)程尾氣質(zhì)譜儀的應(yīng)用,在此基礎(chǔ)上考察不同剪切環(huán)境對(duì)紅花細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝和生物活性的相關(guān)性分析,以期為植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的放大和適合植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器設(shè)計(jì)的研究提供參考。

1　材料和方法

1.1主要儀器和設(shè)備

本研究采用5 L攪拌式生物反應(yīng)器(上海國(guó)強(qiáng)生化設(shè)備有限公司),如圖1所示,罐體底部呈中凹形,罐體直徑DT為160 mm,罐體容量V為5 L,裝液量VL為3 L,液面高度H為162 mm,擋板長(zhǎng)度L為140 mm,擋板寬度W為15 mm,槳葉直徑D為72 mm,槳間距Ci為80 mm,槳葉與罐底距離Cb為40 mm;溶氧電極(梅特勒-托利多,瑞士)在線監(jiān)控溶氧;活細(xì)胞電極(Aber-instruments,英國(guó))在線測(cè)定電容和電導(dǎo);pH電極離線測(cè)定pH。

1.2細(xì)胞系和培養(yǎng)基

培養(yǎng)基為MS(Murashige and Skoog)培養(yǎng)基(萘乙酸(NAA)2.5 mg/L,6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)0.2 mg/L,蔗糖30 g/L,pH=6.5)。細(xì)胞系為紅花植物細(xì)胞株系,由大連普瑞康生物科技有限公司提供。

圖1　生物反應(yīng)器簡(jiǎn)圖Fig.1　Schematic diagram of the bioreactor

1.3實(shí)驗(yàn)條件

紅花細(xì)胞在1 000 mL搖瓶中培養(yǎng)7 d,然后接種到5 L的機(jī)械攪拌生物反應(yīng)器中,接種體積比為1∶4,轉(zhuǎn)速設(shè)置分別為100、200、300、400 r/min,在25 ℃條件下培養(yǎng)。

1.4實(shí)驗(yàn)參數(shù)的設(shè)定

1.4.1細(xì)胞生物量每隔24 h從發(fā)酵罐內(nèi)取一次25 mL發(fā)酵液,用于實(shí)驗(yàn)參數(shù)的測(cè)定(下同)。

稱取烘干的孔徑為8 μm的濾膜,充分混勻發(fā)酵液,吸取5 mL,抽濾1 min后,稱重,然后在40 ℃烘箱中烘24 h,稱量得干重。

1.4.2發(fā)酵液中糖的測(cè)定取發(fā)酵液上清,稀釋5倍,采用HPLC (1290,安捷倫)測(cè)定發(fā)酵液中糖濃度[6]:色譜柱為Shodex Asahipak NH2P-50 4E,流動(dòng)相為乙腈-水(VC2H3N∶VH2O=3∶1),流速為1.0 mL/min,柱溫30 ℃; 蒸發(fā)光檢測(cè)器(Altech 3300ELSD),載氣為高純氮?dú)?流速1.5 mL/min,漂移管溫度為80 ℃。

1.4.3細(xì)胞線粒體活性測(cè)定發(fā)酵液中細(xì)胞經(jīng)8 μm濾膜抽濾后在試管中加入200 mg濕重紅花細(xì)胞、2.5 mL質(zhì)量濃度為4 g/L的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液、2.5 mL 0.1 mol/L(pH 7.0)Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液,混勻后,25 ℃下暗處理13～16 h,離心棄上清液,蒸餾水洗滌3次,加入5 mL甲醇,置于60 ℃水浴50 min,期間輕搖動(dòng)數(shù)次,靜置室溫至細(xì)胞無(wú)色,離心后取上清液稀釋2倍,在分光光度計(jì)485 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)[7]。

1.4.4發(fā)酵罐在線采集數(shù)據(jù)采用Biostar采集系統(tǒng)對(duì)發(fā)酵罐中的DO(發(fā)酵液中溶解氧)、CER(單位體積發(fā)酵液在單位時(shí)間釋放CO2的物質(zhì)的量)在線采集。

1.4.5CFD模擬CFD模擬是由軟件Fluent 12(ANSYS Inc.)計(jì)算,采用單相流體計(jì)算,多參考系模型模擬葉輪旋轉(zhuǎn)。采用標(biāo)準(zhǔn)k-ε湍流模型結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)壁面函數(shù)雙方程,多參考旋轉(zhuǎn)坐標(biāo),SIMPLE算法計(jì)算,壓力速度耦合,用二階迎風(fēng)分格式離散模型表征空間離散化。網(wǎng)格的幾何模型由ANSYS ICEM計(jì)算。

2　結(jié)果與討論

2.1CFD結(jié)果驗(yàn)證

攪拌生物反應(yīng)器中槳葉產(chǎn)生的單位體積能量耗散率ε引用公式(1)計(jì)算[8],測(cè)定功率輸入及相關(guān)經(jīng)驗(yàn)參數(shù)[8]由公式(2)計(jì)算獲得,槳葉雷諾數(shù)由公式(3)得到[9]。

(1)

(2)

(3)

式中;N為攪拌速率;D為槳葉直徑;VL為發(fā)酵液體積;M為扭矩;μL為黏度;ρL為密度;P為功率輸入;Re為雷諾數(shù)。

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)式(1)、(2)、(3)和槳葉間距與槳葉直徑比值修正后的參考系數(shù)εave,emp[8]結(jié)果見表1,在不同攪拌轉(zhuǎn)速下,εave,CFD計(jì)算結(jié)果與εave經(jīng)驗(yàn)公式相接近,由于經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算沒有考慮小渦流產(chǎn)生的能量耗散率ε,兩者會(huì)有一定的差值,而且εave,CFD應(yīng)用的k-ε方程計(jì)算的準(zhǔn)確度高于85%,所以εave,CFD模擬值可信。

表1　模擬值與經(jīng)驗(yàn)值對(duì)比

經(jīng)過(guò)以上設(shè)計(jì),對(duì)不同轉(zhuǎn)速下5 L反應(yīng)器內(nèi)剪切速率進(jìn)行模擬分析。計(jì)算結(jié)果如圖2所示。

圖2　不同轉(zhuǎn)速下模擬攪拌反應(yīng)器內(nèi)部剪切速率分布圖Fig.2　Shear rate distribution in a simulated bioreactor under different agitation speeds

通過(guò)剪切速率分布圖可以看出,在槳葉尖端速度最大,由于上下兩層攪拌槳產(chǎn)生的流速場(chǎng)交叉,使得每個(gè)攪拌槳形成的環(huán)流區(qū)非常明顯。通過(guò)以上模擬分析可知,在不同攪拌轉(zhuǎn)速下,反應(yīng)器內(nèi)的流場(chǎng)強(qiáng)度不同,攪拌轉(zhuǎn)速越大,流場(chǎng)強(qiáng)度越大。

2.2不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)紅花細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

紅花細(xì)胞接種至生物反應(yīng)器中,細(xì)胞對(duì)流場(chǎng)剪切力有個(gè)適應(yīng)過(guò)程,細(xì)胞受到剪切力作用,造成細(xì)胞損傷,影響細(xì)胞形態(tài)(如細(xì)胞團(tuán)形態(tài)變小、部分細(xì)胞可能會(huì)裂解等)。如圖3所示,在100 r/min轉(zhuǎn)速時(shí),εave,CFD=0.029 7 W/kg,細(xì)胞所受剪切力作用較小,延滯期相對(duì)較短,在100 h左右開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,生物量最終達(dá)到13.51 g/L; 隨著轉(zhuǎn)速提高,εave,CFD計(jì)算值大幅度提高,200 r/min轉(zhuǎn)速時(shí),εave,CFD為0.194 5 W/kg,是100 r/min條件下的6.5倍,細(xì)胞生長(zhǎng)延滯期延長(zhǎng),120 h左右開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,最大生物量為11.31 g/L; 300 r/min轉(zhuǎn)速時(shí),εave,CFD=0.825 2 W/kg,細(xì)胞延滯期進(jìn)一步延長(zhǎng)至150 h左右,最大生物量為8.67 g/L; 而在400 r/min轉(zhuǎn)速下,εave,CFD=1.741 1 W/kg,細(xì)胞完全不耐受剪切,細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,干重一直處于很低水平。

攪拌速率是成功建立植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的一個(gè)重要參數(shù)[10]。適當(dāng)?shù)臄嚢杷俾誓軌蚣訌?qiáng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從氣液接觸面向細(xì)胞傳遞以及分散氣泡加強(qiáng)氧傳遞,所以能夠促進(jìn)細(xì)胞更好地生長(zhǎng)和次級(jí)代謝物的合成[10]。但是由于細(xì)胞的粒徑、較厚的細(xì)胞壁、胞內(nèi)大液泡、攪拌和通氣等因素的存在,當(dāng)細(xì)胞處于剪切力時(shí),表現(xiàn)出生理和形態(tài)上的變化,比如細(xì)胞成團(tuán)、細(xì)胞完整性、活力、生物量的積累,次級(jí)代謝產(chǎn)物等均不同[11]。隨著攪拌轉(zhuǎn)速的提高,反應(yīng)器流場(chǎng)中εave,CFD值大幅度提升,剪切力越大,紅花細(xì)胞生長(zhǎng)的延滯時(shí)間越長(zhǎng),最終生物量也越低。當(dāng)εave,CFD≤0.8 W/kg時(shí),紅花細(xì)胞能夠耐受流場(chǎng)剪切環(huán)境; 當(dāng)εave,CFD>0.8 W/kg時(shí),紅花細(xì)胞不能夠耐受剪切。

圖3　不同攪拌轉(zhuǎn)速下紅花細(xì)胞生長(zhǎng)變化曲線Fig.3　Growth curves of suspension cultures of Carthamustinctorius under different agitation speeds

2.3不同攪拌轉(zhuǎn)速下細(xì)胞活性的變化

細(xì)胞活性可以表明細(xì)胞在適合的環(huán)境中生長(zhǎng)和分裂的能力,通常活性與離子不可滲透的細(xì)胞膜的存在相關(guān)[12]。采用TTC法測(cè)定活細(xì)胞中酶活,可以直接反映紅花細(xì)胞活力。圖4表明在不同轉(zhuǎn)速條件下,生物反應(yīng)器內(nèi)不同的單位體積能量耗散率ε對(duì)細(xì)胞造成不同程度的損傷,εave,CFD值越大,細(xì)胞活力下降速度越快,細(xì)胞活力最低值越小,而且細(xì)胞活力恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞在生長(zhǎng)后期活性恢復(fù)達(dá)不到起始水平,在400 r/min轉(zhuǎn)速下,由于εave,CFD值太大,細(xì)胞活性無(wú)法恢復(fù),與細(xì)胞生長(zhǎng)曲線相對(duì)應(yīng)。商桂敏等[13]利用同軸圓筒反應(yīng)器研究剪切應(yīng)力對(duì)紅豆杉細(xì)胞活性的影響,發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)速下細(xì)胞活力快速下降。

圖4　不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)紅花細(xì)胞活力的影響Fig.4　Effect of shear stress on the mitochondrial activity of suspension culture under different agitation speeds

起始階段細(xì)胞處于延滯期階段,活力逐漸下降,處于不同生長(zhǎng)階段的細(xì)胞對(duì)剪切的耐受程度不同,會(huì)導(dǎo)致部分細(xì)胞膜的破裂或者細(xì)胞裂解死亡。當(dāng)細(xì)胞延滯期結(jié)束時(shí),細(xì)胞的整體活性都會(huì)出現(xiàn)回升,表明細(xì)胞開始進(jìn)入生長(zhǎng)階段。

2.4不同攪拌轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)基pH變化

在植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過(guò)程中,起始pH一般出現(xiàn)下降現(xiàn)象,延滯期結(jié)束時(shí)pH開始回升。如圖5所示,在4個(gè)不同轉(zhuǎn)速條件下,紅花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過(guò)程中,開始pH均出現(xiàn)快速下降現(xiàn)象,但是當(dāng)εave,CFD值較低時(shí),在對(duì)應(yīng)的100、200、300 r/min轉(zhuǎn)速下,發(fā)酵液pH都有不同程度的回升,這與細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和活力變化曲線相對(duì)應(yīng),400 r/min轉(zhuǎn)速時(shí),εave,CFD較大,細(xì)胞不能承受剪切力損傷,pH持續(xù)保持較低水平。Meijer等[12]認(rèn)為細(xì)胞懸浮液發(fā)生酸化作用是遭受剪切力傷害的植物細(xì)胞所作出的共同反應(yīng),導(dǎo)致pH下降的胞內(nèi)化合物的釋放可作為細(xì)胞受到剪切力損傷的標(biāo)志[14],當(dāng)生物反應(yīng)器內(nèi)發(fā)酵液pH開始回升時(shí),可以表明懸浮紅花細(xì)胞開始正常生理代謝生長(zhǎng)。

圖5　不同攪拌轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)基pH變化曲線Fig.5　Curvs of pH in culture medium under different agitation speeds

2.5不同轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)基中碳源的消耗

蔗糖是植物懸浮培養(yǎng)中最為常用的一種碳源,侯學(xué)文等[15]發(fā)現(xiàn)蔗糖為玫瑰茄細(xì)胞生長(zhǎng)的最適合的碳源; Sivanandhan等[16]對(duì)南非醉苆懸浮培養(yǎng)的研究表明一定濃度的蔗糖相比于葡萄糖、麥芽糖對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有利。如圖6所示,紅花細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,蔗糖被快速分解成葡萄糖和果糖,葡萄糖濃度消耗速度明顯快于果糖,說(shuō)明紅花細(xì)胞生長(zhǎng)優(yōu)先消耗葡萄糖。在100、200、300 r/min轉(zhuǎn)速下,紅花細(xì)胞能夠耐受3種轉(zhuǎn)速下的剪切力,總糖耗曲線與生長(zhǎng)曲線相對(duì)應(yīng),細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)階段,相對(duì)應(yīng)的糖耗速度也加快; 400 r/min轉(zhuǎn)速時(shí)產(chǎn)生的剪切力對(duì)紅花細(xì)胞損傷較大,細(xì)胞活性持續(xù)很低,糖耗速度也很慢。隨著培養(yǎng)環(huán)境剪切力的提高,蔗糖的分解速度反而加快,這可能與細(xì)胞受到剪切環(huán)境影響加快蔗糖水解產(chǎn)能作為一種防御措施有一定關(guān)聯(lián)。

圖6　不同攪拌轉(zhuǎn)速下紅花細(xì)胞培養(yǎng)基糖濃度變化Fig.6　Change in sugar concentration of suspension culture under different agitation speeds

2.6不同轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)基電容和電導(dǎo)率的變化

在線活細(xì)胞傳感儀利用電容的原理,可以用于細(xì)胞、酵母菌、放線菌、霉菌、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中活細(xì)胞濃度的準(zhǔn)確測(cè)定[17]。Markx等[18]在植物高羊茅細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中采用電容原理,監(jiān)控細(xì)胞的生長(zhǎng); Tanja等[19]將在線監(jiān)控與常規(guī)測(cè)量生物量方法對(duì)比,判定活細(xì)胞電極在線檢測(cè)植物細(xì)胞生物量更加合理。

從圖7電容與電導(dǎo)的變化可以直觀地看出紅花細(xì)胞在不同剪切環(huán)境中的活力和生長(zhǎng)變化,在100、200 r/min轉(zhuǎn)速下,細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境εave,CFD較小,細(xì)胞能夠耐受剪切力,活細(xì)胞數(shù)量沒有下降,電容呈上升趨勢(shì); 在300、400 r/min轉(zhuǎn)速下,細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境εave,CFD較大,高剪切作用下,細(xì)胞起始階段受到損傷,活細(xì)胞數(shù)量下降,電容相應(yīng)地隨之有所下降。低剪切環(huán)境,電容增長(zhǎng)曲線與細(xì)胞干重增長(zhǎng)曲線相吻合,但是在培養(yǎng)后期電容與干重變化出現(xiàn)分離,說(shuō)明細(xì)胞活力不足,細(xì)胞可能出現(xiàn)細(xì)胞膜破裂,干重雖然還有所增加,但是活細(xì)胞數(shù)量開始減少。Tanja等[19]應(yīng)用活細(xì)胞電極技術(shù)在線檢測(cè)植物細(xì)胞攪拌反應(yīng)器中懸浮生長(zhǎng)情況,在生長(zhǎng)后期也出現(xiàn)類似現(xiàn)象。

電導(dǎo)的變化可以反映發(fā)酵液中離子濃度的變化,在細(xì)胞度過(guò)延滯期開始生長(zhǎng)的階段,電容開始回升,培養(yǎng)基中鹽離子逐漸被細(xì)胞吸收利用,相應(yīng)的電導(dǎo)率也開始下降。從電容和電導(dǎo)率的變化,可以更加科學(xué)地反映細(xì)胞的生長(zhǎng)變化和活性變化。

2.7不同攪拌轉(zhuǎn)速下生物反應(yīng)器中CER、DO的變化

紅花細(xì)胞在反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)過(guò)程中的CER、DO均由Biostar采集軟件計(jì)算獲得。如圖8所示,紅花細(xì)胞接種至攪拌反應(yīng)器中,細(xì)胞長(zhǎng)期處于延滯期生長(zhǎng)階段,不同的εave,CFD值下,細(xì)胞所處延滯期時(shí)間不同,相應(yīng)的DO值下降趨勢(shì)也有所不同。高εave,CFD環(huán)境,反應(yīng)器內(nèi)DO值下降緩慢,溶氧快速消耗與細(xì)胞生長(zhǎng)一致; 低εave,CFD環(huán)境下,反應(yīng)器內(nèi)DO值下降較快,溶氧快速下降時(shí)間節(jié)點(diǎn)與細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)相一致。由于紅花細(xì)胞代謝緩慢,細(xì)胞呼吸強(qiáng)度較弱,整個(gè)培養(yǎng)階段的CER在10 mmol/(L·h)以內(nèi),而且不同轉(zhuǎn)速對(duì)應(yīng)不同εave,CFD值,CER上升趨勢(shì)總體與細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)相同,而且在細(xì)胞生長(zhǎng)后期,細(xì)胞活性下降,代謝變緩,相應(yīng)的CER也開始下降。Dong等[20]在反應(yīng)器中培養(yǎng)人參懸浮細(xì)胞,比耗氧速率SOUR(單位細(xì)胞單位時(shí)間耗氧量)與干重生長(zhǎng)曲線比較,得出在SOUR達(dá)到最大值時(shí),比生長(zhǎng)速率變緩。

圖7　不同攪拌轉(zhuǎn)速下紅花細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程電容、電導(dǎo)變化Fig.7　Time course of capacitance and conductivity of cell suspension culture under different agitation speeds

圖8　不同攪拌轉(zhuǎn)速下紅花細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程DO、CER的變化Fig.8　Time course of DO concentration and CER of cell suspension culture under different agitation speeds

3　結(jié)　論

攪拌轉(zhuǎn)速是產(chǎn)生剪切力的主要因素,紅花細(xì)胞在攪拌生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)時(shí),應(yīng)用CFD技術(shù)模擬不同轉(zhuǎn)速下反應(yīng)器中流場(chǎng)剪切力的分布,計(jì)算εave,CFD值,直觀反映出反應(yīng)器中剪切力的大小,考察細(xì)胞在不同剪切環(huán)境中的生長(zhǎng)代謝情況,得出紅花細(xì)胞耐受剪切力值εave,CFD≤0.8 W/kg。植物細(xì)胞在大型攪拌反應(yīng)器中高密度放大懸浮培養(yǎng),可以通過(guò)此方法,確定植物細(xì)胞耐受的最大剪切力εave,CFD值,以期指導(dǎo)反應(yīng)器的設(shè)計(jì)、槳葉類型的選擇以及培養(yǎng)條件(轉(zhuǎn)速、通氣量)的控制等。

[1]DORAN P M.Design of mixing systems for plant cell suspensions in stirred bioreactor[J].Biotechnology Progress,1999,15(3):319-335.

[2]ZHONG Jianjiang,FUJIYAMA K,SEKI T,etal.A quantitative analysis of shear effects on cell suspension and cell culture of perilla frutescens in bioreactors[J].Biotechnology Bioengineering,1994,44(5):649-654.

[3]LEGENDRE L,RUETER S,HEINSTEIN P F,etal.Characterization of the oligogalacturonide-induced oxidative burst in cultured soybean (Glycine max) cells[J].Plant Physiology,1993,102(1):233-240.

[4]黃艷,趙德修,呂東平,等.攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)水母雪蓮細(xì)胞的研究[J].生物工程學(xué)報(bào),2001,5(5):561-565.

[5]韓榮斌,施中東,楊文莉,等.剪切力對(duì)南方紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響[J].過(guò)程工程學(xué)報(bào),2003,2(2):135-140.

[6]辛秀蘭,李小萍,馬越,等.HPLC-ELSD法測(cè)定紅樹莓果實(shí)中水溶性糖含量[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,31(5):624-627.

[7]TOWILL L E,MAZUR P.Studies on the reduction of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a viability assay for plant tissue cultures[J].Canadian Journal of Botany,1975,53(11):1097-1102.

[8]NIENOW AW.Hydrodynamics of stirred bioreactors[J].Applied Mechanics Reviews,1998,51(1):3-32.

[9]SIECK J B,BUDACH W E,SUEMEGHY Z,etal.Adaptation for survival:Phenotype and transcriptome response of CHO cells to elevated stress induced by agitation and sparging[J].Journal of Biotechnology,2014,189:94-103.

[10]CHATTOPADHYAY S,FARKYA S,SRIVASTAVA A K,etal.Bioprocess considerations for production of secondary metabolites by plant cell suspension cultures[J].Biotechnol Bioprocess Engineering,2002,7(3):138-149.

[11]SINGH M,CHATURVEDI R.Evaluation of nutrient uptake and physical parameters on cell biomass growth and production of spilanthol in suspension cultures of Spilanthes acmella Murr[J].Bioprocess Biosystems Engineering,2012,35(6):943-951.

[12]MEIJER J J,HOOPEN Hjgt,LUYBEN Kcam,etal.Effects of hydrodynamic stress on cultured plant cells:A literature survey[J].Enzyme Microbial Technology,1993,15(93):234-238.

[13]商桂敏,施中東,為作君,等.剪切應(yīng)力對(duì)紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響及CFD模擬研究[J].高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào),2002,5(5):542-548.

[14]WAGNER F,VOGELMANN H.Cultivation of plant tissue cultures in bioreactors and formation of secondary metabolites[J].Plant Tissue Cultures and Its Biotechnological Application,1977:245-252.

[15]侯學(xué)文,郭勇.不同碳源對(duì)懸浮培養(yǎng)玫瑰茄細(xì)胞呼吸強(qiáng)度及產(chǎn)生輔酶Q的影響[J].廣西植物,1999,2(2):150-153.

[16]SIVANANDHAN G,KAPIL Dev G,JEVARAJ M,etal.A promising approach on biomass accumulation and withanolides production in cell suspension culture of Withania somnifera (L.) Dunal[J].Protoplasma,2013,250(4):885-898.

[17]BALDI L,HACKER D L,ADAM M,etal.Recombinant protein production by large-scale transient gene expression in mammalian cells:State of the art and future perspectives[J].Biotechnology Letters,2007,29(5):677-684.

[18]MARKX G H,DAVEY C L,KELL D B,etal.The dielectric permittivity at radio frequencies and the bruggeman probe:Novel techniques for the on line determination of biomass concentrations in plant cell cultures[J].Journal of Biotechnology,1991,20(3):279-290.

[19]HOLLAND T,BLESSING D,HELLWIG S,etal.The in line measurement of plant cell biomass using radio frequency impedance spectroscopy as a component of process analytical technology[J].Biotechnology Journal,2013,8(10):1231-1240.

[20]DONG Yanyan,GAO Wenyuan,MAN Shuli,etal.Effect of bioreactor angle and aeration rate on growth and hydromechanics paramaters in bioreactor culture of ginseng suspension cells[J].Acta Physiologiae Plantarum,2013,35(5):1497-1501.

CFD Simulation of a Mechanically Stirred Bioreactor and Effect of Shear Stress on Suspension Cultures of Carthamus tinctorius

ZHANG Jian-wen,LIU Yu,XIA Jian-ye,GUO Mei-jin,WANG Ze-jian,ZHUANG Ying-ping

(National Engineering Research Center of Biotechnology (Shanghai),School of Biotechnology,East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

The effect of agitation speed on agitation current field was studied in 5 L mechanically stirred bioreactor by computational fluid dynamics (CFD) method.Safflower (Carthamustinctorius) cells were cultivated in stirred tank reactor under different agitation speeds.The resultant changes in the cells were evaluated on the basis of biomass,cell viability and change of fermentation liquor about pH,sugar concentration,DO,capacitance,conductivity and CER.Results showed that there was an adaptive process of cell cultured in the shear flow field.To a certain extent,cells were able to tolerate the shear force in mechanically stirred bioreactor withεave,CFD≤0.8 W/kg.Under this shear flow field,the lag phase was shorter,and the speed of biomass accumulation and recovery of cell activity was faster.Ifεave,CFD>0.8 W/kg,cells couldn’t tolerate the shear force,because it was not easy for cells to recover cell activity,and even cells were lysised after suffering from damnification.

plant cell suspension culture; shear force; bioreactor; CFD simulation

1006-3080(2016)04-0492-07

10.14135/j.cnki.1006-3080.2016.04.009

2015-12-21

國(guó)家973項(xiàng)目(2013CB733600);國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展(863)計(jì)劃(2015AA021005)

張建文(1991-),男,山東人,碩士生,研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程方向。E-mail:jiawenhate@163.com

通信聯(lián)系人：莊英萍,E-mail:ypzhuang@ecust.edu.cn

Q815

A