王　瑩，趙瑞香，馬艷艷，梁新紅（河南科技學(xué)院 食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

嗜酸乳桿菌細(xì)菌素對鮮乳保質(zhì)期的影響及防腐技術(shù)體系的建立

王瑩，趙瑞香*，馬艷艷，梁新紅
（河南科技學(xué)院 食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

研究嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）產(chǎn)細(xì)菌素lactobacillin XH1對鮮乳保質(zhì)期的影響。將0.5 g/kg嗜酸乳桿菌細(xì)菌素lactobacillin XH1分別添加到鮮乳和消毒鮮乳中，分析其在4℃貯藏期間抑菌活性、酸度、感官特性的變化趨勢。通過在消毒鮮乳中添加嗜酸乳桿菌細(xì)菌素lactobacillin XH1，建立消毒鮮乳防腐應(yīng)用中的危害分析和關(guān)鍵環(huán)節(jié)控制點(diǎn)（HACCP）技術(shù)體系。結(jié)果表明，4℃條件下貯藏，添加細(xì)菌素lactobacillin XH1的乳樣的抑菌活性顯著大于未添加細(xì)菌素lactobacillin XH1的乳樣，且酸度變化趨勢平緩，仍保持產(chǎn)品原有的風(fēng)味、色澤、質(zhì)構(gòu)等感官特性，有效地延長鮮乳保質(zhì)期2 d，消毒鮮乳保質(zhì)期4～6 d。并建立了嗜酸乳桿菌細(xì)菌素lactobacillinXH1在消毒鮮乳防腐應(yīng)用中的HACCP體系，確保產(chǎn)品的安全性。

嗜酸乳桿菌；細(xì)菌素；鮮乳；保質(zhì)期；危害分析與關(guān)鍵控制點(diǎn)

牛乳營養(yǎng)豐富全面，是最理想的天然食品，西方人稱牛乳是人類的保姆，它所具有的原生營養(yǎng)性是其他任何人造營養(yǎng)品都無法比擬的［1-3］。除膳食纖維外，牛乳含有人體所需要的全部營養(yǎng)物質(zhì)［4-5］。正是由于牛乳有著豐富而完全的營養(yǎng)成分，所以它是各種微生物的天然培養(yǎng)基［6］，極易被微生物所污染，從而使牛乳及乳制品的保質(zhì)期大為縮短，影響乳及其產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，尋找一種天然而經(jīng)濟(jì)的乳品防腐劑并建立相應(yīng)的防腐技術(shù)體系，一直是乳品工業(yè)和研究人員所關(guān)心的問題［7］。

危害分析與關(guān)鍵點(diǎn)控制（hazard analysiscriticalcontrol point，HACCP）體系是通過實(shí)踐驗(yàn)證最具科學(xué)性的能夠確保食品安全與衛(wèi)生的預(yù)防性控制體系，其在乳及乳制品中的應(yīng)用是對于其在生產(chǎn)過程中實(shí)施全過程的危害分析和關(guān)鍵點(diǎn)控制，并確定預(yù)防措施，以期消除或降低在生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)可能造成的危害，從而提高食品的安全性，達(dá)到控制以及監(jiān)管的目的，降低食源性疾病的發(fā)生，為食品生產(chǎn)提供了更為安全的產(chǎn)品質(zhì)量控制方法［8-11］。由于HACCP體系是目前保證食品安全性最有效和最經(jīng)濟(jì)的方法，所以其在食品生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用必將是未來發(fā)展的趨勢［12-13］。

人們對化學(xué)防腐劑的安全性越來越擔(dān)憂，利用食品級微生物嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）產(chǎn)生的細(xì)菌素［14-16］作為生物型防腐劑，阻止乳中腐敗菌和致病菌的生長繁殖，從而克服化學(xué)防腐劑的安全隱患，對于提高乳和乳制品的安全與品質(zhì)，有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定乳酸鏈球菌在乳及乳制品中的最大添加量為0.5 g/kg［17-18］。鑒于此，本試驗(yàn)將嗜酸乳桿菌發(fā)酵上清液經(jīng)70%飽和度硫酸銨沉淀透析，HiTrap Capto Q離子柱進(jìn)一步純化，冷凍干燥后所得細(xì)菌素lactobacillin XH1，按照0.5 g/kg添加到鮮乳和消毒鮮乳中，在4℃下貯藏，考察和評價細(xì)菌素lactobacillin XH1對于延長鮮乳及消毒鮮乳保質(zhì)期的影響，建立嗜酸乳桿菌細(xì)菌素lactobacillin XH1在消毒鮮乳防腐應(yīng)用中的HACCP技術(shù)體系，以期為嗜酸乳桿菌細(xì)菌素在乳及乳制品防腐應(yīng)用中提供理論參考和技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1料與試劑

嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）（簡寫為La-XH1）：由河南科技學(xué)院食品研究所保藏提供；鮮牛乳：新鄉(xiāng)市康元乳業(yè)有限公司。

MRS液體培養(yǎng)基［19］：蛋白胨1%，葡萄糖2%，乙酸鈉0.5%，酵母浸粉0.5%，牛肉膏1%，檸檬酸氫二銨0.2%，MgSO4·7H2O 0.058%，MnSO4·4H2O 0.025%，K2HPO40.2%，吐溫80 0.1%，調(diào)pH 6.2～6.4，121℃滅菌15m in。

蛋白胨、瓊脂粉、牛肉膏、硫酸鎂、硫酸錳、酵母浸粉、葡萄糖、吐溫-80、磷酸氫二鉀、檸檬酸二銨、無水乙酸鈉、氯化鈉、瓊脂等均為國產(chǎn)生化試劑和分析純。

1.2器與設(shè)備

SW-CJ-1D單人單面垂直凈化工作臺：蘇州智華凈化精密儀器有限公司；SHP-250型生化培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；YXQ-LS-50G型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅儀器有限公司；101-3型恒溫干燥箱：上海浦鴻儀器廠；JA2003型電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；H2050R臺式高速冷凍離心機(jī)湘儀：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)公司；85-1B型磁力攪拌器：上海鷹迪儀器設(shè)備有限公司；FT74XTS UHT/HTST系統(tǒng)：湖北恒綠工程技術(shù)有限公司。

1.3驗(yàn)方法

1.3.1菌素lactobacillin XH1的制備［20］

將活化后的嗜酸乳桿菌La-XH1按2.5%的接種量加入到pH 6.5的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18h，經(jīng)10000 r/min、4℃、15min離心去沉淀，經(jīng)0.22μm孔徑無菌濾膜過濾后，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩０l(fā)酵上清液中加入70%飽和度的硫酸銨，采用磁力攪拌器緩慢攪拌直至溶解，4℃下過夜，10 000 r/m in、4℃、10min離心收集沉淀蛋白，50mmol/L、pH 7.0磷酸鹽緩沖液溶解，截留分子質(zhì)量為1 ku的透析膜在相同磷酸鹽緩沖液中透析24 h，在透析過程中多次更換緩沖液；再經(jīng)HiTrap Capto Q離子柱進(jìn)一步純化，收集目標(biāo)峰后冷凍干燥。

1.3.2菌素lactobacillin XH1對鮮乳保質(zhì)期的影響

在鮮乳中加入0.5 g/kg（按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)防腐劑最大使用量）細(xì)菌素，并以無菌生理鹽水作對照，采用實(shí)驗(yàn)室小型臺式真空包裝機(jī)進(jìn)行無菌真空包裝，在4℃條件下貯藏，隔天測試培養(yǎng)基內(nèi)的細(xì)菌菌落總數(shù)［21］，同時對牛乳進(jìn)行酸度的測定［22］、煮沸實(shí)驗(yàn)，并對乳的感官指標(biāo)進(jìn)行評價。

1.3.3菌素lactobacillin XH1對消毒鮮乳貨架期的影響

將提取的細(xì)菌素按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)防腐劑最大使用量0.5 g/kg加入到消毒鮮乳中，在80～85℃條件下滅菌10～15 s，冷卻后無菌裝入塑料袋中，密封，在4℃下貯藏，加入等體積生理鹽水的消毒鮮乳作為空白對照。隔天測其細(xì)菌菌落總數(shù)，并對消毒鮮乳進(jìn)行酸度的測定、煮沸實(shí)驗(yàn)以及對乳的感官指標(biāo)評價。

1.3.4官指標(biāo)測試

將各種試驗(yàn)處理下的乳樣，按時間段采樣，分別對其氣味、色澤、組織狀態(tài)、口感進(jìn)行評定，滿分100分。評議小組由10位食品感官評定專家組成，評定標(biāo)準(zhǔn)見表1［23-25］。

表1　鮮乳感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of fresh m ilk

1.3.5菌素lactobacillin XH1應(yīng)用于消毒鮮乳中HACCP體系的建立

依據(jù)HACCP體系的7個原理和12項(xiàng)基本步驟［26］，將細(xì)菌素lactobacillin XH1應(yīng)用于消毒鮮乳中，并對各工藝步驟可能會發(fā)生的生物性、物理性、化學(xué)性危害做出分析，確定控制措施、關(guān)鍵控制點(diǎn)和關(guān)鍵控制限值，建立糾偏措施、審核程序和記錄文件管理程序，逐步建立針對細(xì)菌素lactobacillin XH1應(yīng)用于消毒鮮乳的HACCP計劃。

1.3.6據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，采用Origin 7.0和Excel2003對各試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

圖1　鮮乳在4℃下貯藏期間細(xì)菌菌落總數(shù)（a）和酸度（b）的變化Fig．1 Changes o f totalbacterial count（a）and acidity（b）of fresh m ilk at 4℃

2　結(jié)果與分析

2.1菌素lactobacillin XH1對鮮乳保質(zhì)期的影響

將0.5 g/kg細(xì)菌素lactobacillin XH1添加到鮮乳中，無菌真空包裝，4℃條件下冷藏，隔天取乳樣測定其細(xì)菌菌落總數(shù)、酸度變化情況，結(jié)果見圖1，并對鮮乳進(jìn)行煮沸試驗(yàn)和感官評價，結(jié)果見圖2。

圖2　鮮乳在4℃下貯藏期間的感官評價Fig．2 Sensory evaluation of fresh m ilk during storage at4℃

由圖1、圖2可知，鮮乳在4℃下貯藏5 d內(nèi)，不加細(xì)菌素的乳樣在第2天細(xì)菌數(shù)為3.0×106CFU/m L，酸度值為20°T，指標(biāo)均超出鮮乳食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19301—2010《生乳》中要求細(xì)菌菌落總數(shù)≤2×106CFU/g（m L）、酸度12～18°T的上限，并且經(jīng)煮沸后乳樣開始出現(xiàn)凝固，第3天時乳樣出現(xiàn)大量絮片，色澤青色，有酸臭味產(chǎn)生。添加細(xì)菌素的乳樣各個指標(biāo)均比對照變化緩慢，在貯藏的第4天，細(xì)菌菌落總數(shù)剛達(dá)到4.5×106CFU/m L，酸度20°T，開始出現(xiàn)腐敗變質(zhì)現(xiàn)象。不加細(xì)菌素的鮮乳保質(zhì)期為2 d，添加細(xì)菌素的鮮乳保質(zhì)期為4 d，從而有效地延長鮮乳保質(zhì)期2 d。因此細(xì)菌素lactobacillin XH1能夠有效抑制乳中雜菌的生長繁殖，控制鮮乳的酸敗，從而有效延長鮮乳保質(zhì)期。

2.2菌素lactobacillin XH1對消毒鮮乳保質(zhì)期的影響

將0.5 g/kg細(xì)菌素lactobacillin XH1添加到消毒鮮乳中，采用125～130℃下滅菌2～4 s的高溫短時（high temperature short time，HTST）殺菌，冷卻后真空無菌裝入塑料袋中密封，再4℃條件下冷藏，之后隔天測定乳樣的細(xì)菌數(shù)和酸度變化情況，結(jié)果見圖3，并對消毒鮮乳進(jìn)行煮沸試驗(yàn)和感官評價，結(jié)果見圖4。

由圖3、圖4可知，消毒鮮乳在貯藏期間，不加細(xì)菌素的乳樣在第34天細(xì)菌菌落總數(shù)達(dá)到1.2×105CFU/m L，酸度值為20°T，指標(biāo)已超出消毒乳食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19645—2010《巴氏殺菌乳》中要求細(xì)菌總數(shù)5×104～105CFU/g（m L）、酸度12～18°T的上限，在第36天時，明顯有酸味和稠狀物產(chǎn)生，煮沸后沉淀，色澤暗淡，發(fā)生嚴(yán)重腐敗變質(zhì)現(xiàn)象；然而添加細(xì)菌素后的乳樣隨著貯藏時間的延長，細(xì)菌數(shù)比對照少2～3個數(shù)量級，在第40天細(xì)菌數(shù)的數(shù)量級才達(dá)到105，酸度值為25°T。由此得出不加細(xì)菌素的消毒乳的保質(zhì)期為34～36d，添加細(xì)菌素的消毒乳的保質(zhì)期為40 d。說明細(xì)菌素lactobacillin XH1對食品腐敗菌和致病菌有較好的抑制作用，因此，在消毒鮮乳中添加細(xì)菌素lactobacillin XH1，能夠有效的延緩生化反應(yīng)速率，從而延長消毒鮮乳保質(zhì)期4～6 d，提高產(chǎn)品的安全性。

圖3　消毒鮮乳在4℃下貯藏期間細(xì)菌菌落總數(shù)（a）和酸度（b）的變化Fig．3 Changes o f totalbacterial count（a）and acidity（b）of ste rilized fresh m ilk du ring storage at 4℃

圖4　消毒鮮乳在4℃下貯藏期間的感官評價Fig．4 Sensory evaluation o f sterilized freshm ilk during storage at4℃

2.3菌素lactobacillin XH1應(yīng)用于消毒鮮乳中HACCP體系的建立

2.3.1菌素lactobacillin XH1應(yīng)用型消毒鮮乳產(chǎn)品描述

配方：新鮮牛乳，純化后的嗜酸乳桿菌細(xì)菌素lactobacillin XH1。

感官特性：色澤呈均勻一致的乳白色或微黃色；具有消毒乳固有的純香味；組織細(xì)膩、均勻。

理化指標(biāo)：脂肪≥3.1 g/100 g，蛋白質(zhì)≥2.9 g/100 g，酸度16～18°T。

衛(wèi)生指標(biāo)：防腐劑，黃曲霉毒素，大腸桿菌數(shù)，金黃色葡萄球菌等致病菌均符合國家標(biāo)準(zhǔn)［17，24，27］。

2.3.2毒鮮乳制作工藝流程

2.3.3毒鮮乳生產(chǎn)過程危害分析與關(guān)鍵控制點(diǎn)（CCP）的確定

乳與乳制品在儲存、運(yùn)輸、生產(chǎn)加工到產(chǎn)品銷售各個環(huán)節(jié)中均可能受到生物性、化學(xué)性、物理性的危害，從而引起污染而造成腐敗變質(zhì)，使乳及乳制品喪失食用價值，并造成食源性疾病的發(fā)生。通過對消毒鮮乳生產(chǎn)加工步驟進(jìn)行詳細(xì)的危害分析，并結(jié)合決策樹原則，確定了該消毒鮮乳生產(chǎn)過程中5個關(guān)鍵控制點(diǎn)（critical control point，CCP），即原料乳的驗(yàn)收與處理、設(shè)備管道就地清洗（clean-in p lace，CIP）、標(biāo)準(zhǔn)化、HTST殺菌、無菌灌裝。通過對生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵控制點(diǎn)CCP的控制，最大程度地減少或降低危害，以保持鮮乳的品質(zhì)，提高鮮乳的安全性。

2.3.4HACCP計劃制定

對危害分析表中識別出的危害進(jìn)行評估，將有可能發(fā)生和一旦失控可能給消費(fèi)者帶來不可接受的健康風(fēng)險的點(diǎn)確定為顯著危害，并提出有效的控制措施和糾偏措施。關(guān)鍵控制點(diǎn)是最能有效控制顯著危害的點(diǎn)［28］，根據(jù)5個關(guān)鍵控制點(diǎn)確定各控制點(diǎn)的關(guān)鍵限值、監(jiān)控程序和糾偏措施，制作嗜酸乳桿菌細(xì)菌素Lactobacillin XH1應(yīng)用于消毒鮮乳的HACCP計劃，結(jié)果見表2。

表2 HACCP計劃Table 2 HACCP plan

3　結(jié)論

食品級微生物嗜酸乳桿菌的代謝產(chǎn)物細(xì)菌素具有無毒、無害、無殘留、無抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，是目前最有應(yīng)用前景的天然食品防腐劑之一，若將其應(yīng)用于乳及乳制品中，不僅能夠克服化學(xué)防腐劑的安全隱患，也能夠持久保持防腐效果。研究表明，將本實(shí)驗(yàn)室保藏的嗜酸乳桿菌La-XH1所產(chǎn)生的細(xì)菌素lactobacillin XH1按0.5 g/kg添加到鮮乳和消毒鮮乳中，驗(yàn)證和評價了細(xì)菌素在延長鮮乳保質(zhì)期中的明顯效果。由試驗(yàn)結(jié)果得出，在4℃下，添加細(xì)菌素lactobacillin XH1能夠有效延長鮮乳保質(zhì)期2d，消毒鮮乳保質(zhì)期4～6d，說明嗜酸乳桿菌細(xì)菌素lactobacillin XH1可以有效控制乳品中微生物的生長，從而延緩鮮乳的腐敗變質(zhì)。通過觀察鮮乳中添加細(xì)菌素lactobacillin XH1的變化，根據(jù)對消毒鮮乳生產(chǎn)過程各個環(huán)節(jié)可能造成的潛在危害進(jìn)行物理、化學(xué)和生物分析，確定關(guān)鍵控制點(diǎn)、關(guān)鍵限值、監(jiān)控程序、糾偏措施、驗(yàn)證程序和記錄保持程序，逐步建立起嗜酸乳桿菌細(xì)菌素lactobacillin XH1應(yīng)用于消毒鮮乳中HACCP防腐技術(shù)體系，以期為嗜酸乳桿菌細(xì)菌素在乳及乳制品防腐應(yīng)用提供理論參考和技術(shù)支撐。

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Effects of bacteriocin produces by Lactobacillus acidophilus on the shelf-life of fresh milk and the establishment of preservative technology system

WANG Ying，ZHAORuixiang*，MA Yanyan，LIANG Xinhong
（College ofFood Science，Henan Institute ofScience and Technology，Xinxiang 453003，China）

The effectof lactobacillin XH1 from Lactobacillus acidophilus on freshm ilk shelf-lifewas researched.5 g/kg lactobacillin XH1 produced by L.acidophilus wasadded to freshmilk and sterilized freshmilk to analyze thevariation trend ofbacteriostatic activity，acidity，sensory characteristicsduring storage at4℃.Through adding lactobacillin XH1 into sterilized freshmilk，the hazard analysis critical control point（HACCP）system in the corrosion resistanceapplication of sterilized freshm ilkwould be established.The results indicated thatbacteriostatic activity ofm ilk samplew ith lactobacillin XH1 was significantly greater than that ofmilk sample without lactobacillin XH1.The variation trend of acidity was flat，and them ilk still kept the productoriginal sensory characteristics such as flavor，color and textural properties.A fter adding the lactobacillin XH1，the freshmilk shelf-lifewasextended 2 d，and the sterilized freshm ilk shelf-lifewas extended to 4-6 d.The HACCP system lactobacillin XH1 from L.acidophilus in the corrosion resistanceapplication of sterilized freshmilkwasestablished，which couldmake sure theproductsafety.

Lactobacillusacidophilus；bacteriocins；freshm ilk；shelf-life；HACCP

TS201．3

0254-5071（2016）01-0051-06

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．012

2015-11-18

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（12A 550004）；河南省科技攻關(guān)計劃項(xiàng)目（122102110117）；新鄉(xiāng)市科技創(chuàng)新平臺建設(shè)項(xiàng)目（CP1310）

王瑩（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

趙瑞香（1966-），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。