張　瀟，周興雅，倪永清（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

新疆動(dòng)物原奶中腸球菌抗生素耐藥性分析

張瀟，周興雅，倪永清*
（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

采用K-B紙片擴(kuò)散法對(duì)從新疆常見食用性動(dòng)物原奶中篩選出的17株腸球菌（Enterococcus spp.）進(jìn)行10種抗生素耐藥性檢測(cè)。耐藥譜結(jié)果顯示，17株腸球菌對(duì)新霉素和卡那霉素均為100%敏感；對(duì)鏈霉素耐藥率較高，為94.12%；對(duì)其余7種抗生素均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，對(duì)萘啶酸和四環(huán)素的耐藥率分別為35.29%和23.53%；對(duì)利福平、紅霉素、頭孢噻肟和氨芐西林等抗生素敏感或中度敏感。其中超過50%的菌株能耐受4～5種抗生素，表明新疆地區(qū)少數(shù)民族食用乳品中腸球菌均存在耐藥性，部分腸球菌具有多重耐藥，仍需進(jìn)一步對(duì)腸球菌耐藥傳播進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

原奶；腸球菌；抗生素耐藥性

抗生素又稱抗菌素，是細(xì)菌、真菌等微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，對(duì)特異微生物具有抑制或殺滅作用［1］。20世紀(jì)初期抗生素誕生以來，越來越多的抗生素被發(fā)現(xiàn)并廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、獸醫(yī)以及動(dòng)物飼料等行業(yè)，其廣泛使用使得感染性疾病得到了有效控制，但隨之而來的細(xì)菌耐藥性問題已日益凸顯且備受關(guān)注，細(xì)菌耐藥性的廣泛傳播和多重耐藥菌株的出現(xiàn)已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。

近年來國(guó)內(nèi)外大量研究表明，由于抗生素的不正當(dāng)使用及濫用現(xiàn)象，長(zhǎng)期以來被認(rèn)為安全的、廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品領(lǐng)域的乳酸菌已經(jīng)產(chǎn)生耐藥并攜帶了相應(yīng)的耐藥基因，并隨著人類大量應(yīng)用抗菌素，這些益生菌可能成為抗菌素抗性基因的病原庫(kù)［2］。腸球菌（Enterococcus sp.）是人體正常的定殖菌，作為典型的乳酸菌，是部分食品的重要微生物菌群，在傳統(tǒng)原奶發(fā)酵也是優(yōu)勢(shì)種群，同時(shí)又為醫(yī)院內(nèi)感染的常見致病菌［3］。作為發(fā)酵乳制品發(fā)酵劑的腸球菌一旦具有耐藥性或者攜帶耐藥基因，就可能隨著人們的飲食而進(jìn)入人體的胃腸道中，通過水平轉(zhuǎn)移進(jìn)而傳遞給其他腸道菌株，甚至是有害菌，最終導(dǎo)致有害菌對(duì)相應(yīng)抗生素的耐藥性［4-5］。FRANZ等對(duì)來自于發(fā)酵乳中的腸球菌進(jìn)行了耐藥性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)所有菌株主要對(duì)阿莫西林和萬古霉素等抗生素敏感［6］。目前，除了發(fā)現(xiàn)抗青霉素和萬古霉素的腸球菌外，還發(fā)現(xiàn)了抗氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素、紅霉素、環(huán)丙沙星、鏈霉素和慶大霉素的腸球菌，具有廣譜耐藥性的腸球菌還尚未發(fā)現(xiàn)［7-10］。

新疆以放牧為生的少數(shù)民族數(shù)量較多，居住也較為分散，然而隨著和外界生活的接軌，抗生素的使用也在逐漸增多，來源于人和牲畜的醫(yī)用藥物也逐步改變著當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境。為了解新疆各地原生態(tài)奶制品品質(zhì)及腸球菌的安全問題，本研究通過大量采集新疆北部地區(qū)各少數(shù)民族動(dòng)物原奶樣品，通過稀釋涂皿法分離腸球菌，采用K-B紙片擴(kuò)散法對(duì)所得腸球菌進(jìn)行10種抗生素耐藥性檢測(cè)分析，以期為動(dòng)物腸球菌抗生素耐藥性的研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1料與試劑

1.1.1品來源

大量采集新疆北部阿塔城地區(qū)、阿勒泰地區(qū)、博樂地區(qū)、伊犁地區(qū)不同少數(shù)民族（維吾爾族、哈薩克族、蒙古族、回族）牧民家養(yǎng)牲畜（牛、羊、馬、駱駝）原奶樣品。

1.1.2要試劑

鏈霉素（streptomycin，STR）、四環(huán)素（tetracycline，TET）、氯霉素（chloramphenicol，CHL）、利富平（rifampicin，RIF）、紅霉素（erythromycin，ERY）、新霉素（neomycin，NEO）、頭孢噻肟（cefotaxime，CTX）、卡那霉素（kanamycin，KAN）、氨芐西林（ampicillin，AMP）、萘啶酸（nalidixic acid，NAI）：加拿大BBI公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.1.3菌株

17株腸球菌分離自新疆北部地區(qū)各少數(shù)民族動(dòng)物原奶樣品；質(zhì)控菌株產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（Enterotoxigenic Escherichiacoli，ETEC）10421、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）10420：購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（china centerof industrial culture collection，CICC）。

1.1.4養(yǎng)基

改良MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸提物5 g，檸檬酸二胺2 g，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，吐溫-80 1m L，蒸餾水1 000m L，pH 6.2～6.4；用于腸球菌的分離純化及藥敏試驗(yàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.2器與設(shè)備

Freesco21型高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Thermo公司；CX21光學(xué)顯微鏡：日本Olympus公司；Tprofessional聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國(guó)Biometra公司；GelDOC XR凝膠成像系統(tǒng)、PowerPacUniversal水平電泳儀、電泳槽：美國(guó)Bio-Rad公司；UVm ini-1240紫外分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.3驗(yàn)方法

1.3.1球菌的分離純化

將原奶樣品采用梯度稀釋法涂布于改良MRS培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落形態(tài)、大小、顏色、凹凸等表型特征進(jìn)行初步篩選并純化菌株，然后對(duì)純化菌株進(jìn)行革蘭氏染色鑒定，在顯微鏡下觀察其形態(tài)和革蘭氏染色特征，確定菌株種類。

對(duì)革蘭氏陽(yáng)性、球狀的分離菌進(jìn)一步通過測(cè)定16S rRNA進(jìn)行確定，擴(kuò)增16S rRNA基因上下游引物為27f：5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3和1492r：5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3，擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)［11］進(jìn)行，PCR產(chǎn)物由上海生工生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.2敏紙片瓊脂擴(kuò)散法分析腸球菌的耐藥譜

根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)2005版的規(guī)定采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）進(jìn)行耐藥性測(cè)定，將純化的腸球菌新鮮培養(yǎng)物定量接種于MRS固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48 h，挑選形態(tài)相同的菌落移種于MRS液體培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，校正濁度。取經(jīng)過分裝的菌液（經(jīng)測(cè)試驗(yàn)菌種活菌數(shù)目為1×108～3×1010CFU/g），用無菌生理鹽水逐級(jí)稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度（1×107CFU/g、1×108CFU/g、1×109CFU/g），混勻后備用。

將制備好的菌懸液用滅菌的棉拭子蘸取，均勻涂布在整個(gè)培養(yǎng)基表面，放置10min后，待平板上水分被瓊脂完全吸收后，用無菌鑷子將藥敏紙片緊貼于培養(yǎng)基表面，35℃厭氧/需氧培養(yǎng)，18～24 h后，測(cè)定抑菌圈直徑大小，參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（clinicaland laboratory standards institute，CLSI）標(biāo)準(zhǔn)將腸球菌對(duì)抗菌藥物的敏感性定義為敏感（sensitivity，S）、中介（intermediary，I）和耐藥（resistance，R），抑菌圈的邊緣以肉眼不可見的細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為限［12-13］。鼠傷寒沙門氏菌10420、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌10421作為質(zhì)控菌株。

1.3.3據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用WHONET 5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1球菌的分離與鑒定

為了便于從新疆不同種類原奶中分離獲得腸球菌進(jìn)行進(jìn)一步研究，本實(shí)驗(yàn)從新疆北部各地采集牧區(qū)各類動(dòng)物原奶，將原奶進(jìn)行系列稀釋后，選取一定稀釋度的稀釋液在改良的MRS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)分離。挑取單菌落在MRS平板上進(jìn)一步劃線分離，然后將劃線分離后形成的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色觀察。油鏡下觀察菌體呈紫色（革蘭氏陽(yáng)性）、球狀、單一細(xì)胞或細(xì)胞鏈狀排列、無芽孢的菌株，將其初步認(rèn)定為腸球菌，共分離獲得32株菌株。進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行16S rDNA序列分析，最終確定17株菌為腸球菌，其中糞腸球菌（E.faecalis）6株，屎腸球菌（E.faecium）5株，耐久腸球菌（Enterococcusdurans）4株，希拉腸球菌（Enterococcus hirae）2株。

2.2離菌株對(duì)10種抗生素的藥物敏感性

根據(jù)美國(guó)國(guó)立臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B）法進(jìn)行結(jié)果鑒定［14］，不同動(dòng)物原奶中分離的17株腸球菌對(duì)10種抗生素的藥物敏感性結(jié)果見表1。

通過對(duì)動(dòng)物原奶中分離出的17株腸球菌的10種抗生素的耐藥性的試驗(yàn)，由表1可知，17株腸球菌菌株對(duì)新霉素和卡那霉素表現(xiàn)為全部耐藥，16株對(duì)鏈霉素耐藥，1株為敏感，可見試驗(yàn)菌株對(duì)天然耐藥的氨基糖苷類具有很強(qiáng)的抑制作用；17株菌對(duì)氨芐西林和頭孢噻肟基本表現(xiàn)為敏感，其中有3株對(duì)頭孢噻肟處于中介，1株表現(xiàn)耐藥，其他都為敏感菌株，而只有一株菌對(duì)頭孢噻肟表現(xiàn)為中介，其余都表現(xiàn)為敏感，這兩種抗生素分別屬于苯丙醇類氯霉素和青霉素類。

從試驗(yàn)?zāi)c球菌樣品來源來看，菌株耐藥情況差異性不太大，7株來源于駝奶中的腸球菌耐受4～5種抗生素的占71.4%；7株分離自馬奶中的腸球菌耐受4～5種抗生素的有57.1%，牛奶樣品中分離的3株腸球菌耐4種抗生素的有2株；其余一株耐3種藥；而羊奶中分離的1株菌僅僅耐乳酸菌天然耐藥的三種氨基糖苷類藥物。綜上分析，不同的樣品來源，分離菌株的耐藥性有所差異，駝奶中腸球菌耐藥性強(qiáng)于馬奶樣品中分離的腸球菌。

表1　分離菌株對(duì)10種抗生素耐藥性結(jié)果Table 1 Drug resistance results of isolated strains on 10 antibiotics

2.3敏紙片瓊脂擴(kuò)散法分析乳酸菌的耐藥譜

根據(jù)表1結(jié)果，17株腸球菌耐藥譜如表2所示。

由表2耐藥譜可知，腸球菌全部耐3種及以上的抗生素，其中6株耐5種抗生素，5株耐4種抗生素，5株耐3種抗生素，1株耐2種抗生素。糞腸球菌中6株均耐3種及以上的抗生素，其中2株耐3種抗生素，3株耐4種抗生素，1株耐5種抗生素；屎腸球菌中6株均耐3種及以上的抗生素，其中1株耐3種抗生素，2株耐4種抗生素，2株耐5種抗生素；耐久腸球菌中4株耐3種及以上的抗生素，1株僅耐2種抗生素；2株希拉腸球菌均耐3種及以上的抗生素?？傮w來看，耐3種以上抗生素的菌株為16株占94.1%，多重耐藥情況較嚴(yán)重，且菌株耐藥情況差異性比較大。腸球菌耐受5種及以上抗生素的糞腸球菌1株占16.7%，屎腸球菌2株占40%，耐久腸球菌2株占50%，希拉腸球菌為0，可見耐久腸球菌耐藥性最強(qiáng)，屎腸腸球菌耐藥性大于糞腸腸球菌。

表2　原奶分離菌株耐藥譜分型Table 2 Drug resistance typing of strains isolated from raw m ilk

2.4離菌株對(duì)10種抗生素的耐藥率

綜合表1和表2的結(jié)果，分離菌株對(duì)所選抗菌藥的耐藥率見表3。

表3　原奶分離菌株對(duì)10種抗生素的耐藥率Table 3 Drug resistance rate of strains isolated from raw m ilk on 10 antibiotics

由表3可知，17株腸球菌對(duì)10種抗生素耐藥率顯示，實(shí)驗(yàn)?zāi)c球菌對(duì)新霉素和卡那霉素均為100%敏感，對(duì)鏈霉素耐藥率較高，為94.12%，這三種抗生素均屬于氨基糖苷類；對(duì)萘啶酸和四環(huán)素的耐藥率分別為35.29%和23.53%；對(duì)利福平、紅霉素敏感或中度敏感，耐藥率分別為11.76%和17.65%，試驗(yàn)菌株對(duì)頭孢噻肟和氨芐西林的耐藥率相同，均為5.88%，敏感度較??；17株腸球菌對(duì)于苯丙醇類的氯霉素顯示為全部敏感無中介。另外，有研究指出乳酸菌對(duì)氟喹諾酮類抗生素有天然耐藥性，而本次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)萘啶酸的耐藥率低于50%為35.29%。藥敏結(jié)果顯示，分離的17株腸球菌的多重耐藥狀況較為理想，其中不到50%的菌株能耐受4～5種抗生素，且包含三種目前已經(jīng)明確乳酸菌天然耐藥的氨基糖苷類抗生素［15］。

3　結(jié)論

近年來不斷上升的腸球菌感染率與廣泛使用抗生素而出現(xiàn)的耐藥性以及廣譜抗生素的篩選都有密切關(guān)系，腸球菌能夠通過耐藥基因的轉(zhuǎn)移，來獲得新型抗生素的抵抗能力［16］。本研究所檢測(cè)的腸球菌均對(duì)獲得性耐藥，如青霉素類、頭孢類、苯丙醇類和安沙霉素類抗生素表現(xiàn)為敏感。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新疆地區(qū)原奶中分離的腸球菌雖然均存在不同程度的耐藥現(xiàn)象，且有多重耐藥問題，但主要是對(duì)三種乳酸菌天然耐藥的氨基糖苷類抗生素敏感，整體耐藥水平相比其他商業(yè)化、產(chǎn)業(yè)化程度高的地區(qū)明顯偏低，少數(shù)民族食用乳品受抗生素干擾影響較小，但仍需進(jìn)一步對(duì)其中的腸球菌的耐藥傳播進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

本研究分離出的原奶中的腸球菌的耐藥性說明了，奶制品已經(jīng)存在抗生素耐藥問題。對(duì)腸球菌進(jìn)行全面的藥敏測(cè)試，了解各菌株的藥敏譜是非常有必要的。對(duì)腸球菌的耐藥性應(yīng)高度警惕，避免高耐藥、多重耐藥菌株出現(xiàn)和播散，而牧草作為飼料生產(chǎn)的原材料，其質(zhì)量也不可忽略，所以應(yīng)當(dāng)建立牧草中抗生素殘留的檢測(cè)方法并進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，更好地保證飼料、食品的安全和人類的健康。

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Analysis of antibiotics resistancs of Enterococcus spp.form animal raw milk in Xinjiang

ZHANG Xiao，ZHOU Xingya，NIYongqing*
（College ofFood Science，ShiheziUniversity，Shihezi832000，China）

17 strains of Enterococcus spp.were screened from raw m ilk of Xinjiang common animals by Kirby-Bauermethod.The drug resistance of 17 strains of Enterococcus spp.was detected with 10 antibiotics.The results of drug-resistant spectrum showed that the drug resistance rate of 17 strainson neomycin and kanamycin was100%，thedrug resistance rate on streptomycinwas94.12%.And thaton the other seven antibiotics showed different degrees of drug resistance.The drug resistance rate on nalidixic acid and tetracycline was 35.29%and 23.53%，respectively.The strains weresensitiveormoderatesensitiveon rifampicin，erythromycin，cefotaxime and ampicillin.More than 50%of thestrains could tolerate 4-5 kindsof antibiotics，which indicated that Enterococcus spp.selected from dairy products in Xinjiang ethnicm inority had drug resistance.Part Enterococcus spp.hadmultiple drug resistance.The spread of Enterococcus spp.drug resistance stillneed to be furthermonitored.

raw m ilk；Enterococcus spp；antibiotics resistance

S852．61

0254-5071（2016）01-0043-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．010

2015-11-20

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)基金項(xiàng)目（31360001）

張瀟（1991-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)與安全。

倪永清（1969-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c分子生態(tài)學(xué)。