吳蔚苗，羅錦瑩（佛山市順德區(qū)中醫(yī)院中藥房，廣東佛山　528000）

UPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地吳茱萸中綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量

吳蔚苗＊，羅錦瑩#（佛山市順德區(qū)中醫(yī)院中藥房，廣東佛山528000）

目的：建立同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地吳茱萸中綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量的方法。方法：采用超高效液相色譜法。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸（梯度洗脫），流速為0.40 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為326、220 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為2 μl。結(jié)果：綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為7.67～76.67 μg/ml（r=0.999 2）、13.33～133.33 μg/ml（r=0.999 7）、13.33～133.33 μg/ml（r=0.999 8）；定量限分別為0.11、0.05、0.05 ng，檢測(cè)限分別為0.03、0.01、0.01 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜3%；加樣回收率分別為96.19%～101.90%（RSD=2.19%，n=6）、95.35%～101.16%（RSD=2.27%，n=6）、95.92%～98.98%（（RSD=1.33%，n=6）。結(jié)論：該方法快速、準(zhǔn)確，適用于同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地吳茱萸中綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量。

超高速液相色譜法；吳茱萸；綠原酸；吳茱萸堿；吳茱萸次堿；含量測(cè)定

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎E.rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang或疏毛吳茱萸E.rutaecarpa（Juss.）Benth.var.bodinieri （Dode）Huang的干燥近成熟果實(shí)，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽(yáng)止瀉之功效，臨床常用于治療厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣、經(jīng)行腹痛、脘腹脹痛、嘔吐吞酸、五更泄瀉等證［1］。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有強(qiáng)心、保護(hù)心臟、抗心律失常、降壓、抗血栓、抗腫瘤、抗過(guò)敏和抗炎鎮(zhèn)痛等作用［2］。吳茱萸主要分布于秦嶺以南地區(qū)，主產(chǎn)于貴州、湖南、四川、廣西、云南等地［3］。隨著市場(chǎng)需求量的不斷增加，吳茱萸價(jià)格也隨之攀升，以致時(shí)有以次充好現(xiàn)象出現(xiàn)?，F(xiàn)行2015年版《中國(guó)藥典》（一部）中吳茱萸只以吳茱萸堿和吳茱萸次堿兩者總和為質(zhì)量控制指標(biāo)［1］；且目前多見(jiàn)采用高效液相色譜法（HPLC）法和超臨界流體色譜（SFC）法對(duì)吳茱萸中生物堿［4-7］、苦味素類成分測(cè)定的報(bào)道［8-12］，對(duì)吳茱萸中其他類成分研究報(bào)道較少。超高效液相色譜法（UPLC）作為一種新型液相色譜技術(shù)，相比傳統(tǒng)HPLC，具有分離能力強(qiáng)、分析速度快、靈敏度高的特點(diǎn)［13］。因此，筆者采用UPLC法同時(shí)快速測(cè)定不同產(chǎn)地吳茱萸中綠原酸、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量，以期為吳茱萸的質(zhì)量控制提供參考。

1　材料

1.1儀器

ACQUITY UPLC H-Class型UPLC儀，包括QSM四元溶劑管理器、二極管陣列（PDA）檢測(cè)器、SM-FTN樣品管理器、CH-A型柱溫箱、Empower3色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；BP211D型十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；KQ-100DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：100 W，頻率：40 kHz）；“艾柯”DISCOVER-III-18型實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）。

1.2試劑

綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：MUST-13081601，純度≥98.0%）、吳茱萸堿對(duì)照品（批號(hào)：MUST-13060901，純度≥98.0%，）、吳茱萸次堿對(duì)照品（批號(hào)：MUST-12031010，純度≥98.0%）均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3藥材

吳茱萸藥材（編號(hào)：W1-W12）購(gòu)自佛山市中藥店和廣州清平藥材市場(chǎng)，產(chǎn)自廣西、湖南、貴州等省份，經(jīng)佛山市順德區(qū)中醫(yī)院李正平副主任中藥師鑒定為蕓香科植物吳茱萸E/rutaecarpa（Juss.）Benth.的干燥近成熟果實(shí)。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表1）；流速：0.40 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：2 μl。

表1　梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution

2.2溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液取綠原酸對(duì)照品、吳茱萸堿對(duì)照品、吳茱萸次堿對(duì)照品適量，精密稱定，置于同一25 ml量瓶中，用80%乙醇溶解并定容，制成每1 ml含綠原酸76.67 μg、吳茱萸堿133.33 μg、吳茱萸次堿133.33 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液取經(jīng)充分干燥的吳茱萸粉末（過(guò)2號(hào)篩）0.2 g，精密稱定，置于50 ml具塞錐形瓶中，加80%乙醇25 ml，稱定質(zhì)量，浸泡30 min，超聲提取30 min，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對(duì)照溶液取80%甲醇溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5，理論板數(shù)以綠原酸、吳茱萸堿和吳茱萸次堿峰計(jì)分別為11 000、11 500、11 500。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

圖1　超高效液相色譜圖A.陰性對(duì)照；B.混合對(duì)照品；C.供試品；1.綠原酸；2.吳茱萸堿；3.吳茱萸次堿Fig 1　UPLC chromatogramsA.negative control；B.mixed reference substance；C.test sample；1.chlorogenic acid；2.evodiamine；3.rutecarpine

2.4線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，分別置于5 ml量瓶中，用80%甲醇定容，搖勻，制成不同質(zhì)量濃度的系列對(duì)照品溶液。取上述系列對(duì)照品溶液2 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見(jiàn)表2。

表2　回歸方程與線性范圍Tab 2　Regression equations and linear ranges

2.5定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限（LOQ），當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限（LOD），詳見(jiàn)表3。

表3　定量限與檢測(cè)限Tab 3　Quantitation limit and detection limit

2.6精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿峰面積的RSD分別為1.21%、1.48%、0.85%（n= 6），表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿峰面積的RSD分別為2.05%、1.75%、1.48%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8重復(fù)性考察

取同一批樣品（編號(hào)：W1）粉末6份，每份約0.2 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的平均含量分別為10.80、17.17、9.51 mg/g，RSD分別為1.89%、1.37%、2.04%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9加樣回收率試驗(yàn)

取樣品粉末（編號(hào)：W1）6份，每份約0.10 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.10樣品含量測(cè)定

取12批樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

3　討論

3.1提取溶劑的考察

筆者考察了20%、40%、60%、80%、100%乙醇對(duì)綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿提取率的影響。結(jié)果，40%乙醇作為提取溶劑時(shí)，綠原酸提取率最大；100%乙醇作為提取溶劑時(shí)，吳茱萸堿、吳茱萸次堿提取率最大；而80%乙醇作為提取溶劑時(shí)，上述3種成分提取率均較大。綜合考慮，本試驗(yàn)選擇80%乙醇作為提取溶劑。

表4　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab 4　Result of recovery test（n=6）

表5　樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab 5　Result of contents determination of samples（n=3）

3.2流動(dòng)相的考察

筆者考察了甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.3%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.3%磷酸作為流動(dòng)相時(shí)的分離效果。結(jié)果，乙腈-0.1%磷酸作為流動(dòng)相時(shí)，分離效果最好、基線平且系統(tǒng)壓力低。故選用乙腈-0.1%磷酸作為本研究的流動(dòng)相。

3.3測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

筆者采用PDA檢測(cè)器，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描與綠原酸、吳茱萸堿和吳茱萸次堿保留時(shí)間相同的供試品色譜峰的紫外光譜，并與對(duì)照品的紫外光譜進(jìn)行比較。結(jié)果，綠原酸的最大吸收波長(zhǎng)為325.6 nm，吳茱萸堿的最大吸收波長(zhǎng)為225.8 nm，吳茱萸次堿的最大吸收波長(zhǎng)為215.2 nm。所以，本試驗(yàn)采用波長(zhǎng)切換技術(shù)，0～4 min波長(zhǎng)選取326 nm，4～12 min波長(zhǎng)選取220 nm。

3.4樣品含量測(cè)定結(jié)果分析

筆者測(cè)定了12批吳茱萸中綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量。結(jié)果，不同產(chǎn)地3種成分含量具有一定差異，綠原酸的含量為7.32～11.53 mg/g，吳茱萸堿的含量為7.49～19.35 mg/g，吳茱萸次堿的含量為3.19～12.68 mg/g，這可能與產(chǎn)地環(huán)境因素及采收時(shí)間等不同有關(guān)。

綜上所述，本方法快速、準(zhǔn)確，適用于同時(shí)快速測(cè)定不同產(chǎn)地吳茱萸中綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量。

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（編輯：劉柳）

Simultaneous Determination of Chlorogenic Acid，Evodiamine and Rutecarpine in Different Places of Evodia rutaecarpa by UPLC

WU Weimiao，LUO Jinying（Dept.of TCM，TCM Hospital of Foshan Shunde District，Guangdong Foshan 528000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of chlorogenic acid，evodiamine，rutecarpine in different places of Evodia rutaecarpa.METHODS：UPLC was performed on the column of ACQUITY UPLC BEH C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%Phosphoric acid aqueous solution（gradient elution）at a flow rate of 0.40 ml/min，the detection wavelength was 326 nm and 220 nm，column temperature was 30℃，and the volume injection was 2 μl.RESULTS：The linear range was 7.67-76.67 μg/ml for chlorogenic acid（r=0.999 2），13.33-133.33 μg/ml for evodiamine（r=0.999 7）and 13.33-133.33 μg/ml for rutecarpine（r=0.999 8）；the limits of quantitation were 0.11 ng，0.05 ng and 0.05 ng，the limits of detection were 0.03 ng，0.01 ng and 0.01 ng，respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 3%；recoveries were 96.19%-101.90%（RSD=2.19%，n=6），95.35%-101.16%（RSD=2.27%，n=6）and 95.92%-98.98%（RSD=1.33%，n=6），respectively.CONCLUSIONS：The method is rapid and accurate，and suitable for the simultaneous determination of chlorogenic acid，evodiamine，rutecarpine in different places of E.rutaecarpa.

UPLC；Evodia rutaecarpa；Chlorogenic acid；Evodiamine；Rtecarpine；Content determination

R284.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1001-0408（2016）24-3446-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.42

＊主管中藥師。研究方向：中藥調(diào)配。電話：0757-22626032。E-mail：13724672006@163.com

主管中藥師。研究方向：中藥調(diào)配。電話：0757-22208163。E-mail：1656377337@qq.com

2015-07-30

2016-05-20）