郭殷銳，張廣唱，王　劍（廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣州　510006）

UPLC法同時(shí)測(cè)定胃蘇顆粒中4種成分的含量

郭殷銳＊，張廣唱，王劍#（廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣州510006）

目的：建立同時(shí)測(cè)定胃蘇顆粒中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量的方法。方法：采用超高效液相色譜法。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18，流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸（梯度洗脫），流速為0.40 ml/min，檢測(cè)波長為284 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為1 μl。結(jié)果：蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為9.38～93.75 μg/ml（r=0.999 7）、32.25～322.50 μg/ml（r=0.999 7）、11.25～112.50 μg/ml（r=0.999 9）、11.88～118.75 μg/ml（r=0.999 8）；定量限分別為20、18、18、18 ng，檢測(cè)限分別為6、5、5、5 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為96.24%～103.12%（RSD= 2.45%，n=6）、98.43%～102.10%（RSD=1.42%，n=6）、96.10%～101.41%（RSD=2.07%，n=6）、95.57%～99.06%（RSD= 1.44%，n=6）。結(jié)論：該方法快速、高效，適用于同時(shí)測(cè)定胃蘇顆粒中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量。

超高效液相色譜法；胃蘇顆粒；蕓香柚皮苷；橙皮苷；新橙皮苷；柚皮苷；含量測(cè)定

胃蘇顆粒為紫蘇梗、香附、陳皮、香櫞、佛手、枳殼、檳榔、炒雞內(nèi)金8味藥材組合而成的復(fù)方制劑，具有理氣消脹、和胃止痛的功效，主治氣滯型胃脘痛、慢性胃炎及消化性潰瘍［1-3］。查閱相關(guān)文獻(xiàn)［4-6］，對(duì)于胃蘇顆粒質(zhì)量控制的研究，目前僅見高效液相色譜（HPLC）法對(duì)其中柚皮蕓香苷、柚皮苷等成分的含量測(cè)定報(bào)道，未見采用超高效液相色譜（UPLC）法的相關(guān)報(bào)道。UPLC法作為一種新型液相色譜技術(shù)，相比傳統(tǒng)HPLC，具有分離能力強(qiáng)、分析速度快、靈敏度高的特點(diǎn)［7-8］。因此，筆者開展本項(xiàng)研究，旨在利用UPLC法建立一種快速、準(zhǔn)確、有效測(cè)定胃蘇顆粒中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量的方法，為其質(zhì)量控制提供參考。

1　材料

1.1儀器

ACQUITY型UPLC儀，包括QSM四元溶劑管理器、二極管陣列（PDA）檢測(cè)器、SM-FTN樣品管理器、CH-A型柱溫箱、Empower3色譜工作站（美國Waters公司）；BP211D型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；KQ-100DE型超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司，功率：100 W，頻率：40 kHz）。

1.2藥品與試劑

胃蘇顆粒（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：13122301、14021403、14022701、14080902、14101002、14102801、15011202、15022301，規(guī)格：5 g/袋）；蕓香柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-12040812，純度≥98.0%）、橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-11030701，純度≥98.0%）、新橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-12030914，純度≥98.0%）、柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-12040812，純度≥98.0%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫（0 min，16% A；6 min，35%A）；流速：0.40 ml/min；檢測(cè)波長：284 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：1 μl。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液取蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷對(duì)照品各適量，精密稱定，置于同一25 ml量瓶中，用80%乙醇溶解并定容，制成每1 ml含蕓香柚皮苷93.75 μg、柚皮苷322.50 μg、橙皮苷112.50 μg、新橙皮苷118.75 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液取樣品約0.5 g，精密稱定，置于50 ml具塞錐形瓶中，加80%乙醇40 ml，浸泡30 min，超聲提取30 min，稱定質(zhì)量，用80%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對(duì)照溶液［4］按胃蘇顆粒的處方比例和制備工藝，制備缺陳皮、枳殼、香櫞和佛手的陰性對(duì)照品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液，即得。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度均＞1.5，理論板數(shù)以柚皮苷峰計(jì)≥13 000；柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷保留時(shí)間分別為4.485、4.773、4.987、5.266 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無干擾。

圖1　超高效液相色譜圖A.陰性對(duì)照；B.混合對(duì)照品；C.供試品；1.蕓香柚皮苷；2.柚皮苷；3.橙皮苷；4.新橙皮苷Fig 1　UPLC chromatogramsA.negative control；B.mixed reference substance；C.test sample；1/narirutin；2.naringin；3.hesperidin；4.neohesperidin

2.4線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5、1、2、3、4、5 ml，分別置于5 ml量瓶中，用80%乙醇定容，搖勻，得系列線性溶液。取上述溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以各待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的回歸方程與線性范圍，詳見表1。

表1　回歸方程與線性范圍Tab 1　Regression equations and linear ranges

2.5定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限（LOQ）；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限（LOD），詳見表2。

表2　定量限與檢測(cè)限Tab 2　Quantitation limit and detection limit

2.6精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，柚皮蕓香苷、橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷峰面積的RSD分別為1.54%、0.89%、1.05%、1.10%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號(hào)：13122301）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷峰面積的RSD分別為1.27%、1.18%、1.59%、0.84%（n=6），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)：13122301）6份，每份約0.50 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各成分的平均含量，詳見表3。

表3　重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab 3　Result of reproducibility tests

2.9加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品（批號(hào)：13122301）適量，共6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷柚皮苷對(duì)照品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表4。

2.10樣品含量測(cè)定

取8批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各成分的含量，結(jié)果見表5。

3　討論

3.1提取方法與溶劑的選擇

試驗(yàn)中考察了超聲提取法與加熱回流提取法提取待測(cè)成分的差異。結(jié)果，超聲處理30 min與加熱回流1 h，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的提取率無顯著性差異，考慮超聲提取法簡(jiǎn)便易行，本試驗(yàn)選擇超聲提取法。同時(shí)，還考察了不同體積分?jǐn)?shù)（0、20%、40%、60%、80%、100%）甲醇、乙醇超聲提取對(duì)4種待測(cè)成分提取率的影響。結(jié)果，以80%乙醇作為提取溶劑時(shí)對(duì)4種待測(cè)成分的提取最為完全，且提取液易于過濾。故本試驗(yàn)采用80%乙醇作為提取溶劑。

表4　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab 4　Results of recovery tests（n=6）

表5　樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3，mg/g）Tab 5　Result of contents determination of samples（n=3，mg/g）

3.2檢測(cè)波長的選擇

對(duì)混合對(duì)照品溶液和供試品溶液均采用PDA檢測(cè)器進(jìn)行紫外全波長掃描（200～400 nm）。結(jié)果，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷色譜峰在284 nm處均有最大吸收，并參照相關(guān)文獻(xiàn)［9-11］，本試驗(yàn)最終選擇284 nm為檢測(cè)波長。

3.3流動(dòng)相的選擇

本試驗(yàn)考察了甲醇-0.1%/0.2%磷酸、甲醇-0.5%/1.0%醋酸、乙腈-0.1%/0.2%磷酸、乙腈-0.5%/1.0%醋酸等不同流動(dòng)相系統(tǒng)。結(jié)果，乙腈-0.2%磷酸效果最好，基線最為平穩(wěn)，分析時(shí)間短，各待測(cè)成分分離度高、峰型較好，且液相系統(tǒng)壓力低。故最終選用乙腈-0.2%磷酸作為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。

3.4樣品含量測(cè)定結(jié)果分析

對(duì)8批胃蘇顆粒中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明，蕓香柚皮苷含量為1.019 0～1.552 4 mg/g，平均含量為1.256 8 mg/g；柚皮苷含量為5.864 2～7.644 2 mg/g，平均含量為6.596 6 mg/g；橙皮苷含量為2.785 4～3.481 4 mg/g，平均含量為3.125 5 mg/g；新橙皮苷含量為2.876 4～4.332 8 mg/g，平均含量為3.629 9 mg/g?？梢姡?批樣品間4種成分含量存在一定差異，可能與批次跨度較大、生產(chǎn)原料質(zhì)量存在一定差異有關(guān)，但總體來說8批樣品中4種成分的含量與均值差值較小，較為穩(wěn)定。

綜上所述，本方法快速、高效，適用于同時(shí)測(cè)定胃蘇顆粒中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量。

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（編輯：劉柳）

Simultaneous Determination of Four Components in Weisu Granule by UPLC

GUO Yinrui，ZHANG Guangchang，WANG Jian（College of Basic Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of narirutin，naringin，hesperiden and neohesperiden in Weisu granule.METHODS：UPLC was performed on the column of ACQUITY UPLC BEH C18with mobile phase of acetonitrile-0.2%Phosphoric acid aqueous（gradient elution）at a flow rate of 0.40 ml/min，the detection wavelength was 284 nm，the column temperature was 30℃，and the injection volume was 1 μl.RESULTS：The linear range was 9.38-93.75 μg/ml for narirutin（r=0.999 7），32.25-322.50 μ g/ml for naringin（r=0.999 7），11.25-112.50 μ g/ml for hesperiden（r=0.999 9）and 11.88-118.75 μg/ml for neohesperidin（r=0.999 8）；limits of quantitation were 20 ng，18 ng，18 ng and 18 ng，the limits of detection were 6 ng，5 ng，5 ng and 5 ng，respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 96.24%-103.12%（RSD=2.45%，n=6），98.43%-102.10%（RSD=1.42%，n=6），96.10%-101.41%（RSD= 2.07%，n=6）and 95.57%-99.06%（RSD=1.44%，n=6），respectively.CONCLUSIONS：The method is rapid and efficient，and suitable for the simultaneous determination of narirutin，naringin，hesperiden and neohesperiden in Weisu granule.

UPLC；Weisu granule；Narirutin；Hesperiden；Neohesperidin；Naringin；Content determination

R927.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1001-0408（2016）24-3443-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.41

＊碩士研究生。研究方向：中醫(yī)藥延緩衰老、中草藥成分。電話：020-39358637。E-mail：75706868@qq.com

教授，博士。研究方向：中醫(yī)藥延緩衰老、中草藥成分。E-mail：zswj@gzucm.edu.cn

2015-07-30

2016-05-16）