滕文荃（莒縣中醫(yī)醫(yī)院，山東莒縣　276599）

HPLC法測定瑞戈非尼原料藥中的有關物質(zhì)

滕文荃＊（莒縣中醫(yī)醫(yī)院，山東莒縣276599）

目的：建立測定瑞戈非尼原料藥中有關物質(zhì)的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Waters Atlantis T3C18，流動相為0.1%三氟乙酸-乙腈（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測波長為232 nm，柱溫為35℃，進樣量為10 μl。結(jié)果：AFP-PMA脲（雜質(zhì)A）、FP-二甲基吡啶甲酰胺（雜質(zhì)B）、3，4-雙-CTF-氨基甲酰胺基-PMA（雜質(zhì)C）與主成分瑞戈非尼及其他未知雜質(zhì)均能達到很好的分離；雜質(zhì)A、B、C和瑞戈非尼檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.511～5.108 μg/ml（r=0.999 9）、0.287～2.869 μg/ml（r= 0.999 5）、0.360～3.604 μg/ml（r=0.999 9）和1.444～14.442 μg/ml（r=0.999 8）；檢測限分別為0.052、0.022、0.084和0.071 μg/ml；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD＜3%；雜質(zhì)A、B、C加樣回收率分別為102.7%～106.3%、98.2%～102.9%、98.6%～104.3%，RSD分別為1.09%、1.83%、1.57%（n=9）。結(jié)論：該方法靈敏、快速、準確、可靠，可用于瑞戈非尼原料藥中有關物質(zhì)的測定。

瑞戈非尼；高效液相色譜法；有關物質(zhì)

瑞戈非尼（Regorafenib），化學名為4-［4-（｛［4-氯-3（三氟甲基）苯基］氨甲?；被?3-氟苯氧基］-N-甲基吡啶-2-甲酰胺一水合物，商品名為Stivarga，是由拜耳公司研制開發(fā)的一種多激酶抑制劑（MKI）［1-3］。該藥于2013年2月25日通過美國食品與藥品管理局（FDA）批準用于治療先前接受過伊馬替尼和舒尼替尼治療的局部晚期、不能手術切除或轉(zhuǎn)移性胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）患者［4-6］。目前，瑞戈非尼原料藥中的有關物質(zhì)測定未見報道。筆者根據(jù)瑞戈非尼合成工藝路線及結(jié)構(gòu)確證結(jié)果，確定瑞戈非尼原料藥終產(chǎn)品中可能存在反應副產(chǎn)物AFP-PMA脲（雜質(zhì)A）、FP-二甲基吡啶甲酰胺（雜質(zhì)B）和3，4-雙-CTF-氨基甲酰胺基-PMA（雜質(zhì)C）。為更好地控制瑞戈非尼原料藥的質(zhì)量，本試驗中筆者采用高效液相色譜（HPLC）法對其中的有關物質(zhì)進行了測定。

1　材料

1.1儀器

Waters 2695型HPLC儀，包括2489紫外-可見光檢測器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；XS105型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；

1.2藥品與試劑

3-氟-4-硝基苯酚對照品（起始原料SM1，批號：20140913，純度：98.1%）、N-甲基-4-氯-2-吡啶甲酰胺對照品（起始原料SM2，批號：20140914，純度：98.6%）、3-氟-4-氨基苯酚對照品（中間體RG01，批號：RG01-0803，純度：98.4%）、4-（4-氨基-3-氟苯氧基）-N-甲基吡啶-2-甲酰胺對照品（中間體RG02，批號：RG02-0805，純度：98.8%）、雜質(zhì)A對照品（批號：01-0705，純度：98.8%）、雜質(zhì)B對照品（批號：01-0706，純度：97.8%）、雜質(zhì)C對照品（批號：01-0707，純度：99.0%）、瑞戈非尼對照品（批號：DZ140908，純度：99.94%）、瑞戈非尼原料藥（批號：141001、141002、141003，純度：99.85%、99.76%、99.83%）均由臨沂萊博醫(yī)藥技術有限公司提供；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Waters Atlantis T3C18（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流動相：0.1%三氟乙酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：232 nm；柱溫：35℃；進樣量：10 μl。

2.2溶液的制備

2.2.1供試品溶液取樣品適量，精密稱定，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）溶解并稀釋制成每1 ml中約含瑞戈非尼0.7 mg的溶液，搖勻，即得。

2.2.2系統(tǒng)適用性溶液取瑞戈非尼合成工藝路線中的各起始原料、各中間體、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C和瑞戈非尼對照品各適量，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）制成一定質(zhì)量濃度的混合溶液，即得。

表1　梯度洗脫程序Tab 1　Gradient elution program

2.2.3雜質(zhì)混合對照品貯備液分別精密稱取雜質(zhì)A對照品6.72 mg、雜質(zhì)B對照品4.30 mg、雜質(zhì)C對照品4.56 mg，各置于10 ml量瓶中，分別用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）溶解并定容，搖勻，分別精密量取上述3種溶液各1 ml，置于同一50 ml量瓶中，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）定容，搖勻，即得。

2.2.4瑞戈非尼對照品貯備液精密稱取瑞戈非尼對照品18.78 mg，置于25 ml量瓶中，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）溶解并定容，搖勻，精密量取5 ml，置于100 ml量瓶中，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）定容，即得。

2.3系統(tǒng)適用性與強制降解試驗

2.3.1系統(tǒng)適用性試驗取“2.2”項下供試品溶液、系統(tǒng)適用性溶液各適量，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果表明，各起始原料、各中間體、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C與主成分瑞戈非尼峰均有較好的分離，相鄰成分峰的分離度均＞1.5，理論板數(shù)以瑞戈非尼峰計＞4 000。

圖1　系統(tǒng)適用性試驗高效液相色譜圖A.系統(tǒng)適用性溶液；B.供試品溶液；1.中間體RG01；2.起始原料SM2；3.中間體RG02；4.起始原料SM1；5.雜質(zhì)A；6.雜質(zhì)B；7.瑞戈非尼；8.雜質(zhì)CFig 2　HPLC chromatograms of system suitability test A.system suitability solution；B.test sample solution；1.intermediate 01；2.starting material SM2；3.intermediate 02；4.starting material SM1；5/impurityA；6.impurity B；7.regorafenib；8.impurity C

2.3.2強制降解試驗 （1）酸破壞試驗：取樣品7.69 mg，置于10 ml量瓶中，加乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）5 ml使溶解，加2 mol/L鹽酸溶液0.5 ml，置于70℃水浴中放置48 h，取出冷卻至室溫，加入2 mol/L的氫氧化鈉溶液0.5 ml調(diào)溶液至中性，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）定容，搖勻。（2）堿破壞試驗：取樣品7.38 mg，置于10 ml量瓶中，加乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）5 ml使溶解，加2 mol/L氫氧化鈉溶液0.5 ml，置于70℃水浴中放置24 h，取出冷卻至室溫，加入2 mol/L的鹽酸溶液0.5 ml調(diào)節(jié)溶液至中性，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）定容，搖勻。（3）氧化破壞試驗：取樣品7.58 mg，置于10 ml量瓶中，加乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）5 ml使溶解，加30%雙氧水溶液0.5 ml，置于70℃水浴中放置3 h，取出冷卻至室溫，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）定容，搖勻。（4）光照破壞試驗：取樣品7.25 mg，置于10 ml量瓶中，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）溶解并定容，搖勻，置于可見光燈（光照強度約為4 500 lx）下照射40 h。（5）高溫破壞試驗：取樣品7.93 mg，置于130℃烘箱中加熱2 h，取出放至室溫，加乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）適量溶解，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）定容，搖勻。分別取上述5種破壞試驗溶液各10 μl注入HPLC儀，記錄色譜，詳見圖2。結(jié)果表明，樣品在酸、堿、氧化、光照、高溫破壞下均有降解產(chǎn)物產(chǎn)生；雜質(zhì)A在各破壞條件下均出峰，而雜質(zhì)B和雜質(zhì)C在有的破壞條件下未出峰；雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C峰與降解產(chǎn)物峰和主峰均能達到較好的分離。

圖2　強制降解試驗高效液相色譜圖A.酸破壞的樣品；B.堿破壞的樣品；C.氧化破壞的樣品；D.光照破壞的樣品；E.高溫破壞的樣品；1.雜質(zhì)A；2.雜質(zhì)B；3.瑞戈非尼；4.雜質(zhì)CFig 2　HPLC chromatograms of stress testA.sample destroyed by acid；B.sample destroyed by alkali；C.sample destroyed by oxidation；D.sample destroyed by light；E.sample destroyed by high temperature；1.impurity A；2.impurity B；3.regorafenib；4.impurity C

2.4線性關系考察

分別精密量取“2.2.3”項下雜質(zhì)混合對照品貯備液1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 ml和“2.2.4”項下瑞戈非尼對照品貯備液1.0、2.0、5.0、7.0、10.0 ml，一一對應置于同一25 ml量瓶中，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）定容，搖勻，作為系列線性工作溶液（1#～5#），分別精密量取10 μl注入HPLC儀，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表2。

表2　回歸方程與線性范圍Tab 2　Regression equations and linear ranges

2.5檢測限

取“2.2”項下雜質(zhì)混合對照品貯備液和瑞戈非尼對照品貯備液各適量，逐級稀釋，制備系列質(zhì)量濃度的混合溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，當信噪比為3時測得檢測限。結(jié)果，雜質(zhì)A、B、C和瑞戈非尼的檢測限分別為0.052、0.022、0.084和0.071 μg/ml。

2.6精密度試驗

取雜質(zhì)A、B、C對照品各適量，置于同一量瓶中，制成質(zhì)量濃度均約為7 μg/ml的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，雜質(zhì)A、B、C峰面積的RSD分別為0.97%、0.57%、0.62%（n=6），說明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗

精密稱取樣品（批號：141001）17.76 mg，置于25 ml量瓶中，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）溶解并定容，搖勻，作為供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、16、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，雜質(zhì)A、B、C和瑞戈非尼峰面積的RSD分別為2.66%、0.35%、0.58%和0.83%（n=9），說明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8重復性試驗

取同一批樣品（批號：141001）適量，共6份，分別按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，雜質(zhì)A、B、C和瑞戈非尼峰面積的RSD分別為0.93%、1.02%、0.89%和0.86%（n=6），說明本方法重復性良好。

2.9加樣回收率試驗

精密量取“2.2.3”項下雜質(zhì)混合對照品貯備液1 ml，置于10 ml量瓶中，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）定容，搖勻，分別精密量取2.0、3.0、4.0 ml，各3份，分別置于含樣品（批號：141003）17.32、17.15、17.87、18.00、17.15、17.39、17.52、17.92、18.23 mg的25 ml量瓶中，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）溶解并定容，搖勻，作為低、中、高質(zhì)量濃度的雜質(zhì)加樣回收率試驗溶液，精密量取各10 μl，分別注入HPLC儀，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.10樣品中有關物質(zhì)測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液；并精密量取上述各批供試品溶液1 ml，分別置于100 ml量瓶中，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）定容，搖勻，作為對照溶液。取上述兩種溶液各適量，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，以自身對照法計算各有關物質(zhì)的含量，結(jié)果見表4。

3　討論

3.1檢測波長的選擇

根據(jù)合成工藝中各起始原料、各中間體、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、瑞戈非尼的紫外掃描圖譜以及樣品強制降解試驗中的降解產(chǎn)物的二極管陣列檢測器掃描圖譜，發(fā)現(xiàn)使用232 nm波長進行檢測時，可將各雜質(zhì)成分有效檢出，分離度較好。故最終選擇232 nm為本試驗檢測波長。

3.2流動相的選擇

本試驗參考相關文獻［7-10］，選擇流動相A為0.1%三氟乙酸溶液、流動相B為乙腈，并對流動相系統(tǒng)的洗脫方式進行了考察。在等度洗脫條件下主峰相鄰雜質(zhì)分離度不理想，個別雜質(zhì)出峰較晚；而采用表1所示梯度洗脫程序時，主成分與各雜質(zhì)均能達到有效分離，且各峰純度都達100%。故本試驗最終選擇該流動相系統(tǒng)和梯度洗脫程序進行洗脫。

3.3雜質(zhì)A、B、C的定量

本試驗中將雜質(zhì)A、B、C作為已知雜質(zhì)進行研究，雜質(zhì)A、B的校正因子均不在0.9～1.1范圍內(nèi)，對其按照加校正因子的自身對照法定量，雜質(zhì)C及未知雜質(zhì)按照不加校正因子的自身對照法進行定量。

表3　加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）Tab 3　Results of recovery test（n=9）

表4　樣品有關物質(zhì)測定結(jié)果（n=3，%）Tab 4　Determination results of related substances（n=3，%）

綜上所述，本方法靈敏、快速、準確、可靠，可用于瑞戈非尼原料藥中有關物質(zhì)的測定。

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（編輯：周箐）

Determination of Related Substances in Regorafenib by HPLC

TENG Wenquan（Chinese Medicine Hospital In Juxian，Shandong Juxian 276599，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determination of related substances in regorafenib.METHODS：Gradient elution HPLC was performed on the column of Waters Atlantis T3C18with mobile phase A of 0.1%Trifluoroacetic acid solution and B of acetonitrile（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 232 nm and column temperature was 35℃，injection volume was 10 μl.RESULTS：AFP-PMA urease（impurity A），F(xiàn)P-dimethyl pyridine carboxamide（impurity B），3，4-bis-CTF-aminoformamido-PMA（impurity C），regorafenib and other impurities were well separated；the linear range was 0.511-5.108 μg/ml for impurity A（r=0.999 9），0.287-2.869 μg/ml for impurity B（r=0.999 5），0.360-3.604 μg/ml for impurity C （r=0.999 9）and 1.444-14.442 μg/ml for regorafenib（r=0.999 8）；the detection limit were 0.052，0.022，0.084 and 0.071 μg/ml，respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 3%；recoveries of impurity A，B and C were 102.7%-106.3%（RSD=1.09%，n=9），98.2%-102.9%（RSD=1.83%，n=9）and 98.6%-104.3%（RSD=1.57%，n=9）.CONCLUSIONS：The method is sensitive，rapid，accurate and reliable，and can be used for the determination of related substances in regorafenib.

Regorafenib；HPLC；Related substance

R927文獻標志碼A

1001-0408（2016）24-3431-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.37

＊主管藥師。研究方向：醫(yī)院藥學。電話：0633-6891102。E-mail：pharm_2012@126.com

2015-08-31

2016-07-13）