孫　婷，姜建國，張　菁，耿　韞（河北省藥品檢驗研究院，石家莊　050011）

HPLC法測定比沙可啶腸溶片含量的測量不確定度評定

孫婷＊，姜建國，張菁，耿韞（河北省藥品檢驗研究院，石家莊050011）

目的：建立測定比沙可啶腸溶片含量的測量不確定度的評定方法。方法：采用高效液相色譜（HPLC）外標法測定比沙可啶腸溶片的含量，并建立評定其不確定度的數(shù)學模型，對來自于溶液配制過程和儀器測定過程的各種不確定度影響因素進行系統(tǒng)分析并予以評估。結(jié)果：HPLC外標法測定比沙可啶腸溶片的含量為97.8%，置信概率為95%時，其擴展測量不確定度為2.8%，測量結(jié)果表示為（97.8±2.8）%，k=2。結(jié)論：建立的方法適用于HPLC外標法測定比沙可啶腸溶片含量的測量不確定度評定。HPLC儀器的定期校準檢定和稱量過程的嚴格控制有利于提高HPLC法測定的準確度。

高效液相色譜法；比沙可啶腸溶片；含量測定；測量不確定度評定

比沙可啶腸溶片為2015年版《中國藥典》（二部）收載的品種，是國外20世紀50年代末上市的優(yōu)良緩瀉藥，臨床上主要通過與腸黏膜直接接觸刺激其感覺神經(jīng)末梢而增強腸反射性蠕動，導致排便［1］。筆者在前期研究中對比沙可啶腸溶片的含量進行了測定。本研究中，筆者參考相關(guān)文獻［2-8］，依次按照建立數(shù)學模型、分析不確定度來源以及計算不確定度分量、合成標準不確定度和擴展不確定度的過程，對高效液相色譜（HPLC）外標法測定比沙可啶腸溶片含量的測量不確定度進行了評定，旨在為提高比沙可啶腸溶片的質(zhì)量評價與控制水平提供科學依據(jù)。

1　材料

1.1儀器

1260型HPLC儀，包括1260泵、UV檢測器和EZChrom色譜工作站（美國安捷倫公司）；XS105型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；50 ml量瓶級別為A級。

1.2藥品與試劑

比沙可啶對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100181-200402，純度：100.0%）；比沙可啶腸溶片（A公司，批號：30901，規(guī)格：5 mg）；乙腈（色譜純，美國Fisher Chemical公司）；乙酸銨（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；冰乙酸（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）；水為超純水。

2　方法與結(jié)果

色譜柱：Agilent ZORBAX C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-20 mmol/L乙酸銨（冰乙酸調(diào)pH至5.0）（55∶45，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：265 nm；柱溫：30℃；進樣量：20μl。在上述色譜條件下，比沙可啶峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度符合要求。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液取比沙可啶對照品適量，精密稱定，加冰乙酸-乙腈-水（4∶30∶66，V/V/V）溶解并制成每1 ml中約含0.2 mg比沙可啶的對照品溶液。

2.2.2供試品溶液取樣品20片，除去包衣后，精密稱定，研細，精密稱取適量（約相當于比沙可啶10 mg），置于50 ml量瓶中，加冰乙酸-乙腈-水（4∶30∶66，V/V/V）溶解并定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3空白輔料溶液精密稱取生產(chǎn)企業(yè)處方中包含的所有輔料適量，按“2.2.2”項下方法進行操作，制成空白輔料溶液。

2.3方法學驗證

本部分內(nèi)容參見文獻［9］。

2.4樣品含量測定

靶區(qū)和正常組織勾畫：依據(jù)RTOG Breast Cancer Contouring Atlas[1]標準，在Pinnacle 9.8計劃系統(tǒng)中，勾畫臨床靶區(qū)CTV，勾畫正常組織：同側(cè)肺、對側(cè)肺、心臟、對側(cè)乳腺、甲狀腺等。計劃靶區(qū)PTV由臨床靶區(qū)CTV均勻外放0.5 cm得到。

分別精密量取“2.2”項下對照品溶液和供試品溶液各20 μl，注入HPLC儀，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按外標法計算含量。結(jié)果，比沙可啶腸溶片的含量測量結(jié)果為97.8%

3　測量不確定度評定

3.1建立數(shù)學模型

以比沙可啶腸溶片含量計算公式作為測量不確定度評定的數(shù)學模型。根據(jù)測定的原理和過程，比沙可啶腸溶片含量計算公式為：

式中，Y：供試品中比沙可啶的標示百分含量；AX：供試品的峰面積；AR：對照品的峰面積；WX：供試品的稱樣量；WR：對照品的稱樣量；VX：供試品溶液的稀釋體積；VR：對照品溶液的稀釋體積；PR：對照品的純度；W：供試品平均片質(zhì)量；標示量：5 mg/片。由上式可知，比沙可啶腸溶片含量測定的不確定度來源于對照品的純度、對照品的稱樣量、對照品溶液的稀釋體積、對照品的峰面積、供試品的峰面積、供試品的稱樣量、供試品溶液的稀釋體積、供試品平均片質(zhì)量。

3.2識別測量不確定度的來源

有關(guān)測量不確定度的來源見圖1。

圖1　測量不確定度分量因果圖Fig 1　Cause-effect diagram of uncertainty components

3.3測量不確定度分量的量化分析

3.3.1PR的相對標準不確定度urel（PR）屬B類測量不確定度。PR的不確定度包括由定值的測量方法引入的不確定度、協(xié)作標定試驗的不確定度、由非均勻性和不穩(wěn)定性引入的不確定度等［10］。比沙可啶對照品由中國食品藥品檢定研究院提供，純度為100.0%，其分散區(qū)間的半峰寬α=0.05%，P= 100%），按矩形分布（均勻分布）計算2.88×10-4。

3.3.2WR相對標準不確定度ure（lWR）其不確定度來源有2個：天平示值和天平稱量的重復性。（1）天平示值的不確定度分析：屬B類不確定度。根據(jù)所用電子天平的計量檢定證書所述，該天平最大允許誤差為±0.1 mg，按矩形分布計算，k=，經(jīng)計算其標準不確定度mg。（2）天平稱量重復性的不確定度分析：屬B類不確定度。根據(jù)所用電子天平的計量檢定證書所述，該天平的稱量重復性誤差為0.02 mg，按矩形分布計算，其標準不確定度u（WR2）=則天平單次稱量的標準不確定度為因稱量過程使用減重法，故其不確定度10-2mg。對照品稱取2份，稱樣量分別為10.22 mg和10.25 mg，則

3.3.4AR的相對標準不確定度ure（lAR）其不確定度來源為進樣重復性。屬A類不確定度。樣品溶液測定過程中受進樣體積重復性、泵流速穩(wěn)定性、分離重復性、組分在色譜柱等滯留變化、檢測器穩(wěn)定性、積分變動性等隨機變化的影響。以上在進樣、分離、檢測過程中產(chǎn)生的隨機影響，可合并為進樣重復性進行測量［10］。對照品兩個平行樣，分別連續(xù)進樣5次和2次。對照品峰面積測定結(jié)果見表1。

表1　對照品峰面積測定結(jié)果Tab 1　Determination result of the peak area for the standard

3.3.6VX的不確定度urel（VX）供試品稀釋過程與對照品相同，此不確定度分量的分析同“3.3.3”項。則urel（VX）=7.50× 10-4。

3.3.7AX的相對標準不確定度urel（AX）此不確定度分量的分析同“3.3.4”項。供試品2個平行樣，每個樣進2針，所用HPLC儀檢定證書給出的定量測量重復性RSD=0.4%（n=6）。供試品峰面積測定結(jié)果見表2。

表2　供試品峰面積測定結(jié)果Tab 2　Determination result of the peak area for the test sample

因檢測次數(shù)較少，采用極差法計算AX引入的不確定度。當n=2時，極差系數(shù)C=1.13。計算得到

3.4計算不確定度各分量的合成相對標準不確定度uc，rel

不確定度各分量的相對標準不確定度見表3。

經(jīng)計算，含量測定的合成相對標準不確定度uc，rel=（［urel（PR））2+（ure（lWR））2+（ure（lVR））12+（ure（lAR））2+（ure（lWX））2+（urel（VX））2+（ure（lAX））2+（ure（lW））2］2=［（2.88×10-4）2+（1.14×10-2）2+ （7.50×10-4）2+（5.36×110-7）2+（5.41×10-3）2+（7.50×10-4）2+（8.48× 10-7）2+（2.11×10-3）2］2=1.44×10-2。因測得比沙可啶腸溶片含量=97.8%，則合成標準不確定度u（cX）=97.8%×1.44×10-2= 1.41%。

3.5給出擴展不確定度U

測量結(jié)果符合正態(tài)分布，取置信概率為95%，包含因子k=2，則U=2×1.41%=2.8%。

表3　不確定度各分量的相對標準不確定度Tab 3　Relative standard uncertainty of the each component

3.6測量不確定度報告

HPLC外標法測定比沙可啶腸溶片含量的測量結(jié)果表示為：X=（97.8±2.8）%，k=2。

4　討論

研究結(jié)果顯示，采用HPLC外標法測定比沙可啶腸溶片含量的不確定度主要來自于對照品稱量的相對不確定度，且HPLC儀器的定期校準檢定和稱量過程的嚴格控制有利于提高HPLC法測定的準確度。筆者所采用的色譜條件屬于測定比沙可啶腸溶片含量的新方法，在進行方法學驗證的基礎(chǔ)上，建立其測量不確定度評定方法十分重要，可為同品種不同劑型不確定度模型建立及評定提供可靠的參考依據(jù)。

［1］李穎，劉世寬，郝志剛.結(jié)腸定位給藥制劑-比沙可啶速釋片的研制［J］.山東醫(yī)藥工業(yè)雜志，2000，19（3）：7.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部［S］.2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：74.

［3］國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.測量不確定度評定與表示JJF1059-1999［S］.北京：中國計量出版社，1999：1 569-1 587.

［4］中國合格評定國家認可委員會.化學分析中不確定度的評估指南CNAS-GL06［S］.北京：中國計量出版社，2006：6-38.

［5］國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.常用玻璃量器檢定規(guī)程JJG196-2006［S］.北京：中國計量出版社，2006：6-8.

［6］倪育才.實用測量不確定度評定［M］.北京：中國計量出版社，2004：27-34.

［7］陸明，范國榮，汪楊，等.測量不確定度在藥品領(lǐng)域的應用［J］.醫(yī)藥導報，2013，32（8）：1 053.

［8］秦立，王瑩，張利，等.HPLC測定氯氮平片含量的測量不確定度評定［J］.中國現(xiàn)代應用藥學，2015，32（2）：189.

［9］張西如，孫婷，姜建國，等.HPLC法測定比沙可啶腸溶片的含量及含量均勻度［J］.中國藥房，2016，27（18）：2 573.

［10］孫婷，韓學靜，姜建國，等.HPLC測定注射用長春西汀含量的不確定度評定［J］.華西藥學雜志，2013，28（4）：401.

［11］EURACHEM/CITAC Guide.量化分析測量不確定度指南［M］.劉立，譯.北京：中國計量出版社，2003：129.

［12］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部［S］.2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：通則0101 3-4.

（編輯：周箐）

Evaluation of Measurement Uncertainty for the Content of Bisacodyl Enteric-coated Tablet by HPLC

SUN Ting，JIANG Jianguo，ZHANG Jing，GENG Yun（Hebei Institute for Drug Control，Shijiazhuang 050011，China）

OBJECTIVE：To a evaluation method for the measurement uncertainty for the content of Bisacodyl enteric-coated tablet.METHODS：HPLC external standard method was conducted for content determination of Bisacodyl enteric-coated tablet，and mathematical model for uncertainty evaluation was established to systematically analyze and evaluate the influential factors in processes of solution preparation and instrument measurement.RESULTS：HPLC external standard method showed the content was 97.8%，confidence probability was 95%，expanded uncertainty was 2.8%，and determination result was（97.8±2.8）%，k=2/CONCLUSIONS：The established method is suitable for the evaluation of measurement uncertainty for the content of Bisacodyl enteric-coated tablet.Regularly calibrated verification for HPLC equipment and strict control of the weighing process will help to improve the accuracy measured by HPLC.

HPLC；Bisacodyl enteric-coated tablet；Content determination；Evaluation of measurement uncertainty

R927文獻標志碼A

1001-0408（2016）24-3428-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.36

＊主管藥師。研究方向：藥物檢驗和雜質(zhì)鑒定。E-mail：122547652@qq.com

2015-12-10

2016-07-18）