吳桂凡，黃清泉，謝培德，羅　軼（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所，南寧　530021）

HPLC法測定溪黃草藥材中迷迭香酸的含量

吳桂凡＊，黃清泉，謝培德，羅軼（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所，南寧530021）

目的：建立測定溪黃草藥材中迷迭香酸含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Inertsil ODS-SP C18，流動相為乙腈-0.4%磷酸（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測波長為327 nm，柱溫為25℃，進樣量為10 μl。結果：迷迭香酸的檢測質量濃度線性范圍為5.039～100.776 μg/ml（r=0.999 6）；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD＜3%；迷迭香酸的加樣回收率為99.53%～104.86%（RSD=2.06%，n=9）。結論：該方法操作簡單、重復性好、準確度高，可用于測定溪黃草藥材中迷迭香酸的含量。

溪黃草；高效液相色譜法；迷迭香酸

溪黃草俗稱熊膽草、血風草、黃汁草、香茶菜、手擦黃等，生長于山谷溪旁潮濕處，新鮮葉片揉搓有棕黃色液汁而得名。其主要分布于長江以南的湖南、湖北、廣東、廣西、江西、福建等地。溪黃草在南方各地臨床應用普遍，具有清熱利濕、退黃、涼血散瘀的功效，可用于治療濕熱黃疸、濕熱瀉痢、急性膽炎、急性膽囊炎、痢疾、腸炎、癃閉、跌打瘀腫等疾?。?］。但溪黃草來源復雜，《中華本草》中溪黃草來源為唇形科植物溪黃草和線紋香茶菜的全草［2］；《廣西中藥材標準》（第二冊）中溪黃草植物來源為唇形科植物線紋香茶菜的干燥地上部分［3］；而《廣西中藥材標準》（第二冊）將來源為溪黃草的藥材命名為藍花柴胡［3］，分為線紋香茶菜和溪黃草兩個不同的藥材來源；《廣東中藥材標準》（第二冊）將溪黃草來源分為線紋香茶菜以及其變種纖花香茶菜或溪黃草［4］。現(xiàn)主要栽培的品種為線紋香茶菜Isodon lophanthoides（Buch.-Ham.ex D.Don）H.Hara、纖花香茶菜I.lophanthoides（Buch.-Ham.ex D.Don）H.Hara var.graciliflorus（Benth.）H.Hara和溪黃草I.serra Maxim.，此3個品種在野外也有分布。隨著中藥發(fā)展及中成藥生產規(guī)模的不斷擴大，溪黃草的應用也越來越廣泛，但地方標準只有顯微鑒別和薄層鑒別，未制定含量測定指標。為此，筆者以溪黃草主要栽培的3個品種為對象，采用高效液相色譜法（HPLC）測定其迷迭香酸的含量，以期為溪黃草藥材的質量控制提供參考。

1　材料

1.1儀器

1260型HPLC儀，包括二極管陣列（DAD）檢測器、G1329B型自動進樣器（美國Agilent公司）；CP224S型萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）；XP205型十萬分之一分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；MILLI-QA10型超純水儀（美國Millipore公司）

1.2試劑

迷迭香酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111871-201203，純度＞98.8%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為高純水。

1.3藥材

溪黃草藥材經筆者實地采集，以及自廣東、廣西、福建、河南、河北等地購買，經廣西食品藥品檢驗所中藥民族藥室主管藥師黃清泉鑒定分別為線紋香茶菜 I.lophanthoides （Buch.-Ham.ex D.Don）H.Hara（編號：XW-1～10）（10份）、纖花香茶菜I.lophanthoides（Buch.-Ham.ex D.Don）H.Hara var/graciliflorus（Benth.）H.Hara.（編號：XH-1～10）（10份）和溪黃草I.serra Maxim.（編號：XHC-1～10）（10份）。

2　方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-SP C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.4%磷酸（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：327 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μl。

表1　梯度洗脫程序Tab 1　Gradient elution program

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液取迷迭香酸對照品適量，置于50 ml量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，制成每1 ml含迷迭香酸0.201 6 mg的溶液，作為對照品貯備液；精密量取上述對照品貯備液適量，加50%甲醇制成每1 ml含迷迭香酸40 μg的對照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2供試品溶液取樣品粉末適量，過2號篩，取約1 g，精密稱定，置于150 ml具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，稱定質量，水浴加熱回流60 min，放冷，再次稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項下對照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞1.5，理論板數(shù)以迷迭香酸峰計為18 842，保留時間為54.029 min。結果表明，其他成分對測定無干擾。

2.4線性關系考察

精密稱取“2.2.1”項下對照品貯備液0.25、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，各分別置于10 ml量瓶中，用50%甲醇定容，搖勻，即得不同質量濃度的系列對照品溶液。分別精密量取上述系列對照溶液各10 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以迷迭香酸的質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得迷迭香酸的回歸方程為y=27.976x-14.797（r= 0.999 6）。結果表明，迷迭香酸的檢測質量濃度線性范圍為5.039～100.776 μg/ml。

2.5精密度試驗

取“2.2.1”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果，迷迭香酸峰面積的RSD=0.68%（n=6），表明儀器精密度良好。

圖1　高效液相色譜圖A.對照品；B.溪黃草供試品；C.線紋香茶菜供試品；D.纖花香茶菜供試品；1.迷迭香酸Fig 1　HPLC chromatogramsA.reference substance of rosmarinic acid；B.test sample of I.lophanthoides；C.test sample of I.lophanthoides；D.test sample of I.lophanthoides；1.rosmarinic acid

2.6穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、4、10、16、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，迷迭香酸峰面積的RSD=0.84%（n=6），表明供試品溶液在室溫下24 h內穩(wěn)定性良好。

2.7重復性試驗

取樣品（編號：XW-10）適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，迷迭香酸峰面積的RSD=2.39%（n=5），表明本方法重復性良好。

2.8加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（編號：XW-10）0.5 g，共9份，分別加入低、中、高質量的迷迭香酸對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

2.9樣品含量測定

取不同編號的樣品粉末各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算迷迭香酸的含量（按干燥品計），結果見表3。

3　討論

3.1含量指標的選擇

溪黃草主要含酚類、酸類、萜類等［5］，3種來源的溪黃草均含有酚類化合物迷迭香酸和咖啡酸［6］，這兩種成分均具有抗氧化作用，與溪黃草的抗氧化抗炎作用一致［7］。因在溪黃草中迷迭香酸的相對含量較大，咖啡酸含量太小，故本試驗選擇迷迭香酸為含量控制指標。

表2　加樣回收率試驗結果（n=9）Tab 2　Results of recovery test（n=9）

表3　樣品含量測定結果（n=3）Tab 3　Results of content determination of sample（n=3）

3.2檢測波長的選擇

選擇檢測波長時，筆者參考相關文獻［6，8］通過DAD檢測器考察，發(fā)現(xiàn)在327 nm波長處迷迭香酸有最大吸收，特征圖譜所得的色譜信息也較多，故選擇327 nm為本試驗的檢測波長。

3.3對測定結果的分析

由于溪黃草來源分為3個種，各地方習用藥材也不統(tǒng)一［9］，不同種間成分差異也較大［10-12］，即使同種藥材不同產地間成分也存在差異；另外采收季節(jié)不同和干燥方法不同也對迷迭香酸的含量有較大影響［13］。從測定的30批溪黃草中迷迭香酸含量結果來看，線紋香茶菜含量較高（為0.394%～1.80%），纖花香茶菜次之（為0.150%～0.579%），溪黃草含量最低（為0.055%～0.626%）。表明溪黃草的3個來源之間有明顯差異。

綜上所述，本方法操作簡單、重復性好、準確度高，可用于測定溪黃草藥材中迷迭香酸的含量。

［1］江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典：下冊［M］.上海：上?？茖W技術出版社，1997：2 511.

［2］國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會：中華本草［M］.上海：上?？茖W技術出版社，1999：154-156.

［3］廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳.廣西中藥材標準：第二冊［S］.南寧：廣西科學技術出版社，1996：268、278.

［4］廣東省食品藥品監(jiān)督管理局.廣東中藥材標準：第二冊［S］.廣州：廣東科學技術出版社，2011：347.

［5］謝興亮，盛艷梅.溪黃草研究進展［J］.醫(yī)藥導報，2011，30 （4）：494.

［6］魯芹飛，唐海明，陳玲玲，等.狹基線紋香茶菜（溪黃草）咖啡酸和迷迭香酸的薄層鑒別與含量測定［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（22）：114.

［7］周丹，劉艾琳，杜冠華.迷迭香酸的藥理作用研究進展［J］.中國新藥雜志，2011，20（7）：594.

［8］陳向東，朱德全，張光大，等.HPLC測定溪黃草配方顆粒中咖啡酸、牡荊苷、迷迭香酸的含量［J］.中藥材，2013，36 （9）：1 530.

［9］鄧喬華，張為良，王德勤，等.《中國藥典》2010年版成方制劑中溪黃草基原的探討［J］.中國藥品標準，2013，14 （1）：5.

［10］劉方樂，陳德金，馮秀麗，等.溪黃草的化學成分研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2016，27（2）：242.

［11］Zhou WT，Xie HH，Wu P，et al.Abietane diterpenoids from Isodon lophanthoides var.graciliflorus and their cytotoxicity［J］.Food Chem，2013（136）：1 110.

［12］唐海明，陳建南，張揚，等.HPLC法同時測定不同來源溪黃草藥材中8個水溶性成分的含量［J］.藥物分析雜志，2015，35（2）：228.

［13］馮泓瑞，朱德全，黃松，等.不同采收期、加工方法對溪黃草中咖啡酸和迷迭香酸含量的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（22）：71.

（編輯：劉柳）

Determination of RosmarinicAcid in Herba Rabdosiae Serrae by HPLC

WU Guifan，HUANG Qingquan，XIE Peide，LUO Yi（Institute for Food and Drug Control in Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530021，China）

OBJECTIVE：To establish a method for rosmarinic acid in Herba Rabdosiae Serrae.METHODS：HPLC method was performed on the column of Inertsil ODS-SP C18with mobile phase of acetonitrile-0.4%phosphoric acid（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 327 nm，column temperature was 25℃，and injection volume 10 μl.RESULTS：The linear range of rosmarinic acid was 5.039-100.776 μg/ml（r=0.999 6），RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 3%；recovery was 99.53-104.38%（RSD=2.06%，n=9）.CONCLUSIONS：The method is simple with good reproducibility and high accuracy，and can be used for the content determination of rosmarinic acid in Herba Rabdosiae Serrae.

Herba Rabdosiae Serrae；HPLC；Rosmarinic acid

R927.2文獻標志碼A

1001-0408（2016）24-3422-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.34

＊主管藥師，碩士。研究方向：藥物標準及質量控制。電話：0771-5828498。E-mail：26785128@qq.com

2015-08-30

2016-06-16）