高　強，李　明，李榮玉，鄭　麗，胡賢峰

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31%檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑制備及其對稻瘟病菌的抑制作用

高強1,2，李明2,3*，李榮玉2,3，鄭麗1,2，胡賢峰2

(1.貴州大學 精細化工研究開發(fā)中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 作物保護研究所，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學 貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

為了提高檸檬醛的田間使用效果，進行了檸檬醛水劑的制備及其生物活性研究。通過不同乳化劑、滲透劑、防腐劑等助劑的優(yōu)化篩選實驗，確定了檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑的最優(yōu)配方，并對制劑進行了室內(nèi)生物活性測定。結果表明：檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑的最佳配方為31%檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精包合物、10%OP-15、5%滲透劑T、0.5%山梨酸鉀、蒸餾水補足至100%；并且制劑的各項理化性能優(yōu)良，符合水劑的質(zhì)量技術指標。31%檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑對水稻稻瘟病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)均有較好的抑制作用，其EC50值分別為21.37、35.63 μg/mL。檸檬醛水劑的研制，為檸檬醛的田間使用提供一種方法。

檸檬醛；水劑；表面活性劑；水稻稻瘟病病菌

檸檬醛(citral)為開鏈單萜類有機化合物，主要存在于山蒼子油、檸檬草油和楓茅油等植物精油中[1-3]，由于具有濃郁香氣、天然無毒以及抗氧化活性，被作為防腐劑、芳香劑及調(diào)味劑等廣泛應用在化妝品、食品工業(yè)等領域中[4-5]。近年來隨著研究的不斷深入，有關檸檬醛殺蟲殺菌活性的報道日益增多，張文平等[6]研究發(fā)現(xiàn)，檸檬醛具有較高的抗黃曲霉活性；盧春等[7]研究表明，檸檬醛對水稻稻瘟病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)均具有較好的抑制作用。因此，檸檬醛是一種極具有開發(fā)前景的無公害植物源殺菌劑。由于檸檬醛難溶于水，易溶入乙醇、乙醚、礦物油等有機溶劑，且理化性狀不穩(wěn)定，易揮發(fā)、氧化而失去生物活性，一般加工的制劑不穩(wěn)定。本研究利用檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的水溶性，將檸檬醛加工成水劑，加工工藝簡單、損耗小、成本低。制劑的加工或施用對環(huán)境污染小，符合農(nóng)藥制劑環(huán)保型的要求，同時也適應當前農(nóng)藥劑型水基化的發(fā)展趨勢，為檸檬醛的田間使用提供一種可行性方法。

1　材料與方法

1.1供試材料

1.1.1儀器AL104分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(江蘇金壇中大儀器廠)；超凈工作臺(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；HJ-6多頭磁力加熱攪拌器(金壇市盛藍儀器制造有限公司)；數(shù)顯鼓風干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司)；GXZ智能型培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)；生物顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)；移液槍(上海賽默飛儀器有限公司)；玻璃儀器：100、250 mL燒杯，250 mL具塞量筒，1、5、10 mL移液管。

1.1.2試劑檸檬醛(本實驗室從山蒼子精油中分離提取)；檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精包合物(檸檬醛含量≥6.48%，本實驗室制備)；表面活性劑：OP-15、NP-10、A-110、T-60、O-10、MOA-9、BY-140，滲透劑T、JFC-2(江蘇省海岸石油化工廠)；防腐劑：苯甲酸鈉、山梨酸鉀、水楊酸鈉(天津市科密歐化學試劑有限公司); 6%春雷霉素可濕性粉劑(華北制藥股份有限公司)。

1.1.3供試病原菌水稻稻瘟病病菌ZB15(Magnaporthegrisea)采自田間自然發(fā)病水稻植株上的病菌，經(jīng)本實驗室分離、純化、鑒定后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2實驗方法

1.2.1檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑配制方法

按照一定量的比例，將檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精包合物、表面活性劑、助劑和水加入燒杯中，于磁力攪拌器上攪拌均勻，即得31%檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑[8-9]。

1.2.2理化性能測定

依據(jù)水劑的特點，分別測定制劑乳液的穩(wěn)定性、pH值、冷貯和熱貯穩(wěn)定性等。

乳液穩(wěn)定性測定：取1 mL制劑，用342 mg/L標準硬水稀釋200倍于具塞量筒中，置于(30±1)℃恒溫水域中1小時，上無浮油，下無沉淀為合格。冷貯穩(wěn)定性測定：參照GB/T 19137-2003農(nóng)藥低溫穩(wěn)定性測定方法進行。熱貯穩(wěn)定性測定：參照GB/T 19136-2003農(nóng)藥熱貯穩(wěn)定性測定方法進行。起泡性實驗：量取2.5 mL制劑于250 mL燒杯中，加入342 mg/L的200 mL標準硬水稀釋、攪拌均勻，移入250 mL具塞量筒內(nèi)，蓋上塞子，上下顛倒30次，放置1 min，其液面泡沫低于60 mL為合格。pH值測定：參照GB/T 1601-1993農(nóng)藥pH值測定方法測定。滲透性測定：采用點樣毛細管在水稻葉片上點樣，根據(jù)不同滲透劑制劑在水稻葉片上展布的面積來確定滲透劑的滲透展著性能。

1.2.3檸檬醛水劑對水稻稻瘟病菌生物活性測定

采用菌絲生長速率法和孢子萌發(fā)抑制法測定檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑的殺菌活性[10-11]。PDA和米糠平板的制作參照盧春等的方法[7]，采用DPS軟件進行數(shù)據(jù)分析，求出毒力回歸方程y=a+bx和相關系數(shù)，并計算出檸檬醛水劑對稻瘟病菌的EC50值。

2　結果與分析

2.1表面活性劑篩選

確定水為溶劑，加入31%的羥丙基-β-環(huán)糊精包合物(檸檬醛的含量≥2%)，表面活性劑的含量為10%，以此為基本配方，配制出含不同表面活性劑的制劑。先進行冷貯，對冷貯合格的樣品再進行熱貯，冷、熱貯合格者，即為所篩選的表面活性劑。不同表面活性劑所配制劑的冷熱貯實驗結果見表1。結果表明：有兩種表面活性劑適用于檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑的配制，即OP-15、NP-10，相比冷、熱貯的結果，OP-15表面活性劑最適用于檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑制備。

表1　不同表面活性劑制劑樣品冷熱貯實驗效果

2.2滲透劑篩選

增效滲透劑能增加農(nóng)藥制劑中的農(nóng)藥活性物質(zhì)在作用靶標上迅速展布、內(nèi)吸，具有提高藥效的作用。由表2可知，滲透劑T和JFC-2對水稻葉片都具有較好的展布、滲透效果，但滲透劑T的展布、滲透效果優(yōu)于JFC-2。滲透劑T用量在5%、7%時，檸檬醛制劑在葉片上的展布直徑差異不顯著，故滲透劑的用量為5%為宜。

表2　滲透劑篩選

2.3防腐劑篩選

以苯甲酸鈉、山梨酸鉀、水楊酸鈉作為防腐劑添加對象，在不同的添加量下，分別測定有效成分的分解率。結果表明：山梨酸鉀有很好的防腐效果，能夠有效降低檸檬醛的分解率，因此選用山梨酸鉀作為制劑的防腐劑，山梨酸鉀的添加量以0.5%為宜。

2.4檸檬醛水劑配方

根據(jù)以上配方篩選實驗結果，優(yōu)選31%檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑配方見表4。

表3　防腐劑篩選

表4　31%檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑配方

2.5檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑的理化性能

對檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑各項理化性能的測定。結果表明31%檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑各項理化性能指標均合格。實驗結果見表5。

表5　31%檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑各項技術指標的測定

2.631%檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑對水稻稻瘟病菌生物活性

2.6.131%檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑對稻瘟病菌菌絲生長的抑制作用

采用菌絲生長速率法測定了檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑對稻瘟病菌菌絲生長的抑制作用，其結果見表6。31%檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑對稻瘟病菌菌絲生長有較好的抑制效果，其EC50為21.37 μg/mL，較檸檬醛原藥和6%春雷霉素效果顯著。

表6　31%檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑對稻瘟病菌菌絲生長的抑制作用

2.6.231%檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑對稻瘟病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

采用孢子萌發(fā)抑制法測定了檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑對稻瘟病菌孢子萌發(fā)的抑制作用，其結果見表7。31%檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑對稻瘟病菌孢子萌發(fā)的抑制效果較6%春雷霉素可濕性粉劑效果略低，其EC50值為35.63 μg/mL，較檸檬醛原藥對稻瘟病菌孢子的生物活性略高，其主要原因在于檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑中的農(nóng)藥活性物質(zhì)被包裹在羥丙基-β-環(huán)糊精的內(nèi)腔，農(nóng)藥活性物質(zhì)會以一定的速率持續(xù)穩(wěn)定地向外釋放到達作用靶標，檸檬醛水劑具有一定的緩釋性，因此采用孢子萌發(fā)抑制法測定檸檬醛水劑生物活性的速效性較差。

表7　31%檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑對稻瘟病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

3　討論

31%檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑外觀為無色透明的均相液體，其pH值、稀釋穩(wěn)定性、冷貯、熱貯穩(wěn)定性等各項技術指標均符合農(nóng)藥水劑的要求。室內(nèi)生測實驗結果表明，2%檸檬醛水劑對水稻稻瘟病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)均有較好的抑制效果，其EC50值分別為21.37、35.63 μg/mL。而檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑對稻瘟病菌孢子的抑制效果低于對菌絲的抑制效果， 其主要原因在于檸檬醛是以一定的速率持續(xù)穩(wěn)定地向外釋放，其速效性較差。因此，采用HP-β-CD對檸檬醛的包合，即增加了檸檬醛的水溶性，又提高了檸檬醛制劑穩(wěn)定性和田間持效期。

檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑的制備工藝簡便可行、殺菌效果好、成本低、環(huán)保安全，在制備的過程中以水為溶劑，即節(jié)省了大量的有機溶劑，降低了成本，又減少了有機溶劑對操作者的刺激和對環(huán)境的污染。因此，31%檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑屬于水基化農(nóng)藥劑型的范疇，符合環(huán)保型農(nóng)藥制劑的要求。檸檬醛羥丙基-β-環(huán)糊精水劑的制備為檸檬醛的田間施用提供了一種可行性方法。

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Preparation of Citral HP-β-CD 31% AS and Its Biological Activity of Magnaporthe Grisea

GAOQiang1,2，LIMing2,3*,LIRong-yu2,3ZHENGLi1,2,HUXian-feng2

(1.ResearchandDevelopmentCenterforFineChemicals，GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China; 2.InstituteofCropProtection，GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China; 3.TheprovincialKeyLaboratoryforAgriculturalPestManagementinMountainousRegion，GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

To improve application effect of citral in the field,citral HP-β-CD 31% AS were prepared and its biological activity.In order to determine the optimal formula of citral HP-β-CD 31% AS and conducting different emulsifiers，penetrants，preservatives and other additives screening experiments，determination of biologically active of citral HP-β-CD 31% AS. The results showed that the optimum formulation are as follows:31% citral HP-β-CD inclusion complexes,10% OP-15,5% penetrant,0.5% potassium sorbate，distilled water were consisted in the optimum formulation.Its physical-chemical nature of preparation met the quality standard of aqueous solution. Citral HP-β-CD 31% AS have good inhibition for rice blast fungus mycelium growth and spore germination and its EC50values were 21.37、35.63 μg/mL.Its development for citral to provide a method of field use.

citral; aqueous solution(AS); surfactant;Magnaporthegrisea

2016-03-17；

2016-04-06

國家自然科學基金項目“檸檬酫對稻瘟病菌細胞壁靶位蛋白的影響及機制”(31460480)。

李明，男，教授，博士生導師，主要研究方向：植物源農(nóng)藥與應用技術；E-mail:lm21959@163.com 。

TQ450.6

A

1008-0457(2016)02-0029-05國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.02.006