孫 歡, 李東曉, 陳育如, 趙乙萱, 劉軍利, 衛(wèi) 民

?

高效利用內(nèi)醚糖微生物的篩選鑒定及預(yù)處理對菌株利用熱解液的影響

孫 歡1, 李東曉1, 陳育如1, 趙乙萱1, 劉軍利2, 衛(wèi) 民2

(1. 南京師范大學 生命科學學院, 江蘇省微生物與基因組學重點實驗室, 江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心, 江蘇省生物多樣性與生物技術(shù)重點實驗室, 江蘇 南京 210023; 2. 中國林業(yè)科學院南京林產(chǎn)化學工業(yè)研究所, 江蘇 南京 210042)

以纖維素熱解產(chǎn)物內(nèi)醚糖為碳源篩選到4株高效利用內(nèi)醚糖的微生物，經(jīng)ITS測序和菌落形態(tài)特征鑒定，4株菌分別為嗜松青霉()、桔青霉()、冠突散囊菌()和紅假單胞菌(sp)。對各菌株利用內(nèi)醚糖的研究結(jié)果表明，嗜松青霉和桔青霉5 d內(nèi)對2%內(nèi)醚糖的利用率為100%，冠突散囊菌7 d內(nèi)對2%內(nèi)醚糖的利用率為100%，紅假單胞菌在10 d對2%內(nèi)醚糖的利用率為52%。將4株菌作用于熱解液發(fā)現(xiàn)，紅假單胞菌能在未經(jīng)預(yù)處理的熱解液中生長，14 d后對熱解液中內(nèi)醚糖的利用率為69%，另外3株菌能在經(jīng)5%活性炭+Ca(OH)2預(yù)處理后的熱解液中生長。對預(yù)處理后熱解液成分的分析表明，預(yù)處理對熱解液成分有顯著影響，其中六甲基環(huán)三氧硅烷、1,2-環(huán)戊二酮、5-甲基糠醛、3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮和羥甲基呋喃酮的去除率達100%，內(nèi)醚糖的損失為27.1%。

內(nèi)醚糖；熱解液；嗜松青霉；桔青霉；紅假單胞菌

1 前 言

植物纖維素原料是地球上最豐富的可再生資源，其生成與降解構(gòu)成了生物圈中最大的物質(zhì)循環(huán)[1~3]。有效利用纖維素原料是解決目前人類面臨的資源、能源、環(huán)境等重大問題的途徑之一[4,5]。

纖維素原料熱解時生成的熱解液含內(nèi)醚糖(Levoglucosan，1,6-脫水--D-吡喃葡萄糖，簡稱LG)、芳烴衍生物、糠醛衍生物等[6,7]。隨著熱解工藝的發(fā)展，熱解液中內(nèi)醚糖的量大幅度提高[8~10]，利用熱解產(chǎn)物作為微生物發(fā)酵碳源的研究越來越為人們所重視[11~13]。

與葡萄糖等常規(guī)碳源相比，自然界中能利用內(nèi)醚糖的菌株少且存在利用率低的問題[14~16]。余志晟對89種菌株進行了同化內(nèi)醚糖的實驗，發(fā)現(xiàn)僅有7株微生物具有較弱的內(nèi)醚糖同化能力，從土壤中篩選的斯達油脂酵母對內(nèi)醚糖的利用率低(3 d，64%)[17]，因此篩選能高效利用內(nèi)醚糖的微生物就顯得尤為重要[15]。本工作對相關(guān)微生物進行了篩選及對內(nèi)醚糖利用效率進行了研究。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 菌株

真菌篩選自南京仙林大學城的土壤，紅假單孢菌XJ為本實驗室保藏菌株。

2.1.2 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：2%內(nèi)醚糖，1%蛋白胨，0.1%KH2PO4，0.04%MgSO4，2%瓊脂，pH5.0.

熱解液培養(yǎng)基：4%纖維素熱解液(內(nèi)醚糖含量約為1.8%)，1%蛋白胨，0.1%KH2PO4，0.04%MgSO4，pH5.0.

2.1.3 試劑

內(nèi)醚糖：河南高的醫(yī)藥科技有限公司(純度98%)。

纖維素熱解液：本課題組成員制備，具體是將秸稈、竹子、木材等農(nóng)業(yè)廢料烘干并粉碎，利用管式爐熱解反應(yīng)器(主要由管式爐熱解器、電加熱器、溫控儀、冷凝和真空系統(tǒng)組成)在高溫條件下進行熱解，收集冷凝得到的組分即為熱解液。

2.1.4 儀器與設(shè)備

GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備公司)；ES-315高壓蒸汽滅菌鍋(TOMY，Japan)；FA2004電子分析天平(上海良平儀器儀表公司)；高效液相色譜儀(Agilent 1100)；HD-930型組合式全溫搖床(江蘇太倉市博萊特實驗儀器廠)；LC-MS(Agilent Technologies 6460 Triple Quad LC/MS)；高速離心機Sigma 3k30(Sigma公司)；高效氣相色譜儀(Agilent 7890A)。

2.2 方法

2.2.1 內(nèi)醚糖同化菌株的篩選

取土壤1 g加入盛有99 mL無菌水的錐形瓶中，充分震蕩后放置將清液稀釋為10-2、10-3、10-4和10-5的稀釋度，分別涂布于篩選培養(yǎng)基上，經(jīng)30℃培養(yǎng)5 d后，挑取菌落用劃線分離純化。純化后的菌株接種于液體篩選培養(yǎng)基，30℃、180 r×min-1培養(yǎng)，定時取樣，經(jīng)0.45mm微孔濾膜過濾，分析其同化內(nèi)醚糖的能力。

2.2.2 內(nèi)醚糖同化菌株的鑒定

2.2.2.1 形態(tài)鑒定

將菌株接至不同碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)及生理生化等特征。

2.2.2.2 分子生物學鑒定

PCR擴增引物為ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTT TTGATATGC。PCR反應(yīng)體系(20 μL): 10×Ex Taq buffer 2.0 μL； MgCl2(25 mmol×L-1)1.6 μL；dNTP(2.5 mmol×L-1)1.6 μL；引物各1 μL；Template 0.5 μL；5U Ex Taq 0.2 μL；ddH2O12.1 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min30 s，共24個循環(huán)，72℃延伸10 min。所得測序結(jié)果用blast與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)進行比對分析，用MEGA 4.0軟件構(gòu)建進化樹。

2.2.3 熱解液的預(yù)處理

熱解液用5%活性炭+Ca(OH)2常溫預(yù)處理1 h后，過濾除去活性炭備用。

2.2.4 熱解液成分分析

將處理前后的熱解液用乙酸乙酯萃取3次(1:3體積比)，合并乙酸乙酯用無水硫酸鈉脫水后過濾進行氣相色譜(GC)分析。

2.2.5 HPLC及GC分析

HPLC：Aminex HPX-87H Lon Exclusion column分析柱，流動相為0.05 mmol×L-1的硫酸溶液，流速0.5 mL×min-1，柱溫35℃。

GC：Agilent DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25mm)分析柱，載氣為高純氮，升溫程序：初始溫度40℃維持2 min，3℃×min-1升至120℃，5℃×min-1升至250℃，維持20 min。流量1.6 mL×min-1，分流比10:1，檢測器溫度240℃。

2.2.6 內(nèi)醚糖利用率

配制11.52 mg×mL-1的內(nèi)醚糖溶液，梯度稀釋為5.76、2.88、1.44、0.72、0.36 mg×mL-1，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜，HPLC分析，得內(nèi)醚糖濃度()與峰面積()對應(yīng)的標準曲線。=379131.1+7.17(R2=0.99958)，內(nèi)醚糖利用率(%)=(原液中內(nèi)醚糖量-轉(zhuǎn)化液體中內(nèi)醚糖量)×100%/原液中內(nèi)醚糖量。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株內(nèi)醚糖同化能力

將篩選到的具有同化內(nèi)醚糖能力的3株菌分別為命名為ZS2、GT、FX。實驗室原保藏的紅假單胞菌XJ對內(nèi)醚糖的利用率為52%(10 d)，ZS2和FX對內(nèi)醚糖利用率為100%(4 d)。GT菌對內(nèi)醚糖的利用率為100%(7 d)，ZS2、GT、FX菌對內(nèi)醚糖的利用率見圖1所示。與文獻中斯達油脂酵母對內(nèi)醚糖的利用率相比[15]，本工作篩選到的ZS2和FX菌轉(zhuǎn)化效率更高。

3.2 菌株鑒定

3.2.1 ZS2菌株鑒定

菌液呈黃綠色, 在內(nèi)醚糖培養(yǎng)基平板上2 d可長出菌落，3 d后菌落中間生成黃綠色孢子，菌絲發(fā)達多分枝，有膈，孢子球形(圖2)。

經(jīng)分析，ZS2 的ITS全長為1092 bp，用Blast與Gene Bank中的數(shù)據(jù)構(gòu)建進化樹比對發(fā)現(xiàn)，該微生物與嗜松青霉()吻合，結(jié)合菌體形態(tài)、生理生化分析和分子生物學方法，鑒定該菌為嗜松青霉()。

菌株鑒定

在PDA培養(yǎng)基上的菌落呈灰綠色且有放射狀溝紋，菌絲無膈，有帚狀分生孢子頭，孢子呈灰綠色。孢子和菌絲的形態(tài)見圖3所示。

據(jù)分析，F(xiàn)X 的ITS全長為1040 bp，用Blast與Gene Bank中的數(shù)據(jù)構(gòu)建進化樹和比對分析，該菌與桔青霉()最為吻合，結(jié)合形態(tài)、生理生化和分子生物學方法，鑒定該菌為桔青霉()。

菌的鑒定

GT菌在固體PDA培養(yǎng)基上生長初期呈金黃色，生長后期呈褐色，菌絲發(fā)達，分生孢子頭呈放射狀，孢子和菌絲見圖4所示。

據(jù)分析，GT的ITS全長為1534 bp，利用Blast程序?qū)⑿蛄信cGeneBank數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對發(fā)現(xiàn)，與冠突散囊菌()的序列最為吻合，結(jié)合菌落與生理生化特征及分子生物學分析，鑒定該菌為冠突散囊菌()。

3.3 對處理熱解液的利用

將上述4株菌接入未經(jīng)處理的熱解液中，發(fā)現(xiàn)只有紅假單胞菌能生長。分析結(jié)果表明，經(jīng)14 d的培養(yǎng)后，紅假單孢菌對熱解液中內(nèi)醚糖(15.35 min)利用率為69%，自然界中能利用內(nèi)醚糖的微生物不多[17]，紅假單胞菌能利用未經(jīng)預(yù)處理熱解液中的內(nèi)醚糖的結(jié)果表明對該菌株進行綜合利用有著非常積極的意義。

3.4 對預(yù)處理熱解液的利用

對熱解液用5%活性炭和Ca(OH)2經(jīng)1 h的常溫吸附后，過濾配成含4%的培養(yǎng)液。分別接入4菌株培養(yǎng)，定時取樣分析對內(nèi)醚糖的利用率，結(jié)果見圖6所示。

由圖6可見，所用各菌可在預(yù)處理后的熱解液培養(yǎng)基中生長(4 d)。桔青霉、紅假單胞菌、嗜松青霉和冠突散囊菌對內(nèi)醚糖的利用率分別為100%，78%，72%和28%。

3.5 預(yù)處理對熱解液成分的影響

對預(yù)處理前后的熱解液進行氣相色譜分析，結(jié)果見圖7所示。

對熱解液成分的分析結(jié)果表明，其醛酮類物質(zhì)以糠醛(抑菌能力強)含量最高。由圖7和表1可見，熱解液經(jīng)處理后，六甲基環(huán)三氧硅烷、1,2-環(huán)戊二酮、5-甲基糠醛、3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮和羥甲基呋喃酮的脫除率達100%，糠醛脫除率77.1%，2-呋喃甲醛、2-乙酰呋喃、左旋葡糖酮烯等物質(zhì)的量也分別有不同程度的降低(77.1%、83.2%和77.3%)。

表1 預(yù)處理后熱解液中的成分變化

Table 1 Change of the components in pretreated pyrolysis liquid

Retentiontime / minCompoundsRemovalrate 4.91Hexamethylcyclotrisiloxane100% 5.542-Furancarboxaldehyde77.1% 8.112-Acetylfuran83.2% 8.751,2-Cyclopentanedione100% 10.315-methylfurfural100% 13.363-methyl-1,2-Cyclopentanedione100% 15.94Hydroxymethylfuraneol100% 17.42Levoglucosenone77.3% 22.541,4,3,6-dianhydro-α-glucopyranose78.8%

4 結(jié) 論

(1) 本工作篩選的嗜松青霉()、桔青霉()、冠突散囊菌()和紅假單胞菌(sp.)都能高效同化內(nèi)醚糖，其對內(nèi)醚糖和熱解液的利用是首次發(fā)現(xiàn)。

(2) 與文獻報道的微生物利用內(nèi)醚糖的效率相比，本工作篩選的菌株對內(nèi)醚糖的利用率很高，嗜松青霉、桔青霉在4 d對內(nèi)醚糖的利用率達100%，冠突散囊菌在7 d對內(nèi)醚糖的利用率也達100%。

(3) 紅假單胞菌可在未經(jīng)脫毒處理的熱解液中生長，在14 d對內(nèi)醚糖的利用率達69%。

(4) 對熱解液的預(yù)處理可使三株真菌也能利用熱解液中的內(nèi)醚糖，其中紅假單孢菌的利用效率大為提高(從14 d的69%提高至4 d的78%)。

(5) 對可利用內(nèi)醚糖和熱解液菌株的篩選對實現(xiàn)內(nèi)醚糖與熱解液的高效利用提供了更多可選擇的菌株與方法。

[1] ZHANG Hong-xun (張洪勛), DAI Jiang-hong (代江紅), WANG Xiao-yan (王曉燕),. A method of promotion the growth ofand production ethanol by levoglucosan (一種促進樹干畢赤酵母的生長和發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法): CN, 101 531 989 A [P]. 2009-04-22.

[2] XIE Qing-ruo (謝清若), TONG Zhang-fa (童張法), WEI Teng-you (韋藤幼),. Optimization of bamboo pyrolysis process to prepare bio-oil by response surface methodology (響應(yīng)曲面法優(yōu)化竹材熱裂解制備生物油的工藝研究) [J]. J Chem Eng of Chinese Univ (高?；瘜W工程學報), 2012, 26(3): 487-492.

[3] FAN Yong-sheng (樊永勝), CAI Yi-xi (蔡憶昔), LI Xiao-hua (李小華),. Bio-oil analysis and optimization of bio-oil yield from vacuum pyrolysis of rape straw using response surface methodology (響應(yīng)面法優(yōu)化油菜秸稈真空熱解液化工藝及生物油分析) [J]. J Chem Eng of Chinese Univ (高?；瘜W工程學報), 2015, 29(3): 628-633.

[4] Giannoni M, Martellini T, Del Bubba M,. The use of levoglucosan for tracing biomass burning in PM2.5samples in Tuscany(Italy) [J]. Environmental Pollution, 2012, 167: 7-15.

[5] CHANG Dong-dong (常冬冬), YU Zhi-sheng (余志晟), ZHANG Hong-xun (張洪勛). Progress on pyrolysis of cellulose and its conversion to ethanol (纖維素熱解液及其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化乙醇的研究進展) [J]. Chinese Agricultural Science Bulletin (中國農(nóng)學通報), 2012, 28(26): 183-189.

[6] REN Pu-xian (任普鮮), JIANG Jian-chun (蔣劍春), YANG Xiu-shan (楊秀山),Research progress on production of ethanol as fuel from fast pyrolysis products of lignocellulose (木質(zhì)纖維素快速熱解產(chǎn)物生產(chǎn)燃料乙醇研究進展) [J]. Biomass Chemical Engineering (生物質(zhì)化學工程), 2009, 43(3): 47-51.

[7] LU Qiang (陸強), ZHU Xi-feng (朱錫峰). Production of levoglucosenone from pyrolysis of cellulose catalyzed by solid superacids (利用固體超強酸催化熱解纖維素制備左旋葡萄糖酮) [J]. Journal of Fuel Chemistry and Technology (燃料化學學報), 2011, 39(6): 425-431.

[8] DSTAG Radlein, A Grinshpun, J Piskorz,. On the presence of anhydro-oligosaccharides in the sirups from the fast pyrolysis of cellulose [J]. Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, 1987, 12(1): 39-49.

[9] Scott D S, Piskorz J, Radlein D. Yield of chemicals from biomass-based fast pyrolysis oils [J]. Energy Biomass Wastes, 1993, 16: 797-809.

[10] Lede J, Panagopoulos J, Li H Z,. Fast pyrolysis of wood: direct measurement and study of ablation rate [J]. Fuel, 1985, 64(11): 1514-1520.

[11] Bridgwater A V, Boocock D G B. Developments in thermochemical biomass conversion [M]. London: Blackie Academic and Professional. 1996. 611-621.

[12] Bennett N M, Helle S S, Duff S J B. Extraction and hydrolysis of levoglucosan from pyrolysis oil [J]. Bioresource Technology, 2009, 100(23): 6059-6063.

[13] Mullen C A, Boateng A A, Goldberg N,. Bio-oil and bio-char production from corn cobs and stover by fast pyrolysis [J]. Biomass and Bioenergy, 2010, 34(1): 67-74.

[14] Nakagawa M, Sakai Y, Yasui T. Itaconic acid fermentation of levoglucosan [J]. Journal of Fermentation Technology, 1984, 62(2): 201-203.

[15] Prosen E M, Radlein D, Piskorz J,. Microbial utilization of levoglucosan in wood pyrolysate as a carbon and energy source [J]. Biotechnology Bioengineering, 1993, 42(4): 538-541.

[16] Zhuang X L, Zhang H X, Yang J Z,. Preparation of Levoglucosan by pyrolysis of cellulose and its citric acid fermentation [J]. Bioresource Technology, 2001, 79(1): 63-66.

[17] YU Zhi-sheng (余志晟), NING Bo-ying (寧洎英), ZHANG Ling (張玲),. Microbial investigation on assimilation and ethanol fermentation of levoglucosan from cellulosic pyrolysis products (纖維素熱解產(chǎn)物內(nèi)醚糖的微生物同化與乙醇發(fā)酵測試) [J]. Chinese Agricultural Science Bulletin(中國農(nóng)學通報, 2011, 27(6): 342-349.

[19] WU Meng-yao (吳夢瑤), HU Xiang (胡翔). Isolation and identification of a strain of 1-hexyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate- degrading bacterium (一株降解1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽微生物的篩選與鑒定) [J]. J Chem Eng of Chinese Univ (高校化學工程學報), 2014, 28(6): 431-437.

Isolation and Identification of Efficient Levoglucosan-Assimilating Microorganisms and Effects of Pretreatment on their Utilization of Pyrolysis Liquids

SUN Huan1, LI Dong-xiao1, CHEN Yu-ru1, ZHAO Yi-xuan1, LIU Jun-li2, WEI Min2

(1. College of Life Science, Jiangsu Key Lab for Biodiversity and Biotechnology, Nanjing Engineering Research Center for Industrialization of Microbial Resources, Jiangsu Key Lab for Microbes and Functional Genomics, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China;2. Institute of Chemical Industry of Forest Products, CAF, Nanjing 210042, China)

Four efficient levoglucosan-assimiliating microorganisms were screened using levoglucosan from cellulosis pyrolysis as carbon source, and they were identified as,,andbased on morphology and ITS sequence analysis. The results show that the 2%-levoglucosan utilization efficiency of,(4 d) and(7 d) are 100%, and that ofsp is 52% (10 d).sp can be cultured in untreated pyrolysis liquids with utilization efficiency of 69% (14 d), while,andcan be cultured in pretreated pyrolysis liquids (treated by 5% activated carbon+Ca(OH)2). The pretreated pyrolysis liquids were analyzed and the results show that pretreatment has obvious influence on the pyrolysis liquid. Hexamethylcyclotrisiloxane,1,2-Cyclopentanedione,5-methylfurfural, 3-methyl-1,2-Cyclopentanedione and hydroxymethylfuraneol are fully removed, and the loss rate of levoglucosan is 27.1%.

levoglucosan; pyrolysis liquid; Penicillium pinophilum; Penicillium citrinum; Rhodopseudomonas sp.

1003-9015(2016)01-0127-06

Q935

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2016.01.019

2014-04-13；

2014-09-30。

江蘇省高校自然科學研究重大項目(15KJA210002)；江蘇省“六大人才高峰”人才培養(yǎng)項目（NY-011-2015）。

孫歡(1987-)，女，山東文登人，南京師范大學碩士生。通訊聯(lián)系人：陳育如，E-mail：chenyuru@njnu.edu.cn