劉　靜，李月娟（甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730030）

一種減肥膠囊中總黃酮測定前處理條件的研究

劉靜，李月娟
（甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730030）

該試驗以蘆丁為對照品，采用分光光度法對一種減肥膠囊中總黃酮含量進行測定。通過對提取液濃度、超聲時間、超聲溫度、洗脫速度等前處理條件進行優(yōu)化，確定了最佳的樣品前處理條件：用體積分數(shù)為60%的乙醇提取，70℃條件下超聲40 min，甲醇洗脫速度為1滴/2～3 s。該試驗操作簡單，穩(wěn)定性、精密度及準確性良好。

減肥膠囊；總黃酮；檢測；前處理條件

黃酮類化合物也稱類黃酮，是廣泛存在于植物界的一大類多酚化合物，具有防癌抗癌、抗腫瘤、防心腦血管疾病以及抗氧化的作用［1］。黃酮類化合物在人體中不能直接合成，只能從食品中獲取，人們常從銀杏葉、葛根、蜂膠中提取黃酮［2］。隨著食品工業(yè)的發(fā)展和消費水平的不斷提高，黃酮類化合物在醫(yī)學(xué)、食品保健等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，對于黃酮類化合物的研究也成為熱點。目前，黃酮類化合物的定性定量檢測方法主要有紫外分光光度法、薄層層析法、絡(luò)合分光光度法、高效液相色譜法等，其中高效液相色譜法主要用于微量組分的測定分析［3］，紫外分光光度法則利用黃酮分子結(jié)構(gòu)中羥基和芳環(huán)形成較強的共軛體系，對紫外光有較強的特征吸收進行測定［4］。

黃酮類化合物的提取方法主要有水提法、醇提法、CO2超臨界流體提取法、酶解法、超聲波法等［5］。《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》中有關(guān)保健食品功效成分及衛(wèi)生指標(biāo)檢驗規(guī)范的檢驗方法之保健食品中總黃酮的測定作為現(xiàn)行的測定保健食品中總黃酮含量的通用方法，主要是利用乙醇處理，超聲提?。ǔ曁崛》梢员苊庖蚣訜岫瘘S酮類化合物結(jié)構(gòu)成分發(fā)生變化）［6］。該標(biāo)準中規(guī)定超聲時間為20 min，但在試驗中發(fā)現(xiàn)超聲時間和超聲溫度都對測定結(jié)果有較大影響；層析柱用久了容易被聚酰胺粉堵塞，洗脫速度變慢，同一條件下測定的吸光度值變化較大，但該技術(shù)規(guī)范中對洗脫速度沒有進行明確規(guī)定，此外，對于提取劑乙醇體積分數(shù)也沒有進行明確規(guī)定，通過查閱《中國藥典》［7］得知，在沒有標(biāo)識乙醇體積分數(shù)時，默認其體積分數(shù)為95%。不同待測物由于組成成分不同，在得到最大提取量時乙醇體積分數(shù)也不盡相同。于修燭等［8］利用響應(yīng)面優(yōu)化得出乙醇體積分數(shù)64.5%、超聲溫度65℃、超聲時間60 min條件下處理枳椇子中總黃酮結(jié)果最優(yōu)；崔瑋等［9］研究了超聲輔助提取對甘青虎耳草中總黃酮含量測定的影響，得出乙醇體積分數(shù)80%、超聲溫度50℃、超聲時間35 min條件下處理甘青虎耳草結(jié)果最優(yōu)；呂鳳嬌等［10］研究了黃芪中總黃酮乙醇提取工藝；朱攀攀等［11］研究了超聲處理條件對血橙皮渣中黃酮類物質(zhì)的影響；周蕾等［12］研究了不同提取溶劑對鑲鼎蔘膠囊中總黃酮含量的影響；徐玲花等［13］研究了女貞子總黃酮提取工藝；張吉祥等［14］利用正交試驗法優(yōu)化超聲提取棗核中總黃酮；劉建祥等［15］研究了保健食品中總黃酮的提取及含量測定。

本試驗針對一種組成成分比較復(fù)雜的減肥膠囊，采用紫外分光光度法進行減肥膠囊中總黃酮含量的測定，分別研究了乙醇體積分數(shù)、超聲時間、超聲溫度、洗脫速度等前處理條件對測定結(jié)果的影響，找到了最佳的前處理條件，本試驗操作簡便，對復(fù)雜成分保健食品中總黃酮含量的測定有一定的參考價值。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

減肥膠囊：市售；蘆丁標(biāo)準品（純度99.5%）：北京百靈威科技有限公司；聚酰胺粉：上海中秦化學(xué)試劑有限公司；乙醇（分析純）：天津利密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇（分析純）、苯（分析純）：天津市百世化工有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

Evolution 60型紫外分光光度計：美國賽默飛世爾科技有限公司；AE163型分析天平：梅特勒-托利多集團有限公司；DHG-9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；Elmasonic S150型超聲波提取儀：德國Elma（艾爾瑪）公司；層析柱（10 mm×300 mm）：廣州祿源化玻儀器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1標(biāo)準曲線的繪制

黃酮類化合物具有特定的紫外吸收帶，其結(jié)構(gòu)中由肉桂酰環(huán)產(chǎn)生的Ⅰ帶在波長300～400 nm處，由苯甲酰環(huán)產(chǎn)生的Ⅱ帶在波長240～285 nm處，不同的黃酮在這兩個吸收帶的吸收強度不同。含黃酮類化合物的試樣經(jīng)一定的提取純化后，可直接于最大吸收波長處測定其吸光度值，不需要加入其它顯色劑進行顯色。本實驗以蘆丁為對照品，選擇其在Ⅰ帶的最大吸收波長360 nm作為測量波長，并以此為對照測定樣品總黃酮含量。

準確稱取蘆丁標(biāo)準樣品5.0 mg，加少量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容，配制成50 μg/mL蘆丁標(biāo)準儲備液。

分別吸取蘆丁標(biāo)準儲備液0、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL置于10 mL比色管中，用甲醇定容至刻度，以甲醇為空白參比，在波長360 nm條件下測其吸光度值，繪制蘆丁標(biāo)準曲線。

1.3.2樣品測定

稱取一定量的試樣，置于25 mL容量瓶中，加入體積分數(shù)為95%的乙醇定容，搖勻后，超聲（功率150 W）提取20 min，靜置，吸取上清液1.0 mL于蒸發(fā)皿中，加1.0 g聚酰胺粉吸附，于水浴上揮干乙醇，轉(zhuǎn)入層析柱，先用20 mL苯液洗脫，棄去苯液，然后用甲醇洗脫，洗脫液定容至25 mL，以甲醇為空白參比，在波長360 nm處測定其吸光度值。樣品中總黃酮含量按以下公式進行計算：

式中：X為樣品中總黃酮含量，mg/100 g；A為試樣測定液中總黃酮含量，μg；M為試樣質(zhì)量，g；V1為測定用試樣體積，mL；V2為試樣定容體積，mL。

2　結(jié)果與分析

2.1蘆丁標(biāo)準曲線的繪制

以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準曲線，結(jié)果見圖1。

圖1　 蘆丁標(biāo)準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

由圖1可知，標(biāo)準曲線回歸方程y=0.003 1x-1.904 76×10-4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 85，表明二者線性關(guān)系良好。

2.2乙醇體積分數(shù)對總黃酮測定的影響

本試驗分別用體積分數(shù)為40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%乙醇溶解待測試樣，利用方法1.3.2處理樣品后進行總黃酮含量的測定，結(jié)果見圖2。

圖2　乙醇體積分數(shù)對總黃酮測定的影響

由圖2可知，隨著乙醇體積分數(shù)的不斷增加，吸光度值也隨之增大，用體積分數(shù)60%乙醇處理樣品測得的吸光度值最大，隨后吸光度值出現(xiàn)下降，當(dāng)乙醇體積分數(shù)＞80%時，樣品吸光度值變化趨于平緩。因此，乙醇體積分數(shù)60%為宜。

2.3超聲時間對總黃酮測定的影響

用體積分數(shù)60%乙醇溶解樣品，分別超聲（功率150 W）處理10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，然后進行總黃酮含量的測定，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，隨著超聲時間的增加，吸光度值不斷增大，40 min時吸光度值達到最大，隨后吸光度值出現(xiàn)下降，表明增加超聲時間，有利于樣品中黃酮類物質(zhì)的溶出，但超聲時間＞40 min后，如果繼續(xù)增加，可能會破壞樣品中黃酮類化合物，導(dǎo)致其分解，吸光度值隨之下降。因此，超聲時間40 min為宜。

圖3　超聲時間對總黃酮測定的影響

2.4超聲溫度對總黃酮測定的影響

用體積分數(shù)60%乙醇溶解樣品、超聲處理40 min，超聲溫度分別控制在室溫（20℃）、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，然后測定其吸光度值，結(jié)果見圖4。

圖4　超聲溫度對總黃酮測定的影響

由圖4可知，隨著超聲溫度的上升，在70℃時吸光度值達到最大，隨后出現(xiàn)下降，原因可能是在加熱過程中分子運動加速，使得樣品中總黃酮較好的溶解，吸光度值出現(xiàn)上升，當(dāng)溫度＞70℃時，吸光度值出現(xiàn)下降，可能是由于溫度過高使樣品中部分黃酮類物質(zhì)發(fā)生了分解。因此，超聲溫度70℃為宜。

2.5洗脫速度對總黃酮測定的影響

樣品經(jīng)方法1.3.2處理后，在用甲醇洗脫時將洗脫速度分別設(shè)定為1滴/s、1滴/2 s、1滴/4 s、1滴/6 s，然后測定試樣中總黃酮含量，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，當(dāng)洗脫速度為1滴/s時，洗脫較快，測得的吸光度值也較小；洗脫速度為1滴/2 s時，洗脫速度變慢，測得的吸光度值有所增大；當(dāng)洗脫速度達到1滴/4 s和1滴/6 s時，吸光度值逐漸上升，但影響不明顯。經(jīng)過反復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)，洗脫速度太快，洗脫不完全，測得的吸光度值偏??；洗脫速度太慢，吸光度值較大，但會影響試驗效率。因此，本試驗中保持洗脫速度為1滴/2～3 s，可以取得穩(wěn)定的測定結(jié)果，并且人為容易控制。

圖5　洗脫速度對總黃酮測定的影響

2.6精密度試驗

取待測試樣，用優(yōu)化好的前處理條件進行處理，然后測定其吸光度值，計算總黃酮含量，平行測定6次，計算其結(jié)果相對標(biāo)準偏差（relative standard deviation，RSD），分析該方法的精密度，結(jié)果見表1。

表1　精密度試驗結(jié)果Table 1 Results of precision tests

精密度的高低取決于隨機誤差的大小，RSD值越小，則精密度越高。由表1可知，本試驗檢測結(jié)果的RSD為1.3%，表明該方法的精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗

表2　穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 2 Results of stability tests

取同一批號樣品，按照方法1.3.2制備溶液，分別在5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min內(nèi)測定吸光度值，計算相對標(biāo)準偏差（RSD），結(jié)果見表2。

穩(wěn)定性試驗是為了考察樣品隨著時間的變化含量變化的大小。由表2可知，本試驗結(jié)果的RSD為1.6%，表明處理后的樣品在30 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8加標(biāo)回收率試驗

準確稱取2份相同的待測試樣，其中1份加入蘆丁對照品分別為0.4 μg和0.8 μg，兩份試樣同時按相同的分析步驟進行處理，同時測定兩份試樣中總黃酮含量，得到相應(yīng)的加標(biāo)回收率，結(jié)果見表3。

表3　樣品加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 3 Results of adding standard recovery rate

由表3可知，總黃酮的回收率為91.2%～106.2%，在90%～110%范圍內(nèi)，表明該方法準確度高。

3　結(jié)論

本試驗對一種減肥膠囊中總黃酮含量進行測定，對測定的前處理條件進行優(yōu)化，得到了最佳的樣品前處理條件，結(jié)果表明，加標(biāo)回收率為91.2%～106.2%，精密度及穩(wěn)定性試驗結(jié)果RSD分別為1.3%、1.6%，處理后的樣品在30 min內(nèi)基本穩(wěn)定，表明該方法具有較好的穩(wěn)定性、準確性和精密度。與其他方法相比，本方法能直接測定總黃酮含量，不需要加入其他顯色劑進行顯色，從而避免了相關(guān)的干擾，而且實驗操作簡單、快速、準確。

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Pretreatment conditions of total flavonoids in a slimming capsule

LIU Jing，LI Yuejuan
（Gansu Institute of Food Inspection，Lanzhou 730030，China）

Using rutin as reference substances，total flavonoids content in a slimming capsule was determined by spectrophotometric method.The optimum sample pretreatment conditions were determined by optimizing extract concentration，ultrasonic time，temperature，elution speed.The results were as follows∶ethanol concentration 60%，ultrasound time 40 min at 70℃，elution speed 2-3 s per drop by using methanol as eluent.The operation was simple，and the stability，precision and accuracy of the methods were satisfactory.

slimming capsule；total flavonoids；determination；pretreatment condition

O657.3

0254-5071（2016）02-0135-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.031

2015-12-07

蘭州市科技計劃項目（2009-1-142）

劉靜（1984-），女，工程師，碩士，研究方向為食品科學(xué)。