曾碧濤，王天霞，楊鴻均（.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院 五糧液技術(shù)學(xué)院，四川 宜賓 644003；.西南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境保護工程學(xué)院，四川 成都 6004）

微波輔助提取一支箭總黃酮的工藝研究

曾碧濤1，王天霞1，楊鴻均2
（1.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院 五糧液技術(shù)學(xué)院，四川 宜賓 644003；2.西南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境保護工程學(xué)院，四川 成都 610041）

以一支箭為原料，對一支箭總黃酮的微波輔助提取工藝進行了研究。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗優(yōu)化工藝條件。試驗結(jié)果表明，最佳條件為微波時間6 min，微波功率400 W，料液比1∶25（g∶mL），乙醇體積分數(shù)70%。在此條件下，一支箭中總黃酮的提取率達到7.25%。

一支箭；黃酮；提取；微波

一支箭（Ophioglossum vulgatum）是珍稀古老的蕨類植物，屬于瓶爾小草科，瓶爾小草屬。該植物有多方面的藥用價值，能清熱、解毒、消炎、退熱，治療肺炎、肝炎、毒蛇咬傷等，是民間一味重要的中藥和保健藥［1-3］?？v觀文獻報道，目前，只有少數(shù)學(xué)者對一支箭的化學(xué)成分進行了初步研究［4-5］，其功效與黃酮類化合物有著密切關(guān)系，但關(guān)于一支箭總黃酮提取工藝的研究少有報道。

黃酮類化合物在自然界植物中存在廣泛，包括黃酮類、查爾酮、黃酮醇、黃烷酮、異黃酮等，具有抗氧化、調(diào)血脂、降血壓、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理活性，有抗癌、改善心腦血管循環(huán)、利尿等多種醫(yī)療和保健作用［6-7］。植物中總黃酮的提取主要用常規(guī)加熱方法，這些方法不同程度存在提取時間長、提取率低等缺點［8］。鑒于微波輔助提取法具有快速高效、高選擇性、溶劑用量少、提取得率高等優(yōu)點［9］，本試驗采用微波輔助提取法對一支箭總黃酮提取工藝進行了探索和優(yōu)化，并與常規(guī)加熱提取法做比較，探討一支箭總黃酮提取的最優(yōu)工藝，為一支箭資源的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)和參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

一支箭樣品：市售；無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、石油醚、硝酸鋁、鹽酸（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；蘆丁對照品：中國醫(yī)藥集團上海化學(xué)試劑公司。

1.2儀器與設(shè)備

TU-1901紫外可見光譜儀：北京普析通用儀器有限責任公司；EM-202MS1微波反應(yīng)器：三洋有限公司，700W家用微波爐改造后外接回流裝置；RE-5286A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FA2004型電子天平：上海精科科學(xué)儀器有限公司；DWF-100植物粉碎機：河北省黃驊市科研器械廠。

1.3方法

1.3.1工藝流程

一支箭根葉（根葉一同入藥）→清洗去雜→干燥箱中60℃干燥至質(zhì)量恒定→粉碎→過60目篩→一定料液比分散到乙醇溶液中封口預(yù)浸60 min［10］→乙醇微波輔助提取→抽濾→石油醚除雜→定容待測

1.3.2對照品溶液的制備

準確稱取干燥恒質(zhì)量的蘆丁標準品39.2 mg，用體積分數(shù)60%乙醇溶解，定容至100 mL，搖勻，配成質(zhì)量濃度為0.392 0 mg/mL的蘆丁標準溶液，備用。

1.3.3樣品溶液的制備

準確稱取一支箭粉末2.00 g于150 mL圓底燒瓶中，按一定料液比加入一定體積分數(shù)的乙醇溶液封口預(yù)浸60min，安裝回流裝置，設(shè)定好時間和功率后進行提取。提取液稍冷后抽濾，經(jīng)石油醚萃取除雜后轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)60%乙醇溶液定容備用。

1.3.4測定波長的選擇

精密量取“1.3.2”項下蘆丁對照品溶液4.00 mL于25 mL容量瓶中，加入1.0 mL 5%NaNO2，搖勻，放置5 min，加入1.0 mL 10%Al（NO3）3，搖勻，放置5 min，加入10mL 4% NaOH，搖勻，再用體積分數(shù)60%乙醇定容，搖勻，放置15min，在波長400～750 nm處掃描，結(jié)果對照品溶液λmax=508 nm，故選擇508 nm為測定波長。

1.3.5標準曲線的繪制

精密量取“1.3.2”項下蘆丁對照品溶液0、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL分別置于25 mL容量瓶中，依次加入5 mL體積分數(shù)60%乙醇，1.0 mL 5%NaNO2，搖勻，放置5 min，加入1.0 mL 10%Al（NO3）3，搖勻，放置5 min，加入10 mL4%NaOH，搖勻，再用體積分數(shù)60%乙醇定容，搖勻，放置15 min，在波長508 nm處測定吸光度值。以吸光度值（y）為縱坐標，蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，繪制蘆丁標準曲線。

1.3.6樣品總黃酮含量測定

移取“1.3.3”項下樣品溶液1 mL于25 mL容量瓶中，按“1.3.5”項方法測定樣品的吸光度值，從標準曲線中查出對應(yīng)的總黃酮質(zhì)量濃度，由此計算出總黃酮得率，計算公式如下：

1.3.7單因素試驗

準確稱取一支箭粉末2.00 g，置于150 mL圓底燒瓶中，按一定料液比加入乙醇溶液封口預(yù)浸60 min，在不同條件下提取，考察不同微波時間、微波功率、乙醇體積分數(shù)、料液比對一支箭中總黃酮提取率的影響。

1.3.8正交試驗

通過單因素試驗對一支箭總黃酮的提取條件進行研究，發(fā)現(xiàn)各條件對一支箭總黃酮的提取率均有一定的影響，選擇微波時間、微波功率、乙醇體積分數(shù)、料液比4個因素采用L9（34）正交試驗優(yōu)化一支箭總黃酮提取工藝條件。

表1　總黃酮提取工藝條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimization of total flavonoid extraction conditions

2　結(jié)果與分析

2.1蘆丁標準曲線

以蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標、波長508 nm處的吸光度值（y）為縱坐標繪制蘆丁標準曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可知，所得線性回歸方程為y=13.196x-0.014 3，相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 4。表明在一定范圍內(nèi)，吸光度值與蘆丁質(zhì)量濃度之間的線性關(guān)系良好。

圖1　蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2單因素試驗結(jié)果分析

2.2.1微波功率對總黃酮提取率的影響

準確稱取一支箭粉末2.00 g于圓底燒瓶中，按料液比1∶20（g∶mL）的比例加入體積分數(shù)70%乙醇溶液40 mL封口預(yù)浸60 min，在微波功率分別為100 W、200 W、300 W、400 W、500 W條件下提取6 min，測定吸光度值，計算一支箭總黃酮提取率，微波功率對一支箭總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖2。

圖2　微波功率對總黃酮提取率的影響

由圖2可知，微波功率＜300 W時，隨著微波功率增加，總黃酮提取率逐漸升高；當微波功率為300 W時，總黃酮提取率最高；當微波功率＞300 W時，總黃酮提取率隨著微波功率繼續(xù)增加而有所降低?？赡苁怯捎谖⒉üβ试龃?，分子運動速率加快，物質(zhì)滲透、擴散和溶解速度加快，使總黃酮溶出增加；當微波功率過高，使總黃酮發(fā)生降解或使部分有效成分發(fā)生變性引起總黃酮損失［11-12］。因此，微波功率選擇300 W為宜。

2.2.2微波時間對總黃酮提取率的影響

準確稱取一支箭粉末2.00 g于圓底燒瓶中，按料液比1∶20（g∶mL）的比例加入體積分數(shù)70%乙醇溶液40 mL封口預(yù)浸60 min，在微波功率為300 W條件下設(shè)定微波時間分別為2min、4 min、6 min、8 min、10 min，測定吸光度值，計算一支箭總黃酮提取率，微波輻射時間對一支箭總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖3。

圖3　微波時間對總黃酮提取率的影響

由圖3可知，微波時間在6 min以內(nèi)時，隨著微波時間的增加，提取率也隨之增加；在6 min時提取率達到最高值；微波時間繼續(xù)增加，總黃酮提取率降低明顯。這可能是長時間的微波輻射會使提取物中部分黃酮的結(jié)構(gòu)受破壞而使得提取率降低［13］。因此，微波時間以6 min為宜。

2.2.3乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響

準確稱取一支箭粉末2.00 g于圓底燒瓶中，按料液比1∶20（g∶mL）的比例加入體積分數(shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液40 mL封口預(yù)浸60 min，微波功率為300 W，微波時間為6 min，測定吸光度值，計算一支箭總黃酮提取率，乙醇體積分數(shù)對一支箭總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖4。

圖4　乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響

由圖4可以知，當乙醇體積分數(shù)為50%～70%時，隨著乙醇體積分數(shù)增加，總黃酮提取率也隨之增大。但當體積分數(shù)超過70%時，總黃酮提取率開始下降?？赡苁情_始時乙醇體積分數(shù)增大，黃酮類化合物被不斷地提取出來，而當體積分數(shù)過高時，乙醇使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，黃酮不容易析出［14］；也可能是原料中的黃酮在不同體積分數(shù)乙醇中有不同浸出特性有關(guān)［15］。因此，選擇乙醇體積分數(shù)70%為宜。

2.2.4料液比對黃酮提取率的影響

準確稱取一支箭粉末2.00 g于圓底燒瓶中，按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL）分別加入體積分數(shù)為70%乙醇溶液封口預(yù)浸60 min，微波功率為300 W，微波時間為6 min，測定吸光度值，計算一支箭總黃酮提取率，料液比對一支箭總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖5。

圖5　料液比對總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

由圖5可知，隨料液比從1∶10（g∶mL）增加為1∶25（g∶mL），總黃酮提取率明顯增加；料液比超過1∶25（g∶mL）后提取率增加緩慢。這可能是在一定范圍內(nèi)溶劑用量增加時，黃酮類化合物的浸出量增大，提取率增加［16］。但當溶劑用量增加到一定程度后，一支箭總黃酮幾乎溶出完全，此時增加溶劑用量不能進一步提高總黃酮提取率［17］。另外，溶劑用量增加會增大后續(xù)處理工序的投入，同時也會增加對其他雜質(zhì)的提取。因此，選擇料液比1∶25（g∶mL）為宜。

2.3一支箭總黃酮提取條件優(yōu)化正交試驗

鑒于微波輔助提取一支箭中總黃酮受微波時間、微波功率、乙醇體積分數(shù)、料液比4個因素均有一定影響，為此采用L9（34）正交表設(shè)計正交試驗，確定最佳提取條件，試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

由表2可知，影響總黃酮提取率的因素的主次順序為微波時間＞乙醇體積分數(shù)＞微波功率＞料液比；最佳水平組合為A2B3C2D2，即乙醇體積分數(shù)為70%，料液比為1∶25（g∶mL），微波時間為6min，微波功率為400W。由于A2B3C2D2不在所設(shè)計的正交表中，故進行驗證試驗。結(jié)果表明，在最佳提取條件下，得到的總黃酮提取率為7.25%。

表2　總黃酮提取條件優(yōu)化正交試驗設(shè)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for total flavonoids extraction conditions optimization

表3　正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3可知，微波時間（A）對一支箭中總黃酮提取率有顯著影響（P＜0.05），而微波提取功率（B）、乙醇體積分數(shù)（C）、料液比（D）對結(jié)果無顯著影響（P＞0.05）。

2.4與傳統(tǒng)醇提法比較

稱取一支箭粉末2.00 g，于圓底燒瓶中加入體積分數(shù)70%乙醇50 mL封口預(yù)浸60 min，安裝回流裝置，于80℃回流提取3h，提取液稍冷后抽濾，經(jīng)石油醚萃取除雜后轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)60%乙醇溶液定容為樣品溶液。移取樣品溶液1 mL于25 mL容量瓶中，按“1.3.5”項方法測定樣品的吸光度值，從工作曲線中查出總黃酮質(zhì)量濃度，計算出總黃酮提取率為4.36%?？梢娛褂梦⒉ㄝo助提取法與常規(guī)加熱醇提法相比用時少，總黃酮損失少，提取效率高。

3　結(jié)論

微波輔助提取法提取一支箭中總黃酮，簡便可靠，提取效率高。正交試驗結(jié)果表明，微波時間、微波功率、乙醇體積分數(shù)、料液比4個因素中，微波時間對一支箭總黃酮的提取率有顯著影響（P＜0.05），料液比、乙醇體積分數(shù)、微波功率對總黃酮的提取無顯著影響。在乙醇體積分數(shù)為70%，料液比為1∶25（g∶mL），微波時間為6 min，微波功率為400W條件下一支箭中總黃酮的提取率為7.25%，明顯高于文獻報道的大多數(shù)其他藥用蕨類植物的提取率［18］。

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Microwave assisted extraction provess of flavonoids from Ophioglossum vulgatum

ZENG Bitao1，WANG Tianxia1，YANG Hongjun2
（1.School of Wuliangye Technology，Yibin Vocational and Technical College，Yibin 644003，China；2.College of Chemistry and Environmental Protection Engineering，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China）

UsingOphioglossum vulgatumas raw material，the extraction of flavonoid fromO.vulgatumwas studied by microwave-assisted technology. On the basis of single factor experiment，the optimal process conditions were obtained by orthogonal experiments.The results showed that the optimal conditions were extraction time 6 min，microwave power 400 W，solid to liquid ratio 1∶25（g∶ml），alcohol concentration 70%.Under the conditions，the maximum extraction efficiency of total flavonoids was 7.25%.

Ophioglossum vulgatum；flavonoids；extraction；microwave

R284.2

0254-5071（2016）02-0123-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.028

2015-11-11

四川省教育廳科技基金資助項目（No.13ZB0383）；宜賓市科技局基金重點資助項目（No.2014ZSF004）

曾碧濤（1982-），男，講師，碩士，主要從事天然有機化學(xué)和有機合成的研究工作。