于上富，徐　敏，丁秀云，王娜娜，霍貴成（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

一株乳酸菌吸附Pb2+的條件優(yōu)化

于上富，徐敏，丁秀云，王娜娜，霍貴成*
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

該研究以具有良好去除鉛離子能力的德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）KLDS1.0207為研究對(duì)象，以鉛離子去除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法對(duì)影響鉛離子去除率的主要幾個(gè)因素進(jìn)行篩選，確定主要影響因素為pH值、菌種添加量、初始鉛離子質(zhì)量濃度，并采用響應(yīng)面對(duì)3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：當(dāng)pH值為6、菌種添加量4.2 g/L、初始鉛離子質(zhì)量濃度9.6 mg/L時(shí)，鉛離子去除率最高為95.17%。同時(shí)驗(yàn)證了該模型擬合良好，理論值與實(shí)際值基本符合。

德氏乳桿菌KLDS1.0207；鉛離子；生物吸附；響應(yīng)面法

重金屬是指密度＞4 g/cm3的元素，主要包括Cd、Cr、Hg、Pb、Cu、Zn、Ag等。重金屬污染對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重的影響，過去的50年中，全球大約有2.2萬t的鉻、9.39×105t的銅，7.83×105t的鉛以及1.35×106t的鋅排放環(huán)境中，其中的大部分進(jìn)入土壤中，造成了嚴(yán)重的破壞［1］。許多工廠、煤礦、電池制造廠、金屬冶煉廠、發(fā)動(dòng)機(jī)制造廠等，產(chǎn)生的廢水中含有不同形式的鉛。據(jù)資料報(bào)道，截至2010年，中國燃煤鉛排放量突破14 000 t，是汽車尾氣鉛排放量的35倍［2］。這些重金屬的污染可以通過食物鏈進(jìn)入人體，造成損害。鉛對(duì)人體的危害表現(xiàn)在腎臟、肝臟、大腦、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)上，攝入過多，會(huì)造成免疫能力下降、關(guān)節(jié)肌肉酸痛、貧血等現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)甚至能引起不孕不育、流產(chǎn)、死產(chǎn)、新生兒死亡等［3］。

2005年，河南省修武縣226名兒童鉛中毒。2009年至今，我國發(fā)生特大重金屬污染事件已達(dá)30多起。2009年重金屬污染事件致使4 035人血鉛超標(biāo)、182人鉛超標(biāo)，引發(fā)32起群體性事件。美國環(huán)境保護(hù)組織限定飲用水中鉛含量＜0.015 mg/L，污水中鉛含量＜0.1 mg/L。我國食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB 7100—2003《餅干衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定：糕點(diǎn)、面包、餅干中鉛殘留量≤0.5 mg/kg。

生物吸附法是一種新型的污水處理方法，在低濃度污染治理上有較好的應(yīng)用空間［4］，且有許多優(yōu)點(diǎn)，如投資少、效率高等；在治療上，與傳統(tǒng)的使用螯合劑（如依地酸鈣鈉（CaNa2EDTA）、二巰基丁二酸（DMSA）等）相比，雖能排除重金屬，但是副作用也比較明顯，導(dǎo)致腎毒性、鈣鋅等重要元素的流失以及嘔吐腹瀉等癥狀。而使用微生物去除重金屬具有安全、副作用小等優(yōu)點(diǎn)。乳酸菌在食品中被廣泛應(yīng)用，研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌能從水溶液中吸附重金屬離子［5］。HALTTUNEN T等［6］發(fā)現(xiàn)多種乳酸菌混合去除重金屬更有效。同時(shí)，也有證據(jù)表明乳酸菌有抗氧化特性［7-9］。ZHAI Q等［10］從33株乳酸菌篩選高抗鉛菌株，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CCFM8610有最高的結(jié)合能力和耐受性。黃志鈞等［11］從土壤中分離純化得到對(duì)重金屬銅離子有良好抗性的克雷伯氏菌，最大吸附量為117.6mg/g干質(zhì)量菌體。研究者發(fā)現(xiàn)，高加索鏈霉菌（Streptomyces ciscaucasicus）對(duì)鋅離子吸附達(dá)42.75 mg/g［12］。工業(yè)上的相關(guān)去除金屬的方式還沒有得以應(yīng)用［13］，大概是由于與實(shí)際不符或者沒有更深的模型等原因。

本研究從實(shí)驗(yàn)室乳酸菌中篩選出具有較高抗鉛性能的菌株德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）KLDS1.0207，對(duì)其在鉛離子吸附過程中的影響因素進(jìn)行選擇優(yōu)化，旨在選取最佳的鉛離子吸附條件，為進(jìn)一步深入研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）KLDS1.0207由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2化學(xué)試劑

酵母粉：英國OXOID公司；蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉：奧博星生物技術(shù)公司；硝酸鉛：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鉛標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：德國默克集團(tuán)有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，吐溫80 1 g，初始pH值為7.0，充分溶解后定容至1L。置于115℃、20min條件下滅菌。

1.2儀器與設(shè)備

CJ-2D超凈工作臺(tái)：天津泰斯特儀器有限公司；SPX-150B生化培養(yǎng)箱：上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備；Delta320pH計(jì)：瑞士梅特勒-托利多有限公司；900H原子吸收光譜儀：美國PERKINELMER公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī)：上海市離心機(jī)械研究所；HVE-50滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司。

1.3方法

1.3.1菌體制備

在發(fā)酵時(shí)間18h時(shí)，取50mL二代發(fā)酵液，置于10000×g離心10 min，倒掉上清液，再用滅菌的超純水沖洗菌體，并在同樣條件下離心，直到離心的上清液澄清，即為菌體液。

1.3.2不同質(zhì)量濃度的鉛離子溶液的制備

用分析天平準(zhǔn)確稱取不同質(zhì)量的硝酸鉛，將其溶于1L的超純水中，制成鉛離子質(zhì)量濃度分別為10mg/L、20mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L、70 mg/L、80 mg/L、90 mg/L、100 mg/L的溶液。

1.3.3鉛標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別取一定體積的1000mg/L的鉛標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用體積分?jǐn)?shù)20%的硝酸按比例稀釋成質(zhì)量濃度為2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L的鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液。以鉛離子質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)繪制鉛標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到鉛標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=0.018 90X+0.011 97，相關(guān)系數(shù)R2為0.9993。以鉛標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中鉛含量。鉛離子吸附量及鉛離子去除率的計(jì)算公式如下：

式中：q為鉛離子吸附量，mg/g；RE為鉛離子去除率，%；Ci為最初的鉛離子質(zhì)量濃度，mg/L；Ce為平衡時(shí)的溶液中的鉛離子質(zhì)量濃度，mg/L；V為鉛離子溶液的體積，L；m為菌體的量，g。

1.3.4單因素試驗(yàn)

將1.3.1制備好的菌體，取一定量加入到5 mL的pH值分別為（2、3、4、5、6）、鉛離子質(zhì)量濃度分別為（10mg/L、20mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L）溶液中，使其最終的菌種添加量分別達(dá)到（1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L、6 g/L、7g/L），然后置于37℃條件下在搖床轉(zhuǎn)速分別為（80 r/min、100 r/min、120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min、240 r/min、260 r/min）分別培養(yǎng)（1 h、3 h、5 h、7 h、9 h、11 h、13 h、15 h、17 h、19 h、21 h、24 h）。培養(yǎng)結(jié)束后，將其懸浮液置于8000×g條件下離心20min，取上清進(jìn)行火焰原子吸收測(cè)定鉛含量，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)組，考察pH值、菌種添加量、鉛離子質(zhì)量濃度及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)鉛離去除率的影響。

1.3.5 Plackett-Burman試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇pH（A）、菌種添加量（B）、金屬離子質(zhì)量濃度（C）、培育時(shí)間（D）及攪拌速度（E）進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)［12，14-15］，以鉛離子去除率（Y）為響應(yīng)值，篩選出對(duì)鉛離子去除率影響較顯著因素。Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1　Plackett-Burman試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

1.3.6最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)及其分析結(jié)果設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)，即對(duì)顯著因素進(jìn)行濃度梯度設(shè)計(jì)。在優(yōu)化過程中，可以根據(jù)前期試驗(yàn)擬合出的方程來確定各變量的最速上升路徑和變化步長，若系數(shù)為正，則該因素水平為遞增，反之遞減；以系數(shù)最大的變量為基準(zhǔn)確定基本步長，以其他變量與基準(zhǔn)變量系數(shù)的比值來確定其他變量的步長，確定了上升或下降方向及變化步長后便可以選取中心點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.3.7響應(yīng)面法分析

根據(jù)以上結(jié)果選取3個(gè)主要的影響因素，利用Design-Expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，擬合對(duì)應(yīng)的模型，得到二次多項(xiàng)式，并最終確定最佳的鉛離子去除率的條件。中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）因素與水平見表2。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1不同pH值對(duì)鉛離子去除率的影響

圖1　不同pH值對(duì)Pb2+去除率的影響Fig.1 Effect of different pH on Pb2+removal rate

由圖1可知，鉛離子去除率是逐漸增加的，最高的去除率在pH值為6時(shí)。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，pH值在重金屬的溶解、沉淀、吸附方面有顯著的影響［16-17］。當(dāng)pH值較低時(shí)，陽離子占主要優(yōu)勢(shì)，一方面容易使菌表面的陰離子基團(tuán)質(zhì)子化，同時(shí)也會(huì)與金屬陽離子競(jìng)爭(zhēng)菌體表面的陰離子基團(tuán)［12］，最終導(dǎo)致其吸附效率低。當(dāng)pH值逐漸達(dá)到6時(shí)，菌體表面的羧基、羥基、磷酸根、氨基［12］逐漸暴露，以及殼聚糖［18-19］等與金屬陽離子結(jié)合，從而增加了鉛離子去除率。但pH繼續(xù)增加時(shí)，氫氧根與金屬產(chǎn)生沉淀效應(yīng)。因此，pH值為6時(shí)最佳。

2.1.2不同菌種添加量對(duì)鉛離子去除率的影響

圖2　不同菌種添加量對(duì)Pb2+去除率的影響Fig.2 Effect of different strain inoculum on the Pb2+removal rate

由圖2可知，鉛離子去除率是增加后減少的，在菌種添加量為4 g/L時(shí)，鉛離子去除率最高，為97.58%。菌種添加量1～4 g/L時(shí)，鉛離子去除率的增加，可能是菌體數(shù)的增多，相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)的也增多［20-21］。菌種添加量4～7 g/L，鉛離子去除率降低，最低為84.10%，可能是由于菌體數(shù)增多，菌體之間由于靜電作用產(chǎn)生聚合，進(jìn)而減少結(jié)合位點(diǎn)［22-23］。據(jù)MSHITAH等［24］研究發(fā)現(xiàn)更多吸附劑可能在細(xì)胞壁上產(chǎn)篩選效應(yīng)，從并不是所有的結(jié)合位點(diǎn)都有金屬離子附著，從而導(dǎo)致，鉛離子去除率降低。因此，菌種添加量為4g/L時(shí)最佳。

2.1.3不同初始鉛離子質(zhì)量濃度對(duì)鉛離子去除率的影響

圖3　不同初始鉛離子質(zhì)量濃度對(duì)Pb2+的去除率和吸附量的影響Fig.3 Effect of different initial Pb2+concentration on the Pb2+removal rate and adsorption quantity

由圖3可知，鉛離子去除率隨著初始鉛離子質(zhì)量濃度的增加而下降，而相反菌體鉛吸附量是增加的。當(dāng)初始鉛離子質(zhì)量濃度為10mg/L時(shí)，鉛離子去除率最大，為88.14%。在較低鉛離子質(zhì)量濃度條件下，鉛離子能與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而鉛離子去除率較高；在較高鉛離子質(zhì)量濃度條件下，鉛離子競(jìng)爭(zhēng)有限的結(jié)合位點(diǎn)，鉛離子遠(yuǎn)多于結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致鉛離子去除率降低。鉛吸附量是隨著鉛離子濃度的增加而增大的。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)［25-26］研究發(fā)現(xiàn)，這種可能是菌表面的結(jié)合位點(diǎn)快速的被鉛離子飽和化。因此，初始鉛離子質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)最佳。

2.1.4不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)鉛離子去除率的影響

圖4　不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Pb2+的去除率的影響Fig.4 Effect of different culture time on the Pb2+removal rate

由圖4可知，鉛離子去除率是先快速增加，后逐漸達(dá)到平衡。有文獻(xiàn)［17，20，27］將此過程分為兩個(gè)階段，第一個(gè)階段是快速增加，是菌體表面的物理的吸附或離子交換現(xiàn)象稱之為被動(dòng)的吸附，而這種吸附占主要部分，第二個(gè)階段是緩慢的達(dá)到平衡為主動(dòng)吸收。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道［14，28］相似。因此，培養(yǎng)時(shí)間為3 h時(shí)，鉛離子去除率最佳。

2.1.5不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)鉛離子去除率的影響

圖5　不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)Pb2+去除率的影響Fig.5 Effect of rotate speed on the Pb2+removal rate

由圖5可知，鉛離子去除率是先增加后下降的。在轉(zhuǎn)速為120 r/min時(shí)，鉛離子的去除率最大，為88.4%。這種先增加后下降的趨勢(shì)，分析可能是，先是菌體充分與鉛離子接觸，達(dá)到平衡，后因搖床轉(zhuǎn)速過大，鉛離子結(jié)合不穩(wěn)定，漩渦現(xiàn)象、菌體破壞等原因，造成菌體與鉛離子分開，致使鉛離子的去除率下降。該結(jié)果與文獻(xiàn)［23］一致。因此搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min時(shí)，鉛離子的去除率最好。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)

表3　Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of Plackett-Burman experiments

Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4。當(dāng)P＞F值＜0.05時(shí)，該因素對(duì)去除率影響有顯著性，且F值代表該因素對(duì)鉛離子去除率影響的大小，數(shù)值越大影響越顯著。由表4可知，因素A、B、C對(duì)鉛離子去除率有顯著影響（P＜0.05），可信度在95%置信度區(qū)間內(nèi)，其中因素A對(duì)鉛離子去除率影響最大，而其他的因素對(duì)鉛離子去除率沒有顯著性影響。故選擇以上3個(gè)因素進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。

表4　Plackett-Burman試驗(yàn)的回歸分析Table4 Regression analysis of Plackett-Burman experiments

2.3最陡爬坡試驗(yàn)

表5　最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Experimental design and results of the steepest ascent path

2.4中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析結(jié)果

表6　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 6 Design and results of response surface experiments

以鉛離子去除率（Y）為響應(yīng)值，對(duì)篩選的3個(gè)顯著性因素進(jìn)行CCD試驗(yàn)，結(jié)果見表6，方差分析結(jié)果見表7。對(duì)表6中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得出的回歸方程為：

表7　回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation

由表7可知，建立的模型P＜0.05，失擬項(xiàng)的P＞0.05，方程決定系數(shù)R2值為0.952 9，接近于1，可以說明此模型可信度高，能夠較好的描述試驗(yàn)結(jié)果。

2.5驗(yàn)證模型

對(duì)CCD試驗(yàn)得出的最佳條件，即pH值為5.89、菌體量4.18 g/L、初始鉛離子質(zhì)量濃度9.62 mg/L時(shí)，鉛離子去除率理論值為95.69%。為方便實(shí)際操作，修改條件為pH值為6，菌種添加量為4.2 g/L，初始鉛離子質(zhì)量濃度為9.6 mg/L，對(duì)該試驗(yàn)的條件重復(fù)3次進(jìn)行驗(yàn)證，得出鉛離子去除率分別為95.43%、94.97%、95.12%，平均值95.17%。與預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差為0.52%，說明該模型具有一定參考價(jià)值。AMIRNIA S［29］也采用響應(yīng)面對(duì)啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）去除鉛離子進(jìn)行優(yōu)化，得出在pH值為5、菌種添加量5.5 g/L、金屬質(zhì)量濃度40 mg/L時(shí)，鉛離子去除率達(dá)98%。

3　結(jié)論

本研究了一株德氏乳桿菌對(duì)KLDSI.0207鉛離子去除的情況，通過單因素試驗(yàn)、PB試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)以及響應(yīng)面法進(jìn)行對(duì)Pb2+吸附條件進(jìn)行優(yōu)化，最后得出該菌在pH值為6、菌種添加量4.2 g/L、初始鉛離子質(zhì)量濃度9.6 mg/L時(shí)，鉛離子去除率為95.17%，同時(shí)也對(duì)該模型進(jìn)行驗(yàn)證，得出一致的結(jié)論，為接下來進(jìn)行深入研究及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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Optimization of the Pb2+adsorption by lactiv acid bacteria

YU Shangfu，XU Min，DING Xiuyun，WANG Nana，HUO Guicheng*
（Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education，College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Using theLactobacillus delbrueckiiKLDS1.0207 with good ability to remove Pb2+as research object and Pb2+removal rate as evaluation index，the main factors affecting the Pb2+removal rate were screened by Plackett-Burman design，and the pH，strain inoculum and initial Pb2+concentration were determined as main influence factors.The three main influence factors were optimized by response surface methodology.The results showed that when the pH was 6，strain inoculum was 4.2 g/L and the initial Pb2+concentration was 9.6 mg/L，the Pb2+removal rate was the highest of 9.6 mg/L.The fitting of model was good，and the theoretical value was in accord with the actual value.

Lactobacillus delbrueckiiKLDS1.0207；Pb2+；biosorption；response surface method

TS201.3

0254-5071（2016）02-0109-09

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.025

2015-12-16

國家自然科學(xué)基金（31401512）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃‘863計(jì)劃'（2011AA100902）

于上富（1989-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。

霍貴成（1958-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。