狄志彪，馬艷妮，陳新璐，田志祥，崔耀天，韓春超，董　祺（.山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南 250355；2.山東老來壽生物工程有限公司，山東 濟南 2500）

液體發(fā)酵蛹蟲草中蟲草素含量分布的研究

狄志彪1，馬艷妮1，陳新璐1，田志祥1，崔耀天1，韓春超1，董祺2*
（1.山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南 250355；2.山東老來壽生物工程有限公司，山東 濟南 250101）

研究蛹蟲草在5種不同培養(yǎng)基中經(jīng)液體發(fā)酵后菌絲體和發(fā)酵液中蟲草素占總蟲草素含量的分布情況，建立一種高效液相色譜法測定蟲草素的含量的方法。色譜柱為Welch Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：水-甲醇（85∶15，V/V）；流速：1 mL/min；檢測波長：260 nm；蟲草素在0.312 5～20 μg/mL線性關(guān)系良好（R=0.999 7），加標回收試驗中發(fā)酵液和菌絲體中蟲草素的平均回收率分別是99.5%、99.2%，相對標準偏差（RSD）分別為1.081%、1.086%，穩(wěn)定性和精密度試驗檢測結(jié)果的RSD分別為2.68%和1.9%。表明該方法的準確性、精密度及穩(wěn)定性良好。結(jié)果表明，液體發(fā)酵培養(yǎng)蛹蟲草時，發(fā)酵液與菌絲體中蟲草素的質(zhì)量比約為97∶3，改變培養(yǎng)基的種類不會影響總蟲草素在發(fā)酵液與菌絲體中的分配比。

蛹蟲草；培養(yǎng)基；蟲草素；發(fā)酵液

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又被稱為北冬蟲夏草，與冬蟲夏草同屬異種，為麥角菌科的蟲草屬真菌。與冬蟲夏草有部分相似的活性成分，包括蟲草酸、蟲草多糖、蟲草素、超氧化物歧化酶（superoxyde dismutase，SOD）、氨基酸等。其中，蟲草素（cordycepin）又名3'-脫氧腺苷或蟲草菌素，是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗菌素［1-2］。具有抗腫瘤、增強免疫力、抑菌、抗炎、抗血管平滑肌等多種生物活性［3］。

目前，蛹蟲草固體培養(yǎng)在國內(nèi)已實現(xiàn)一定的規(guī)?；?，采用液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)可以大幅度提高蟲草素的產(chǎn)量［4-5］。近年來，國內(nèi)外為提高蟲草素產(chǎn)量，從誘變菌株［6-7］、改變培養(yǎng)條件［8］以及改變培養(yǎng)基［9-10］等方面做了大量研究。因此，液體深層發(fā)酵是實現(xiàn)蟲草素規(guī)?；?，產(chǎn)量化的一個重大課題。而在蛹蟲草液體擴大培養(yǎng)前必然需要對蟲草素的檢測方法及蟲草素在發(fā)酵液與菌絲體中的含量分布做一個系統(tǒng)研究。實驗采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對蟲草素進行測定，對該檢測方法進行了方法學研究，并探討液體發(fā)酵蛹蟲草中蟲草素的含量分布，進而提高蟲草素在液體發(fā)酵中的產(chǎn)量，為蟲草素早日實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)提供一定參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1供試菌株

14014蛹蟲草：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2試劑

甲醇（色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司；純凈水：杭州娃哈哈集團有限公司；蟲草素標準品（純度99%）：Aladdin試劑（上海）有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：馬鈴薯提取液200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L，pH自然。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，VB10.01 g/L，pH自然。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：A.葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5g/L，VB10.01g/L；B.葡萄糖20g/L，麩皮5%，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，VB10.01 g/L；C.葡萄糖20 g/L，麩皮9%，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，VB10.01 g/L；D.葡萄糖20 g/L，麩皮13%，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，VB10.01 g/L；E.葡萄糖20 g/L，豆粕5%，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，VB10.01 g/L。

1.2儀器與設(shè)備

YX-280D手提式壓力蒸汽滅菌鍋：寧波久興醫(yī)療器械有限公司；RH-QG全溫光照振蕩器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；ZHJH-C1109B超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；SC-06離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀：日本島津公司；KQ-100B型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1培養(yǎng)方法

活化菌種：將菌種接種于固體培養(yǎng)基上，將其放置在25℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6 d。

種子液培養(yǎng)：將活化后的菌種接種于種子培養(yǎng)基中，置于全溫光照振蕩器中25℃、130 r/min搖床，培養(yǎng)5 d。

液體深層發(fā)酵培養(yǎng)：取培養(yǎng)完成的種子液接于裝液量為150 mL/250 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，接種量為3%，于25℃、130 r/min搖床培養(yǎng)15 d，每種培養(yǎng)基各培養(yǎng)3瓶。

1.3.2菌絲的處理

將發(fā)酵完成的液體培養(yǎng)基用多層紗布進行過濾，把菌絲體與發(fā)酵液分離，將菌絲體放入60℃的烘箱中干燥，干燥至質(zhì)量恒定后粉碎，稱質(zhì)量并求平均值；然后稱取不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲0.2 g，置于帶塞試管中，用水作為提取溶劑，選擇1∶80（g∶mL）的料液比，超聲波處理30 min，70℃水浴提取，提取完后將提取液定容至25 mL容量瓶中［11］。過0.45 μm的微孔濾膜，取濾液，待檢測蟲草素，每個樣品均平行測定3次。

1.3.3發(fā)酵液的處理

將過濾后的發(fā)酵液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在70℃條件下進行濃縮，濃縮到一定體積后進行離心，4 000 r/min離心10 min得到上清液，各取5 mL上清液定容至25 mL容量瓶內(nèi)，過0.45 μm的微孔濾膜，取濾液，檢測蟲草素，每個樣品均平行測定3次。

1.3.4蟲草素的測定

（1）高效液相法測定色譜條件［12-13］

WelchUltimateXB-C18色譜柱（5μm，4.6mm×250mm）；流動相：水-甲醇（85∶15，V/V）；流速：1 mL/min；檢測波長：260 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

（2）標準溶液的配制［14］

精密稱取適量的蟲草素標準品，加純凈水制備成每1 mL含0.5 mg蟲草素的溶液，作為蟲草素標準品母液。吸取不同體積的蟲草素標準品母液，用純凈水稀釋定容于10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度范圍0.312 5～20 μg/mL。每個濃度進樣20 μL，平行3次，記錄峰面積，并求平均值。以蟲草素的質(zhì)量濃度為橫坐標，以其質(zhì)量濃度對應的吸收峰面積為縱坐標。繪制蟲草素的標準曲線。

1.3.5回收率試驗

稱取A培養(yǎng)基液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的蛹蟲草菌絲0.2 g和發(fā)酵液10 mL，菌絲分別加入的0.015 g和0.020 g蟲草素標準品，按照“1.3.2”項方法制備菌絲供試品溶液。發(fā)酵液分別加入0.1 g和0.2 g蟲草素標準品，按照“1.3.3”項方法制備發(fā)酵液供試品溶液，處理后每個進樣3次。按照“1.3.4”項色譜條件進行測定，計算加樣回收率（回收率=測定值/理論值×100%）。

1.3.6穩(wěn)定性實驗

取“1.3.3”項配制好的同一發(fā)酵液供試品分別在0、4 h、8 h、12 h、24 h時，按照“1.3.4”項色譜條件進行測定，記錄蟲草素的峰面積，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），確定該檢測物質(zhì)的穩(wěn)定性。

1.3.7精密度實驗

在“1.3.4”項色譜條件下以“1.3.3”項配制好的同一發(fā)酵液供試品連續(xù)進樣6次，記錄蟲草素的峰面積，計算RSD值，確定該檢測方法的精密度。

2　結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵液及菌絲的產(chǎn)量

按“1.3.1”項方法培養(yǎng)后，每種培養(yǎng)基所對應的每個搖瓶中發(fā)酵液的平均體積和經(jīng)“1.3.2”項方法處理后每個搖瓶中的菌絲體的平均質(zhì)量見表1。

表1　發(fā)酵液及菌絲體的平均產(chǎn)量Table 1 The average yield of fermented liquid and mycelium

2.2蟲草素標準曲線的繪制

不同濃度的蟲草素標準品進樣后，以蟲草素的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，以其質(zhì)量濃度對應的吸收峰面積（y）為縱坐標，得到蟲草素的標準曲線見圖1。

圖1　蟲草素標準曲線Fig.1 Standard curve of cordycepin

由圖1可知，蟲草素標準曲線回歸方程為y=49 219x+ 5 924.3，相關(guān)系數(shù)R2為0.9997，結(jié)果表明，蟲草素在0.312 5～20 μg/mL范圍內(nèi)二者線性關(guān)系良好。

2.3加標回收實驗

A培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲和發(fā)酵液中蟲草素的平均加標回收率試驗結(jié)果分別見表2及表3。

表2　菌絲體中蟲草素的加標回收率試驗結(jié)果Table 2 Results of standard recovery rate experiments of cordycepin in mycelium

表3　發(fā)酵液中蟲草素的加標回收率試驗結(jié)果Table 3 Results of standard recovery rate experiments of cordycepin in fermentation liquid

由表2可知，菌絲中蟲草素的加標回收率為98.1%～101.2%，平均值為99.2%，其結(jié)果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.086%。由表3可知，發(fā)酵液中蟲草素的加標回收率為98.2%～101.1%，平均值為99.5%，其結(jié)果的相對標準偏差（RSD）為1.081%。結(jié)果表明，該檢測方法準確度高。

2.4穩(wěn)定性實驗

同一發(fā)酵液供試品分別在0、4 h、8 h、12 h、24 h進樣測定，測得蟲草素的峰面積，結(jié)果見表4。

表4　穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 4 Results of the stability tests

由表4可知，穩(wěn)定性實驗檢測結(jié)果的RSD為2.68%，結(jié)果顯示樣品溶液在24 h內(nèi)蟲草素含量穩(wěn)定。

2.5精密度實驗

同一發(fā)酵液供試品連續(xù)進樣6次進行測定，測得蟲草素峰面積，結(jié)果見表5。

表5　精密度試驗結(jié)果Table 5 Results of the precision tests

由表5可知，精密度試驗檢測結(jié)果的RSD值為1.90%，結(jié)果表明儀器精密度好。

2.6樣品的測定

在上述確定的色譜條件下對制備的10種供試品進行測定。蟲草素標準品的高效液相色譜檢測結(jié)果見圖2，蛹蟲草菌絲提取物及發(fā)酵液高效液相色譜檢測結(jié)果分別見圖3、圖4。

圖2　蟲草素標準品的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatography of cordycepin standard

圖3　蛹蟲草菌絲體提取物高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatography of extracts fromC.militaris mycelium

圖4　蛹蟲草發(fā)酵液高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatography ofC.militarisfermentation liquid

如圖2～4所示，蟲草素標準品的保留時間在14.382 min，樣品菌絲提取液和發(fā)酵液分別在14.765 min和14.532 min處也分離出一峰，可以判斷為蟲草素，根據(jù)測定的峰面積和標準曲線線性回歸方程，計算樣品中蟲草素含量。不同樣品中蟲草素含量測定結(jié)果如表6所示。

表6　樣品中蟲草素的含量測定結(jié)果（n=3）Table 6 Determination results of cordycepin content in samples（n=3）

由表6可知，每種培養(yǎng)基中發(fā)酵液的蟲草素占總蟲草素的質(zhì)量分數(shù)高，占97%左右，且不同培養(yǎng)基中菌絲體和發(fā)酵液中蟲草素含量質(zhì)量比均為3∶97。結(jié)果表明，液態(tài)深層發(fā)酵蛹蟲草中發(fā)酵液和菌絲體中蟲草素的質(zhì)量比是基本恒定的，其不隨培養(yǎng)基的改變而改變。

3　結(jié)論

實驗通過選取不同的氮源及改變氮源的用量，來改變培養(yǎng)基的組成，并在相同的條件下對蛹蟲草進行培養(yǎng)，最終通過高效液相色譜儀對菌絲體和發(fā)酵液中蟲草素的含量進行了測定，并對其進行了分析。本實驗建立了一種高效液相色譜測定蛹蟲草中蟲草素的分析方法，該法的靈敏度、精密度及準確性較高。

結(jié)果表明，發(fā)酵液中蟲草素的量與菌絲中蟲草素的量是有一定關(guān)系的。從測定結(jié)果來看，通過選用不同的培養(yǎng)基，菌絲體及發(fā)酵液中蟲草素在總蟲草素中的質(zhì)量分數(shù)幾乎是恒定的，它們之間有一定的比例，發(fā)酵液中蟲草素占總蟲草素的含量約為97%，菌絲體占3%。

本實驗初步確定了液體深層發(fā)酵培養(yǎng)條件下蟲草素的分布情況，與MASUDA M等［15-16］的研究基本是一致的，蟲草素在菌絲體及發(fā)酵液中的比例是一個定值，且蟲草素幾乎存在于發(fā)酵液中。實驗證明了改變培養(yǎng)基可以提高蟲草素的產(chǎn)量，但不會改變分配比，為進一步研究液體發(fā)酵蛹蟲草中蟲草素含量的分析測定提供參考。

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Research on the content distribution of cordycepin in Cordyceps militaris by liquid fermentation

DI Zhibiao1，MA Yanni1，CHEN Xilu1，TIAN Zhixiang1，CUI Yaotian1，HAN Chunchao1，DONG Qi2*
（1.College of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China；2.Shandong Laolaishou Biological Engineering Co.，Ltd.，Jinan 250101，China）

Cordyceps militariswas cultured in five different culture media.After liquid fermentation，the distributed situation of cordycepin in the mycelium and fermented liquid was researched.A determination method of cordycepin content was established by HPLC.The method was conducted with Welch Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）as chromatographic column，mobile phase water-methanol（85∶15，V/V），flow rate 1 ml/min，detection wavelength 260 nm.The cordycepin had a good linear relationship in the range of 0.312 5-20 μg/ml（R=0.999 7）.In the standard recovery rate tests，the average recovery rate of cordycepin in the fermented liquid and mycelium were 99.5%and 99.2%，respectively.Relative standard deviation（RSD）was 1.081%and 1.086%，respectively.RSD of stability and precision experiments were 2.68%and 1.9%，respectively，which indicated that the method had good accuracy，precision and stability.The results showed that when theC.militariswas cultured in liquid fermentation medium，the mass ratio of cordycepin in the fermented liquid and mycelium was about 97∶3.The changes of culture medium types had no effect on the distribution ratio of total cordycepin in the fermented liquid and mycelium.

Cordyceps militaris；culture medium；cordycepin；fermentation broth

Q939.5

0254-5071（2016）02-0084-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.019

2015-11-24

山東省重點研發(fā)計劃（520864）

狄志彪（1989-），男，碩士研究生，研究方向為中藥制劑及生物工程。

董祺（1973-），男，中藥師，碩士，研究方向為中藥制藥。