徐麗萍（四川化工職業(yè)技術學院，四川 瀘州 646005）

瀘型大曲中產(chǎn)酯酵母的篩選鑒定及產(chǎn)酯條件優(yōu)化

徐麗萍
（四川化工職業(yè)技術學院，四川 瀘州 646005）

乙酸乙酯是構成濃香型白酒香味的主要物質之一，其含量對白酒的風味和質量起著非常重要的作用。該試驗在瀘州大曲中分離出了8株酵母菌，經(jīng)菌落形態(tài)和生理生化實驗鑒定分別為假絲酵母屬（Candidasp.）、漢遜酵母屬（Hansenulasp.）、酒香酵母屬（Brettanomycessp.）和德克酵母屬（Dekkerasp.），并篩選出4#菌株為高效產(chǎn)酯酵母。利用此漢遜酵母進行發(fā)酵并對其產(chǎn)酯條件進行優(yōu)化。正交試驗結果表明，漢遜酵母的適宜培養(yǎng)條件為在麥芽汁培養(yǎng)基中添加10%葡萄糖、0.5%乙酸、體積分數(shù)95%的乙醇5%，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間3 d，搖瓶轉速120 r/min，在此條件下產(chǎn)酯量最高可達1.479 g/L。

濃香型大曲；產(chǎn)酯酵母；優(yōu)化

產(chǎn)酯酵母不是微生物學上的分類名稱，它是一類能夠代謝產(chǎn)生酯類物質的酵母菌總稱。其所產(chǎn)生的酯隨菌種、培養(yǎng)條件及生產(chǎn)工藝的不同而存在差異［1］。產(chǎn)酯酵母大多屬于異性漢遜酵母（Hansenula anaomala），具有較強的氧化特性和產(chǎn)酯能力。在生產(chǎn)白酒時，可以利用產(chǎn)酯酵母提高酒的主體香含量（如乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯等）以及乙酸甲酯、辛酸乙酯等次要香味物質。濃香型白酒的生產(chǎn)過程中，產(chǎn)酯酵母可以用于培養(yǎng)己酸菌功能液、保護窖泥和直接入池發(fā)酵［2］。

大曲中的微生物主要通過自然接種、富集而構成復雜的微生物菌系。酒曲中的有益微生物包括霉菌、細菌及酵母菌等。酵母在白酒發(fā)酵過程中起發(fā)酵產(chǎn)酒精和產(chǎn)酯生香作用。產(chǎn)酯酵母主要是假絲酵母和漢遜酵母，具有較強的酯合成能力，能代謝產(chǎn)生大量的酯類物質（如己酸乙酯等），可賦予瀘型大曲酒濃郁的芬芳［3-4］。產(chǎn)酯酵母配合己酸菌液能提高大曲酒的酒質，用量為己酸菌數(shù)的50%，有利于己酸菌數(shù)的提高；在糟醇中添加5%的產(chǎn)酯酵母，然后配合己酸菌液效果最好。本研究對大曲中產(chǎn)酯酵母進行篩選鑒定，并對其產(chǎn)酯條件進行優(yōu)化，旨在提高大曲酒品質。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1酒曲

瀘州某品牌大曲。

1.1.2試劑

麥芽浸膏、氯霉素、碳源基礎培養(yǎng)基、氮源基礎培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、酵母浸膏、40%尿素（生化試劑）、L-乳酸（分析純）：成都格雷西亞試劑公司；葡萄糖、體積分數(shù)95%乙醇（分析純）：成都科龍化工試劑廠；玉米粉、牛肉浸膏（生化試劑）：成都華星生化制品廠；蛋白胨（生化試劑）：成都長壽生物制劑有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：西安沃爾森生物技術有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基

（1）麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽汁150 mL，瓊脂3 g，1～2滴乳酸，蒸餾水1 000 mL，pH自然（約6.4）。

（2）麥芽汁瓊脂乳酸培養(yǎng)基：麥芽汁150 mL，瓊脂3 g，1～2滴乳酸，蒸餾水1 000 mL，pH自然（約6.4）。

（3）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯（去皮切塊）300g，葡萄糖20g，瓊脂20 g，0.1 g氯霉素，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0±0.2。

（4）水解尿素培養(yǎng)基：蛋白胨1 g，氯化鈉5 g，葡萄糖1 g，磷酸二氫鉀2 g，0.4%酚紅溶液3 mL，蒸餾水1 000 mL，20%尿素溶液100 mL，pH7.2±0.1。

（5）沙堡氏培養(yǎng)基：蛋白胨1 g，葡萄糖或麥芽糖4 g，水100 mL。

（6）玉米瓊脂培養(yǎng)基：玉米浸粉7 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.0±0.2［4］。

1.2儀器與設備

KXB-11A恒溫培養(yǎng)箱、KXH202-2A恒溫干燥箱：上海科析試驗儀器廠；HZQ-C空氣浴振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；PHS-25數(shù)顯酸度計：上海虹益儀器儀表有限公司；UV-1800PC紫外分光光度計：上海美諾達儀器有限公司；E100生物顯微鏡：日本尼康公司；SW-CJ-1BU潔凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；LS-B35L-I立式壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設備有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1酒曲中酵母菌的分離與純化

酒曲的富集培養(yǎng)：選取顏色正常、外形完整、質地均勻的優(yōu)質大曲，紫外線滅菌0.5 h后，用無菌小刀切開曲塊，從曲塊內層取一定量大曲，磨碎混勻，準確稱取5.00 g樣品，加入10 mL麥芽汁液體培養(yǎng)基中，加入一滴乳酸，搖勻后25℃培養(yǎng)24 h［5-8］。

平板分離：將富集培養(yǎng)物稀釋成10-1～10-7的梯度懸液。每個稀釋濃度分別吸取0.1 mL涂布到2～3個麥芽汁固體平板中，28℃培養(yǎng)48 h。

酵母菌的篩選與純化：對平板上長出的典型酵母菌單菌落特征進行記錄，借助鏡檢，選擇不同類型的酵母菌接種于PDA培養(yǎng)基中，在25℃培養(yǎng)2～5 d后，選取形態(tài)不同的單菌落劃線接種并傳代2～3次，經(jīng)鏡檢確定為單菌落后，選取長勢較好菌種，接種于麥芽汁瓊脂乳酸斜面培養(yǎng)基中，放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?］。

1.3.2酵母菌的鑒定［6］

根據(jù)巴尼特《酵母的特征與鑒定手冊》，通過形態(tài)學特征和生理學試驗結合的方法鑒定酵母菌。

酵母菌的形態(tài)學鑒定：主要進行菌落特征觀察、子囊孢子觀察、細胞形態(tài)學觀察、假菌絲觀察、無性繁殖觀察。

初步生理生化實驗鑒定：主要進行糖發(fā)酵試驗、硝酸鹽利用試驗、類淀粉化合物測定試驗、脲酶試驗。

1.3.3菌種的活化及液態(tài)培養(yǎng)

活化及液態(tài)培養(yǎng)：無菌條件下，將1.3.1中分離純化的酵母菌種接種于試管麥芽汁瓊脂乳酸培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24～36 h；選取菌種生長旺盛的試管，接種到10 mL麥芽汁液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24～36 h。

擴大培養(yǎng)：將試管中的菌液接種到100 mL富集培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24 h備用。

1.3.4高效產(chǎn)酯酵母的篩選

取8個2 000 mL的三角瓶，分別加入100 mg/L的葡萄糖900 mL，經(jīng)高壓滅菌后，冷卻至室溫，按10%的接種量接入培養(yǎng)成熟的小三角瓶中的種子液，并按比例加入0.5%無水乙酸、8%體積分數(shù)95%的乙醇，30℃條件下恒溫發(fā)酵5 d，分別測定發(fā)酵液在第1、2、3、4、5天的總酯含量。

1.3.5產(chǎn)酯條件優(yōu)化

將1.3.4部分篩選得到的高效產(chǎn)酯酵母菌進行活化、擴大培養(yǎng)后，分別進行葡萄糖添加量（5%、10%、15%、20%、25%）、乙酸添加量（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）、乙醇添加量（1%、3%、5%、7%、9%）、發(fā)酵溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）、發(fā)酵時間（1d、3d、5d、7d、9d）和搖瓶轉速（30r/min、60 r/min、90 r/min、120 r/min、150 r/min）單因素試驗。

在單因素試驗基礎上，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間及搖瓶轉速為試驗因素，每個因素選擇3個水平，進行培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗［2］，正交試驗因素與水平見表1。

表1　培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for cultural condition optimization

1.3.6測定方法

總酯的測定：取發(fā)酵液50.0 mL，用0.1 mol/L的NaOH標液中和。加0.1 mol/L的NaOH標液25.0 mL進行皂化，加蓋置于暗處反應24 h，然后加入0.1 mol/L的1/2 H2SO4溶液25.0 mL；用0.1 mol/L的NaOH標液滴定，滴到pH = 8.20為滴定終點；記錄消耗NaOH標液的體積，另外，使用空白三角瓶的樣液作空白對照［7-12］?？傰ビ嬎愎饺缦拢?/p>

式中：X為總酯的含量，g/L；C1為氫氧化鈉標準溶液的濃度，mol/L；C2為硫酸標準溶液的濃度，mol/L；V為測定時消耗硫酸標準溶液的體積，mL。

2　結果與分析

2.1酵母菌鑒定

觀察分離得到的8株酵母菌的菌落形態(tài)，并對細胞和菌絲形態(tài)進行鏡檢，鑒定結果見表2［13］；對1#～8#菌株做繁殖方式、子囊孢子、生理生化鑒定，鑒定結果見表3。

表2　8株酵母菌形態(tài)學鑒定結果Table 2 Morphology identification results of eight yeasts

表3　繁殖方式和生理生化實驗鑒定結果Table 3 Propagation modes and biphysical and biochemical tests identification results

由表2、表3依據(jù)酵母菌各屬檢索表按巴尼特《酵母的特征與鑒定手冊》進行分析，1#、3#、5#菌株為假絲酵母屬、4#、8#菌株為漢遜酵母屬、2#、6#菌株為酒香酵母屬、7#菌株為德克酵母屬［14］。

2.2高效產(chǎn)酯酵母菌株的篩選

按15%的接種量，麥芽汁培養(yǎng)基中添加10%葡萄糖、0.5%乙酸、8%體積分數(shù)95%乙醇為發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃恒溫發(fā)酵5 d，分別測定發(fā)酵液在第1、2、3、4、5天的總酯含量，結果見表4［15］。

表4　不同菌株在不同發(fā)酵時間的產(chǎn)酯量Table 4 Ester yield of different strains during different fermentation time g/L

從表4可以看出，各菌株酯化能力隨發(fā)酵時間的延長，其產(chǎn)酯總積累量時間也不同，第3#、5#、6#菌株在第1天時產(chǎn)酯累積量最高，其產(chǎn)酯變化趨勢基本相同；第1#、2#、4#、7#、8#菌株在第2天的產(chǎn)酯累積量最高，第1#、2#、7#菌株產(chǎn)酯變化趨勢基本相同，第4#、8#菌株產(chǎn)酯變化趨勢基本相同。從表3可以看出，各菌株酯化能力隨發(fā)酵時間的延長，其產(chǎn)酯總積累量時間也不同，其中4#菌株酯化能力較強，產(chǎn)酯量可以達到0.597 g/L。

2.3產(chǎn)酯條件優(yōu)化單因素試驗

2.3.1葡萄糖添加量對產(chǎn)酯量的影響

由葡萄糖添加量對產(chǎn)酯量的影響（圖1）可知，隨著葡萄糖添加量的增加，產(chǎn)酯量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，葡萄糖添加量為10%時產(chǎn)酯量達到最高。因此選擇葡萄糖添加量為10%。

圖1　葡萄糖添加量對產(chǎn)酯量的影響Fig.1 Effect of glucose addition on ester yield

2.3.2乙酸添加量對產(chǎn)酯量的影響

由乙酸添加量對產(chǎn)酯量的影響（圖2）可知，隨著乙酸添加量的增加，產(chǎn)酯量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，乙酸添加量為0.5%時產(chǎn)酯量達到最高，過量的乙酸對產(chǎn)酯酵母的生長繁殖和產(chǎn)酯能力都有一定的抑制作用。因此選擇乙酸添加量為0.5%。

圖2　乙酸添加量對產(chǎn)酯量的影響Fig.2 Effect of acetic acid addition on ester yield

2.3.3乙醇添加量對產(chǎn)酯量的影響

乙醇添加量對產(chǎn)酯量的影響（圖3）可以看出，隨著乙醇添加量的增加，產(chǎn)酯量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，乙醇添加量為5%時產(chǎn)酯量達到最高，過量的乙醇對產(chǎn)酯酵母的產(chǎn)酯性能有一定的抑制作用，不利于乙酸乙酯的生成。因此選擇乙醇添加量為5%。

圖3　乙醇添加量對產(chǎn)酯量的影響Fig.3 Effect of ethanol addition on ester yield

2.3.4發(fā)酵溫度對產(chǎn)酯量的影響

由發(fā)酵溫度對產(chǎn)酯量的影響（圖4）可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，產(chǎn)酯量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，發(fā)酵溫度為30℃時產(chǎn)酯量達到最高，溫度的高低影響酵母菌體內的一系列酯化酶的活性，對乙酸乙酯合成的影響較大。溫度過低或過高時酵母菌細胞內酶活力降低，酯化能力較弱，酯累積量少，都不利于產(chǎn)酯，且溫度的升高會加速酯的水解及揮發(fā)［15］。因此選擇發(fā)酵溫度為30℃。

圖4　發(fā)酵溫度對產(chǎn)酯量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on ester yield

2.3.5發(fā)酵時間對產(chǎn)酯量的影響

由發(fā)酵時間對產(chǎn)酯量的影響（圖5）可知，隨著發(fā)酵時間的延長，產(chǎn)酯量呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，可能原因是隨時間延長累積產(chǎn)生的酯揮發(fā)或被酯解酶分解，發(fā)酵時間為1 d時產(chǎn)酯量達到最高。因此選擇發(fā)酵時間1 d、3 d、5 d進行正交試驗。

圖5　發(fā)酵時間對產(chǎn)酯量的影響Fig.5 Effect of fermentation time on ester yield

2.3.6搖瓶轉速對產(chǎn)酯量的影響

搖瓶轉速對產(chǎn)酯量的影響（圖6）可以看出，隨著搖瓶轉速的增加，產(chǎn)酯量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，搖瓶轉速為120r/min時產(chǎn)酯量達到最高。因此選擇搖瓶轉速為120 r/min。

圖6　搖瓶轉速對產(chǎn)酯量的影響Fig.6 Effect of shake flask rotation speed on ester yield

2.3.7正交試驗

正交試驗結果與分析見表5，方差分析見表6。

表5　培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiments for cultural condition optimization

由表5可知，4個因素對產(chǎn)酯量影響的關系依次為葡萄發(fā)酵溫度＞搖瓶轉速＞發(fā)酵時間，試驗最優(yōu)組合為A2B2C2，即發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時間3 d、搖瓶轉速120 r/min。該組合并未出現(xiàn)在正交試驗表中，因此對該組合進行驗證試驗，在此條件下，產(chǎn)酯量為1.479 g/L。

表6　正交試驗結果方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表6可知，影響產(chǎn)酯酵母產(chǎn)酯量的3個因素影響均不顯著。

3　結論

在瀘州大曲中分離出了8株酵母菌，經(jīng)菌落形態(tài)和生理學鑒定分別為假絲酵母屬、漢遜酵母屬、酒香酵母屬和德克酵母屬，并篩選出4#菌株為高效產(chǎn)酯酵母。以此漢遜酵母進行產(chǎn)酯條件優(yōu)化試驗，漢遜酵母的適宜培養(yǎng)條件為在麥芽汁培養(yǎng)基中添加10%葡萄糖、0.5%乙酸、5%體積分數(shù)95%的乙醇，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間3 d，搖瓶轉速120 r/min，在此條件下產(chǎn)酯量最高可達1.479 g/mL。

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Screening and identification of ester-producing yeast in Luzhou Daqu and Optimization of ester productioon conditions

XU Liping
（Sichuan Vocational College of Chemical Technology，Luzhou 646005，China）

Ethyl acetate is one of main aroma compounds of Luzhou-flavor liquor，and the ethyl acetate content plays an important role in liquor flavor and quality.Eight yeast strains were screened from Luzhou Daqu，and they were identified asCandidasp.，Hansenulasp.，Brettanomycessp.，and Dekkerasp.by colonial morphology and biophysical and biochemical tests identification.The experimental results showed that strain 4#was the most efficient ester producing strain.The fermentation process was conducted by the strain and the ester production condition was optimized.The orthogonal experiments results showed that the appropriate culture conditions for yeast was addition of glucose 10%，acetic acid 0.5%，95%ethanol 5% in culture medium，fermentation temperature 30℃，time 3 d，shake flask rotation speed 120 r/min，under the condition，the ester yield was 1.479 g/L.

Luzhou Daqu；ester-producing yeast；optimization

TS261.1

0254-5071（2016）02-0074-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.017

2015-10-22

四川省科技廳項目（14KCTX0056）

徐麗萍（1976-），女，副教授，碩士，研究方向為發(fā)酵工程。