王　建，羅紅霞，于佳弘，汪長鋼，張　?。ū本┺r(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 食品與生物工程系，北京 102442）

響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合乳酸菌培養(yǎng)條件

王建，羅紅霞*，于佳弘，汪長鋼，張俊
（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 食品與生物工程系，北京 102442）

將從青貯飼料中自行分離得到的3株優(yōu)良乳酸菌組成復(fù)合乳酸菌，利用響應(yīng)面分析法對復(fù)合乳酸菌的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken Design設(shè)計試驗，并利用Design Expert 8.0.6軟件對模型和各因素的顯著性及可信性進行分析，優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度37℃、初始pH值為7.0、接種量（配比為1∶1∶1）4%。在此最佳條件下，獲得的乳酸菌菌落數(shù)對數(shù)值為9.79。

培養(yǎng)條件；響應(yīng)面法；復(fù)合乳酸菌

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是指能使碳水化合物（主要為葡萄糖）發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的細菌的通稱［1］。乳酸菌是人類和動物的腸道中占舉足輕重地位的優(yōu)勢菌群之一，能夠有效地調(diào)節(jié)機體狀態(tài)，對生物體維持健康方面能發(fā)揮比較重要的作用。具有優(yōu)良性狀的乳酸菌可以在食品業(yè)中作為發(fā)酵劑使用，也可在飼料制備中作為酸化劑使用，還可以制作成調(diào)節(jié)腸道的各種益生制劑，為動物和人類的健康貢獻力量。研究表明，在青貯飼料中添加乳酸菌有增加乳酸濃度、抑制霉菌繁殖和提高青貯飼料品質(zhì)的作用［2］。

將兩種或多種乳酸菌菌株進行混合復(fù)配共同發(fā)酵，其發(fā)酵能力、益生效果都要強于單株乳酸菌。復(fù)合菌株的培養(yǎng)在發(fā)酵食品生產(chǎn)、環(huán)境和能源有效利用等相關(guān)領(lǐng)域已有相應(yīng)的一些經(jīng)驗累積和應(yīng)用［3］。目前，國內(nèi)外研究較多的復(fù)合乳酸菌主要集中在由雙歧桿菌和乳桿菌組成的益生菌及其制品［4-5］，應(yīng)用在藥品、保健品、食品等方面，發(fā)揮乳酸菌的益生功效［6-7］。

響應(yīng)面分析（response surface methods，RSM）方法基于數(shù)學(xué)與統(tǒng)計學(xué)的結(jié)合，它是將體系的響應(yīng)作為一個或多個因素的函數(shù)，運用圖形技術(shù)將這種函數(shù)關(guān)系顯示出來，以選擇試驗設(shè)計中的最優(yōu)化條件［8］。響應(yīng)面分析方法可以快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件，目前已廣泛應(yīng)用于各類培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化實踐中［9-15］。

本試驗從青貯飼料中篩選出3株產(chǎn)酸性能強、生長速度快，且抑菌效果較好的優(yōu)良乳酸菌菌株組成復(fù)合乳酸菌，利用響應(yīng)面分析法（RSM）對其培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。根據(jù)優(yōu)化后的培養(yǎng)條件，提高復(fù)合乳酸菌的存活率，從而獲得較高菌體數(shù)量，為后期復(fù)合乳酸的菌體富集、菌粉加工提供研究基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）NZ3、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）NZ7及干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）NZ9均分離自玉米青貯飼料；脫脂乳粉：市售。

1.1.2培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，葡萄糖20.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，吐溫-80 1.0 mL，磷酸氫二鉀2.0 g，七水硫酸鎂0.2 g，七水硫酸錳0.05 g，蒸餾水1.0 L，pH 6.8。

1.1.3主要化學(xué)試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖：北京陸橋技術(shù)有限責任公司；吐溫-80、乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、七水硫酸錳（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

SW-CJ-2F超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；150A生化培養(yǎng)箱：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；BL310電子天平：德國塞多利斯公司；828型pH測試儀：美國Orion公司；T6紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3試驗方法

1.3.1菌體生長測定

（1）乳酸菌數(shù)的測定［16］

將菌株NZ3、NZ7和NZ9以1∶1∶1的比例、按2%（V/V）接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中，制成復(fù)合乳酸菌液。

取100 μL復(fù)合乳酸菌液加入900 μL滅菌生理鹽水中，依次做10倍稀釋，選取3個適宜的連續(xù)稀釋倍數(shù)進行平板計數(shù)，每個稀釋度做3個平行。

（2）菌體生長曲線

將復(fù)合乳酸菌液培養(yǎng)（24±2）h，每2 h取一次樣，在波長600 nm條件下測定光密度值OD600nm，以培養(yǎng)時間t為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪制復(fù)合乳酸菌的生長曲線。

1.3.2單因素試驗選取因素水平

（1）培養(yǎng)溫度對菌株生長的影響

選擇培養(yǎng)溫度33℃、35℃、37℃、39℃、41℃，調(diào)節(jié)初始pH值為6.0，將復(fù)合乳酸菌液（復(fù)配比例1∶1∶1）接種2%，分別在不同的培養(yǎng)溫度條件下培養(yǎng)16 h，測定乳酸菌數(shù)。

（2）初始pH對菌株生長的影響

將MRS液體培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，分別接種2%復(fù)合乳酸菌液，37℃培養(yǎng)16 h，測定乳酸菌數(shù)。

（3）接種量對菌株生長的影響

設(shè)定復(fù)合乳酸菌（復(fù)配比例1∶1∶1）接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%，將復(fù)合乳酸菌分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)初始pH值為7.0，37℃培養(yǎng)16 h，測定乳酸菌數(shù)。

1.3.3響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

以乳酸菌數(shù)作為響應(yīng)目標，利用響應(yīng)面方法中的Box-Behnken Design（BBD）方法設(shè)計試驗，通過試驗數(shù)據(jù)擬合得到二階響應(yīng)面模型，最終確定最優(yōu)試驗條件。用Design Expert8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1復(fù)合乳酸菌菌體生長曲線

以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD600nm值及pH值為縱坐標，繪制復(fù)合乳酸菌的生長曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1　復(fù)合乳酸菌生長曲線Fig.1 The growth curve of compound lactic acid bacteria

由圖1可知，復(fù)合乳酸菌在接種后0～4h開始緩慢生長，進入菌體生長的遲緩期，此時，隨著菌體的生長，菌液的pH開始出現(xiàn)下降，說明菌體發(fā)酵開始產(chǎn)酸；在6～10 h內(nèi)生長迅速，處于對數(shù)生長時期，同時pH下降較快，說明在此時期菌體產(chǎn)酸較多。當培養(yǎng)10～18 h，菌體生長速率保持平穩(wěn)，進入穩(wěn)定期，此時pH也趨于平穩(wěn)。培養(yǎng)時間＞18 h以后，菌體數(shù)量出現(xiàn)下降，說明菌體生長進入到了衰亡期，而pH值依然處于平穩(wěn)狀態(tài)，說明乳酸菌在生長過程中不斷產(chǎn)生乳酸，而當乳酸濃度累積到一定水平時，菌體生長就會受到制約。因此，該復(fù)合乳酸菌的最佳培養(yǎng)時間應(yīng)控制在10～18 h。

2.2單因素試驗［17-18］

2.2.1培養(yǎng)溫度對復(fù)合乳酸菌生長的影響

將復(fù)合乳酸菌接種于MRS培養(yǎng)基中，不同溫度條件下培養(yǎng)16 h，乳酸菌活菌數(shù)對數(shù)值變化結(jié)果見圖2。

圖2　培養(yǎng)溫度對復(fù)合乳酸菌生長的影響Fig.2 Effect of culture temperature on the growth of compound lactic acid bacteria

由圖2可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，乳酸菌數(shù)先升高后下降，差異顯著。在37℃培養(yǎng)時，活菌數(shù)對數(shù)值達到最大值9.18 lg（CFU·mL-1）。當培養(yǎng)溫度＜37℃時，溫度過低，酶活性受抑制，酶促反應(yīng)遲緩，導(dǎo)致菌體生長和代謝緩慢。但當溫度過高時，酶的活性又重新受到抑制，故當培養(yǎng)溫度＞37℃后，乳酸菌數(shù)出現(xiàn)降低。因此，確定該復(fù)合乳酸菌的適宜培養(yǎng)溫度為37℃。

2.2.2初始pH對復(fù)合乳酸菌生長的影響

將復(fù)合乳酸菌接種于不同初始pH值的MRS培養(yǎng)基中，37℃溫度條件下培養(yǎng)16 h，乳酸菌活菌數(shù)對數(shù)值變化結(jié)果見圖3。

圖3　初始pH對復(fù)合乳酸菌生長的影響Fig.3 Effect of initial pH on the growth of compound lactic acid bacteria

由圖3可知，活菌數(shù)隨著初始pH的升高，呈現(xiàn)先增大后減少的總體趨勢，在初始pH值為為7.0時，活菌數(shù)對數(shù)值達到最大值9.15 lg（CFU·mL-1）。初始pH值＞7.0以后，活菌數(shù)有下降趨勢。因此，確定培養(yǎng)基初始pH值為7.0。

2.2.3接種量對復(fù)合乳酸菌生長的影響

將復(fù)合乳酸菌（復(fù)配比例1∶1∶1）按不同接種量接入到MRS培養(yǎng)基中，初始pH值為7.0，37℃培養(yǎng)16 h后測定乳酸菌活菌數(shù)，結(jié)果見圖4。

圖4　接種量對復(fù)合乳酸菌生長的影響Fig.4 Effect of inoculum on the growth of compound lactic acid bacteria

由圖4可知，不同接種量培養(yǎng)后，活菌數(shù)存在較大的差異，當接種量為3%和4%時，菌體數(shù)量明顯高于其他3組，從經(jīng)濟方面考慮，選定3%為最適宜接種量。

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件［19-21］

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過Design Expert 8.0.6的Box-Behnken設(shè)計原理，對復(fù)合乳酸菌培養(yǎng)條件進行了3因素3水平試驗，所得試驗結(jié)果如表1所示。

表1　響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 Design and results of response surface experiments

以乳酸菌數(shù)對數(shù)值（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）設(shè)計的試驗結(jié)果，利用Design Expert 8.0.6軟件對表1數(shù)據(jù)進行分析，得到乳酸菌數(shù)與培養(yǎng)溫度（A）、初始pH（B）及接種量（C）的二次多項回歸方程：Y=9.55-0.41A+ 0.54B+0.20C-0.095AB+0.012AC-0.090BC-1.48A2-0.28B2-0.19C2。對回歸模型進行可信度分析和方差分析，結(jié)果如表2所示。

表2　回歸模型方差分析Table 2 Variance analysis of regression model

由表2可知，模型F=467.12，P＜0.000 1，說明該回歸方程是極顯著的。失擬項不顯著，說明該模型模擬性較好。模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9983，修正復(fù)相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.996 2，預(yù)測復(fù)相關(guān)系數(shù)R2Pred=0.9851，表明修正復(fù)相關(guān)系數(shù)0.9962與預(yù)測復(fù)相關(guān)系數(shù)0.985 1有很好的相符度，說明該模型具有較好的回歸性。模型信噪比＞4是令人滿意的，該模型的信噪比為62.485，顯示該模型具有足夠的信號來響應(yīng)該設(shè)計。因此，該模型能夠?qū)θ樗峋鷶?shù)進行分析和預(yù)測。

模型數(shù)據(jù)顯示，一次項A、B、C及二次項A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），交互項AB、BC影響顯著（P＜0.05），各因素的影響主次順序：B＞A＞C，即培養(yǎng)初始pH值＞培養(yǎng)溫度＞接種量。利用Design Expert 8.0.6軟件獲得了各因素的最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度36.34℃、初始pH值為6.93、接種量3.58%，在此條件下獲得的乳酸菌數(shù)對數(shù)值預(yù)測值為9.87。為了驗證響應(yīng)面模型的有效性，考慮到實際操作的方便性，將各因素修正為培養(yǎng)溫度37℃、初始pH值為7.0、接種量4%，在此修正條件下進行3次平行試驗，得出乳酸菌數(shù)對數(shù)值實際值為9.79。

培養(yǎng)溫度、初始pH值、接種量兩兩交互作用對乳酸菌數(shù)的影響的響應(yīng)曲面及等高線，結(jié)果如圖5所示。

圖5　培養(yǎng)溫度、初始pH值和接種量交互作用對乳酸菌數(shù)影響的響應(yīng)曲面圖及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interactions between culture time，initial pH and inoculum on the growth of compound lactic acid bacteria

由圖5可知，培養(yǎng)溫度和初始pH的交互作用較顯著，初始pH值和接種量的交互作用較弱。在一定培養(yǎng)時間下，乳酸菌數(shù)隨著培養(yǎng)溫度的上升而呈現(xiàn)上升趨勢，在37℃時達到最高值，之后隨著溫度繼續(xù)升高而呈現(xiàn)下降趨勢。在固定培養(yǎng)溫度時，隨著初始pH的增加，乳酸菌數(shù)出現(xiàn)先增加后降低的趨勢。

3　結(jié)論

利用響應(yīng)面法（RSM）中的Box-Behnken Design（BBD）設(shè)計試驗，并使用Design Expert 8.0.6軟件進行數(shù)據(jù)分析，對復(fù)合乳酸菌培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，獲得良好的效果，優(yōu)化后的二次多元回歸模型為：Y=9.55-0.41A+0.54B+0.20C-0.095AB+0.012AC-0.090BC-1.48A2-0.28B2-0.19C2，獲得了各因素的最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度37℃、初始pH值為7.0、接種量4%。在此條件下，獲得的乳酸菌數(shù)對數(shù)值為9.79。為該復(fù)合乳酸菌的后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)和菌種條件。

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Optimization of culture conditions for compound lactic acid bacteria by response surface methodology

WANG Jian，LUO Hongxia*，YU Jiahong，WANG Changgang，ZHANG Jun
（Department of Food and Bioengineering，Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing 102442，China）

The three superior lactic acid bacteria strains separate from silage were constituted as compound lactic acid bacteria.The culture conditions of compound lactic acid bacteria were optimized by response surface methodology.On the basis of single factor experiments，the significance and creditability of model and the factors were analyzed by Box-Behnken design and software Design Expert 8.0.6.The optimum culture conditions were culture temperature 37℃，initial pH 7.0 and inoculum（ratio of three strains was 1∶1∶1）4%.Under the optimum conditions，the colony count of lactic acid bacteria was 9.79.

culture conditions∶response surface methods；compound lactic acid bacteria

TS252.54

0254-5071（2016）02-0066-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.015

2015-10-02

北京市教委2015年度科技計劃以及社科計劃資助項目（KM201512448007）

王建（1975-），女，副教授，碩士，研究方向為食品微生物、食品質(zhì)量監(jiān)控。

羅紅霞（1962-），女，教授，博士，研究方向為食品微生物、食品質(zhì)量監(jiān)控。