李情敏，何名芳，張鳳英，張超鳳，陳衛(wèi)平*（.江西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，江西 南昌 330045；.贛州農(nóng)業(yè)學校 食品教研組，江西 贛州 3400）

枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵的研究

李情敏1，何名芳2，張鳳英1，張超鳳1，陳衛(wèi)平1*
（1.江西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，江西 南昌 330045；2.贛州農(nóng)業(yè)學校 食品教研組，江西 贛州 341100）

該研究選取了一株從無花果中分離出的枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）作為試驗菌株，它可以產(chǎn)生抗逆性強的芽孢，非常適合應用于益生菌飼料加工生產(chǎn)。在單因素試驗基礎上，進行L9（33）正交試驗，獲得芽孢產(chǎn)量高、原料成本低廉的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方為碎米水解液6%、酵母粉0.7%、KH2PO40.5%；對該菌的搖瓶發(fā)酵條件進行了初步研究，確定了液態(tài)發(fā)酵的最佳條件為pH值為5，溫度37℃，接種量6%，轉速200 r/min，培養(yǎng)時間19 h。在此最佳培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件下，發(fā)酵液OD600nm值可達7.38。

枯草芽孢桿菌；液態(tài)發(fā)酵；培養(yǎng)基配方；培養(yǎng)條件；優(yōu)化

益生菌的生理功能有很多，最重要的是可以促進腸道有益微生物的繁殖，降低病原菌數(shù)量，提高機體免疫的功能［1］。益生菌制劑以無毒、無殘留、無副作用、不污染環(huán)境等優(yōu)點，使其成為了有效的抗生素替代物，在防治動植物疾病，促進機體發(fā)育，延緩人類衰老等方面被人們廣泛使用［2］，并成為生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)中的一個重要紐帶。由于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）可形成抗逆性極強的芽孢，在穩(wěn)定性方面具有先天優(yōu)勢，且枯草芽孢桿菌是我國農(nóng)業(yè)部和美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）允許作為飼料添加劑的菌種［3-4］，其可以產(chǎn)生抑菌活性物質［5-6］，也可以作為一種理想的抗生素替代物。最近還有文獻報道枯草芽孢桿菌對馬鈴薯辣椒等蔬菜疫病具有很好的防治效果［7-10］。

枯草芽孢桿菌（B.subtilis）從無花果中分離獲得，具有較強抑菌特性，可以產(chǎn)蛋白酶，脂肪酶和淀粉酶，是良好的植物生防和動物飼料添加菌劑。但在益生菌制劑的實際應用中，常存在有效活菌數(shù)低、產(chǎn)品穩(wěn)的定性差、保質期短等問題，限制了其工業(yè)化生產(chǎn)和大規(guī)模應用。本研究采用農(nóng)業(yè)廢棄資源水解碎米粉、玉米粉、小麥粉為液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的材料，以枯草芽孢桿菌（B.subtilis）的生物量為評價指標，獲得了枯草芽孢桿菌（B.subtilis）最佳培養(yǎng)基配方及液態(tài)發(fā)酵工藝條件。本研究充分利用農(nóng)業(yè)廢棄物資源，制備益生菌制劑，明顯降低了成本，為益生菌制劑在植物疾病防治和畜牧業(yè)中替代抗生素、更廣泛地應用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種和原料

枯草芽孢桿菌（B.subtilis）：江西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院微生物實驗室分離及保藏。

碎米、小麥、玉米：市售加工廠下腳料。

1.1.2培養(yǎng)基

種子液培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，水，pH 5。

碳源基礎培養(yǎng)基：酵母粉0.5%，NaCl 0.5%，pH 5。

氮源基礎培養(yǎng)基：葡萄糖2%，NaCl 0.5%，pH 5。

無機鹽基礎培養(yǎng)基：酵母粉0.5%，葡萄糖2%，pH 5。

所有培養(yǎng)基均于滅菌鍋0.1 MPa、121℃滅菌15 min。

1.1.3化學試劑

食品級液化酶（105U/g）、糖化酶（2 000 U/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；氯化鈉（分析純）、葡萄糖（分析純）：西隴化工股份有限公司；蔗糖（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；蛋白胨（生化試劑）、酵母粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限公司；磷酸二氫鉀（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；BYY-200萬能高速粉碎機藥品冷藏箱：中科生命科技股份有限公司；LRH-150B生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；CWB22電子秤：上海偉業(yè)儀器廠；WFZUV-2100紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；HH-2恒溫水浴鍋：江蘇金壇市中大儀器廠；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1種子液的制備

取一環(huán)已活化好的菌種，接入盛有種子液的三角瓶中，初始pH值為5，培養(yǎng)溫度35℃，搖床轉速180 r/min，培養(yǎng)12 h。

1.3.2水解液的制備

水解糖液的制備：將玉米、小麥、碎米粉碎，各稱取100 g于燒杯中加入400 mL蒸餾水，放入100℃水浴鍋中預糊化20 min后，將其取出放置適宜的溫度后用冰乙酸、NaOH調pH。將pH調至6.5后放入60℃水浴鍋中液化20 min，并且加入0.4 g無水氯化鈣、α-淀粉酶0.05 g。20 min后將水浴鍋溫度調至100℃，在100℃水浴鍋中預煮10 min，使α-淀粉酶失活。將液化好的玉米粉、小麥粉、碎米粉冷卻后用冰乙酸調pH至4.0，加入糖化酶0.075 g在60℃水浴鍋中糖化6 h。用碘液作為指示劑滴定，若無顏色反應則糖化完全，若有則糖化不完全，繼續(xù)進行糖化，直至碘液滴定至無顏色反應。再進行滅酶，100℃水浴10 min，使糖化酶完全失活。將水解好的玉米、小麥、大米水解液用抽濾器進行抽濾，滅菌（121℃、10 min）備用。

1.3.3測定方法

菌體生物量的測定：在波長600 nm處測其吸光度值，控制OD600nm值在0.10～0.65（以未接種培養(yǎng)基稀釋）。菌體生物量以OD600nm值表示，直接以OD600nm值作為試驗的評價指標。

芽孢率檢測：簡單染色法［11］。

1.3.4培養(yǎng)基優(yōu)化

碳源基礎培養(yǎng)基分別以2%碎米水解液、玉米粉水解液、小麥粉水解液、葡萄糖、蔗糖、淀粉為碳源；氮源基礎培養(yǎng)基分別以0.5%牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、尿素、硫酸銨、亞硝酸鈉為氮源；無機鹽基礎培養(yǎng)基分別以0.5%硫酸鋅、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣為無機鹽。接種2.5 mL種子液到滅菌后各培養(yǎng)基中，置于35℃、180 r/min的搖床上培養(yǎng)16h，每個水平做3個重復，測定液態(tài)培養(yǎng)菌體生物量（OD600nm值），選出最佳碳源、氮源、無機鹽。

在以上單因素試驗基礎上，考察不同含量碎米水解液（2%、4%、6%、8%、10%）、酵母粉（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、磷酸二氫鉀（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）對菌體生物量的影響，并在單因素試驗基礎上進行L9（33）正交試驗［12］。

1.3.5培養(yǎng)條件優(yōu)化

按優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方，考察不同初始pH（4、5、6、8、10），不同的培養(yǎng)溫度（33℃、35℃、37℃、39℃、41℃），不同搖床轉速（140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min），不同培養(yǎng)時間（1 h、3 h、5 h、7 h……25 h），對枯草芽孢桿菌的生物量的影響，確定最佳培養(yǎng)條件。

2　結果與分析

2.1培養(yǎng)基配方優(yōu)化

2.1.1不同碳源對枯草芽孢桿菌生長的影響

圖1　不同碳源對枯草芽孢桿菌生長的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on the growth ofB.subtilis

由圖1可知，6種碳源對枯草芽孢桿菌生長的影響大小為碎米水解液＞葡萄糖＞玉米粉水解液＞小麥粉水解液＞蔗糖＞可溶性淀粉?？莶菅挎邨U菌是乳糖不耐受菌，且利用糖的能力為單糖＞雙糖＞三糖＞多糖［13］，所以3種糖對菌生長的影響為葡萄糖＞蔗糖＞可溶性淀粉；由結果可知，3種水解液都有比較好的效果，尤其是碎米水解液，效果最顯著，這很可能是因為它葡萄糖含量較高。因此選擇碎米水解液作為液態(tài)發(fā)酵枯草芽孢桿菌的最佳碳源。

2.1.2不同氮源對枯草芽孢桿菌生長的影響

圖2　不同氮源對枯草芽孢桿菌生長的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on the growth of B.subtilis

由圖2可知，6種氮源中，酵母粉的效果最明顯，OD600nm值達到0.51，牛肉膏與蛋白胨次之分別為0.32、0.28，尿素、硫酸銨、亞硝酸鈉的作用很小，尤其是硫酸銨。這是因為有機氮不僅有大量蛋白質，還含有糖類、脂肪等，無機氮則不能提供這些營養(yǎng)物質［14］。酵母粉可能含較多促進菌體生長的激素才使枯草芽孢桿菌生長最好，該結果與于雷等［15］的研究一致。因此選擇酵母粉作為最佳氮源。

2.1.3不同無機鹽對枯草芽孢桿菌生長的影響

圖3　不同無機鹽對枯草芽孢桿菌生長的影響Fig.3 Effect of different Inorganic salts on the growth of B.subtilis

由圖3可知，磷酸二氫鉀對菌體的生長影響最大，OD600nm值達0.42，氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂次之，硫酸鋅最小，所以選擇磷酸二氫鉀為培養(yǎng)基的主要無機鹽。而磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀影響程度不同，在于磷、鉀濃度和比例，所以一般在實際生產(chǎn)中，除了添加磷酸二氫鉀，還考慮加入其他無機鹽［16］。

2.1.4碳源、氮源與無機鹽含量的確定

由圖4A可知，所加碎米水解液添加量達6%時，OD600nm值達到0.63，碎米水解液添加量＞6%，雖然隨著添加量的增加OD600nm值也在增大，但增幅較小，雖然高濃度碎米水解液能使菌體快速生長，但不利于促進芽孢的形成［17-18］，結合經(jīng)濟性考慮，所加碎米水解液添加量選擇6%為宜。由圖4B及圖4C可知，隨著氮源、無機鹽添加量的增加，OD600nm值呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，酵母粉、磷酸二氫鉀添加量分別在0.5%、0.4%時菌液OD600nm值達到最大值，分別為0.45和0.51，隨后OD600nm值均減小，說明酵母粉、磷酸二氫鉀添加量過大還會抑制菌體的生長，因此分別選擇酵母粉添加量為0.5%、磷酸二氫鉀添加量為0.4%。

圖4　 碎米水解液（A），酵母粉（B）及磷酸二氫鉀（C）含量對枯草芽孢桿菌生長的影響Fig.4 Effect of different contents of broken rice hydrolysis liquid（A），yeast powder（B）and KH2PO4（C）on the growth ofB.subtilis

2.1.5培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗

為了確定培養(yǎng)基的最優(yōu)配方，在單因素試驗基礎上，采用正交試驗考察碎米水解液、酵母粉及磷酸二氫鉀添加量對枯草芽孢桿菌生物量的影響，正交試驗結果與分析見表1，方差分析結果見表2。

表1　培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for culture medium formula optimization

對表1進行極差分析可知，RB＞RC＞RA。由此初步判定3個因素對試驗結果影響最大的是B，A、C兩因素對試驗的影響作用并不明顯，經(jīng)極差分析初步得出最佳培養(yǎng)基配方組合為A3B3C3，即碎米水解液6%，酵母粉0.7%，磷酸二氫鉀0.5%。在此最佳培養(yǎng)基條件下，OD600nm值達7.18。

表2　正交試驗結果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，B因素（酵母粉添加量）對試驗結果的影響差異極顯著（P＜0.01），而A、C對結果的影響均不顯著。

2.2發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1初始pH的優(yōu)化

圖5　不同初始pH對枯草芽孢桿菌發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of different initial pH on the growth of B.subtilis

由圖5可知，在pH自然（初始pH值為5）時，OD600nm值達最大，為0.71；隨著初始pH增大，OD600nm值越小。因為在過酸和過堿條件下，都不利于菌體生長和芽孢形成［19］。因此，選擇初始pH值為5。

2.2.2搖床溫度的優(yōu)化

圖6　不同溫度對枯草芽孢桿菌發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of different temperature on the growth ofB.subtilis

由圖6可知，隨著溫度的增加，OD600nm值也隨著升高。但在溫度達到37℃時，OD600nm值達到最高。隨著溫度＞37℃之后，其OD600nm值反而下降。溫度主要是通過改變酶的反應速率來影響菌體的生長［20］。隨著培養(yǎng)環(huán)境溫度升高，菌體內酶活性增強、反應速率也增大，因此可以促進其生長代謝，縮短生長期。但酶很多屬于蛋白質類，過熱會使其失活，菌體就容易衰老。因此，選擇最適溫度為37℃。

2.2.3接種量的選擇

初始pH值為5，搖床溫度為37℃，搖床轉速為180 r/min，培養(yǎng)時間16 h，分別測定6個不同接種量（3%、4%、5%、6%、7%、8%）發(fā)酵液的OD600nm值，考察不同接種量對枯草芽孢桿菌發(fā)酵生長的影響，結果見圖7。

圖7　不同接種量對枯草芽孢桿菌發(fā)酵的影響Fig.7 Effect of different inoculum on the growth ofB.subtilis

由圖7可知，隨著接種量的增加，其OD600nm值也隨之升高，6%的接種量時OD600nm值達到0.72，接種量＞6%之后，隨著接種量的增加其OD600nm值趨于平穩(wěn)。因此選擇最適接種量為6%。

2.2.4搖床轉速的優(yōu)化

枯草芽孢桿菌是需氧型菌，主要是通過改變轉速可以調節(jié)通氣量從而改變三角瓶內含氧量，而含氧量又直接影響菌體生長及芽孢的形成［21］。

圖8　不同轉速對枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的影響Fig.8 Effect of different rotate speed on the growth of B.subtilis

由圖8可知，隨著轉速的增加，其OD600nm值隨著升高。在轉速為200 r/min時其OD600nm值為最大。超過200 r/min，其OD600nm值反而出現(xiàn)下降趨勢。因此，選擇200 r/min轉速作為枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵的最佳轉速。

2.2.5枯草芽孢桿菌培養(yǎng)時間的選擇

圖9　枯草芽孢桿菌生長曲線Fig.9 The growth curve ofB.subtilis

由圖9可知，在1～7 h枯草芽孢桿菌處于延滯期；在7～13 h，菌體數(shù)目急劇增加，OD600nm值也急劇增大，處于對數(shù)期；在15～19 h菌體處于穩(wěn)定期，而在19 h時OD600nm值達到最大，因此菌體數(shù)也最大，此階段為菌體獲取最佳時間；19 h后，菌體數(shù)量減少，菌體進入衰亡期，OD600nm值隨之減少。由芽孢率曲線可知，菌株芽孢的形成主要是在穩(wěn)定期。因此，枯草芽孢桿菌最佳培養(yǎng)時間為19 h，在此條件下，發(fā)酵液OD600nm值為7.38。

3　結論

優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為碎米水解液6%、酵母粉0.7%、磷酸二氫鉀0.5%，發(fā)酵液OD600nm值可達到7.18；并通過單因素試驗法確定了培養(yǎng)基的最佳培養(yǎng)條件：初始pH值為5、培養(yǎng)溫度37℃、接種量6%、培養(yǎng)轉速200 r/min，培養(yǎng)時間19 h后收獲菌液，在此最佳條件下OD600nm值達到7.38。

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Liquid-state fermentation of Bacillus subtilis

LI Qingmin1，HE Mingfang2，ZHANG Fengying1，ZHANG Chaofeng1，CHEN Weiping1*
（1.College of Food Science and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China；2.Food Teaching and Research Group，Ganzhou Agricultural College，Ganzhou 341100，China）

UsingBacillus subtilisseparated fromFicus caricaas experimental strain，the strain can generate strong-resistance spores，which was suitable for processing production of probiotics feed.On the basis of single factor experiments，the optimum formula of liquid fermentation medium of high spore yield and cheap material cost was obtained by L9（33）orthogonal tests.The optimum formula were broken rice hydrolysis liquid 6%，yeast powder 0.7%and KH2PO40.5%.The shaking flask fermentation conditions of the strain was studied preliminarily，and the optimum conditions of liquid fermentation were determined as follows∶pH 5，temperature 37℃，inoculum 6%，rotate speed 200 r/min，culture time 19 h.Under the optimum culture medium formula and fermentation conditions，the OD600nmof fermentation liquor could reach to 7.38.

Bacillus subtilis；liquid fermentation；medium formula；culture condition；optimization

TQ920.6

0254-5071（2016）02-0043-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.010

2015-12-14

江西省科技支撐重點計劃項目（2009BNA09400）

李情敏（1991-），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物。

陳衛(wèi)平（1956-），男，教授，本科，研究方向為食品微生物。