黃達(dá)明，孔　苗，霍書豪*，錢靜亞，徐　玲，杜卓蓉，周衛(wèi)征，崔鳳杰，鄒　彬（.江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 03；.中國(guó)科學(xué)院可再生能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院廣州能源研究所，廣東 廣州 50640）

小球藻Chlorellasp.的小分子有機(jī)酸/醇培養(yǎng)研究

黃達(dá)明1，孔苗1，霍書豪1*，錢靜亞1，徐玲1，杜卓蓉1，周衛(wèi)征2，崔鳳杰1，鄒彬1
（1.江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.中國(guó)科學(xué)院可再生能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院廣州能源研究所，廣東 廣州 510640）

該研究選擇一株對(duì)水解酸化液耐受性強(qiáng)、高產(chǎn)油脂的優(yōu)良藻株Chlorellasp.作為出發(fā)藻株，向BG11培養(yǎng)基中分別添加不同質(zhì)量濃度小分子有機(jī)酸/醇（乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和乙醇）進(jìn)行小球藻純培養(yǎng)試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，混合乙酸、丙酸、丁酸和乙醇4種小分子有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行響應(yīng)面的試驗(yàn)，考察混合小分子有機(jī)酸對(duì)小球藻Chlorellasp.生長(zhǎng)影響，研究表明，當(dāng)乙酸、丙酸、丁酸和乙醇的質(zhì)量濃度分別為1.02 g/L、0.42 g/L、0.40 g/L和0.18 g/L時(shí)，小球藻的單位體積細(xì)胞數(shù)含量最高，生長(zhǎng)狀態(tài)最好，能獲得較高的生物量（1.18×108CFU/mL）。

小分子有機(jī)酸/醇；小球藻；生物量

小球藻因?yàn)槠錁O高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值通常被作為一種優(yōu)質(zhì)的綠色營(yíng)養(yǎng)食品。其主要營(yíng)養(yǎng)成分甚至優(yōu)于部分日常主要食品，具有高蛋白、低脂肪、低糖、礦物質(zhì)元素含量豐富的優(yōu)點(diǎn)，并且具有某些特殊醫(yī)療保健功能［1］。但目前來看，小球藻的培養(yǎng)成本很高。

某些較高懸浮固體的有機(jī)廢水（如釀造廢水），通過水解酸化處理，廢水生物降解性能可以得到改善，懸浮物得到有效去除后，可以用作一些小球藻的培養(yǎng)基質(zhì)［2-5］。李硼飛等［6］通過分析測(cè)試得知，小球藻很容易利用小分子有機(jī)酸，包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸。LIU C H等［7］利用與水解酸化液成分相近的丁酸梭菌發(fā)酵上清液培養(yǎng)普通小球藻Chlorella vulgarisESP6，發(fā)現(xiàn)該小球藻可以在4倍稀釋的發(fā)酵上清液中生長(zhǎng)，其中，乙酸可以被小球藻高效利用。WEN Q等［8］利用剩余污泥厭氧水解酸化液流出物進(jìn)行蛋白核小球藻Chlorella protothecoides培養(yǎng)，證實(shí)小球藻可以利用乙酸，丁酸和少量的丙酸作為碳源生長(zhǎng)。

本試驗(yàn)選擇一株對(duì)水解酸化液耐受性強(qiáng)、高產(chǎn)油脂的優(yōu)良藻株Chlorellasp.作為出發(fā)藻株，首先向小球藻培養(yǎng)基BG11中分別添加不同濃度小分子有機(jī)酸（如乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和乙醇）進(jìn)行小球藻純培養(yǎng)［4-5］。然后在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上混合乙酸、丙酸、丁酸和乙醇4種物質(zhì)進(jìn)行響應(yīng)面的設(shè)計(jì)，考察混合小分子有機(jī)酸/醇對(duì)小球藻生長(zhǎng)影響。本研究的目的是提高小球藻生物量，為獲得較高濃度的微藻生物質(zhì)提供科學(xué)參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

小球藻Chlorellasp.：江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏；乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、乙醇、異戊酸、異丁酸等（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

BG11培養(yǎng)基：NaNO31.5g/L，K2HPO40.4g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，CaCl2·7H2O0.36g/L，Na2CO30.2g/L，檸檬酸0.06 g/L，檸檬酸鐵0.06g/L，Na2EDTA·H2O0.01g/L，蒸餾水1000mL，微量元素溶液A5 1 mL/L。

微量元素溶液A5：H3BO42.86g/L，MnCl2·4H2O1.86 g/L，ZnSO4·7H2O0.22g/L，Na2MoO4·2H2O0.021g/L，CuSO4·5H2O 0.08 g/L，Co（NO3）2·6H2O 0.05 g/L。

1.2儀器與設(shè)備

XB-K-25血球計(jì)數(shù)板：上海求精生化儀器有限公司；PH-3C型便攜式PH計(jì)：上海三信儀表廠；H-1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；ZC-2102GZ光照恒溫?fù)u床：常州中誠(chéng)儀器制造有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1小球藻Chlorellasp.的培養(yǎng)

小球藻Chlorellasp.采用BG11培養(yǎng)基在光照搖床內(nèi)進(jìn)行無菌培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度（25±1）℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，光照強(qiáng)度為（50±10）μmol/（m2·s）。選取對(duì)數(shù)期的藻種接種，接種量10%。在BG11培養(yǎng)基中分別添加一定濃度梯度的乙醇、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸，并調(diào)節(jié)最終pH值為7.0［9］?？疾煜駼G11培養(yǎng)基中添加不同劑量的小分子有機(jī)酸對(duì)小球藻Chlorellasp.生物量的影響。

1.3.2藻細(xì)胞計(jì)數(shù)［10-11］

藻細(xì)胞計(jì)數(shù)利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.3小分子有機(jī)酸/醇小球藻純培養(yǎng)單因素試驗(yàn)

配制新鮮的BG11培養(yǎng)基，并按照釀醋廢水水解酸化液的特點(diǎn)向其中分別加入一定量的乙酸、乙醇、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸，使乙酸的質(zhì)量濃度梯度為0、0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.2 g/L；使丙酸的質(zhì)量濃度梯度為0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L；使丁酸的質(zhì)量濃度梯度為0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L；使異丁酸的質(zhì)量濃度梯度為0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L；使戊酸的質(zhì)量濃度梯度為0、0.10 g/L、0.15 g/L、0.20 g/L、0.25 g/L、0.30 g/L；使異戊酸的質(zhì)量濃度梯度為0、0.10 g/L、0.15 g/L、0.20 g/L、0.25 g/L、0.3 g/L；使乙醇的質(zhì)量濃度梯度為0、0.05g/L、0.10g/L、0.15g/L、0.20g/L、0.25 g/L，將pH調(diào)節(jié)為7.0，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20 min后，冷卻置于超凈臺(tái)內(nèi)，將處于對(duì)數(shù)期的藻液轉(zhuǎn)接至搖瓶?jī)?nèi)，接種量為10%，充分搖勻后置于恒溫光照搖床內(nèi)進(jìn)行無菌培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度25℃，光照強(qiáng)度為（50±10）μmol/（m2·s）。

1.3.4響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化小球藻純培養(yǎng)條件［12］

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙酸（A）、丙酸（B）、丁酸（C）和乙醇（D）為影響因素，小球藻的細(xì)胞數(shù)（Y）為響應(yīng)值，利用Design-Expert 7.0軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，各因素與水平的設(shè)計(jì)如表1所示［8-9］。

表1　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平Table 1 Factors and levels for Box-Behnken experiments design g/L

2　結(jié)果與分析

2.1不同乙酸含量條件下小球藻Chlorellasp.的生長(zhǎng)情況

圖1　乙酸含量對(duì)小球藻Chlorellasp.生物量的影響Fig.1 Effect of acetic acid concentration onChlorellasp.biomass

由圖1可知，添加不同量的乙酸對(duì)小球藻Chlorellasp.生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，當(dāng)乙酸質(zhì)量濃度為1.0 g/L時(shí)，小球藻培養(yǎng)至第7天時(shí)的生物量為最大，能達(dá)到9.4×107CFU/mL。乙酸是小球藻生長(zhǎng)中的碳源，小球藻可以利用乙酸進(jìn)行混養(yǎng)生長(zhǎng)。研究表明，產(chǎn)酸廢水提供的碳源主要是厭氧產(chǎn)酸反應(yīng)器產(chǎn)生的乙酸以及其他小分子有機(jī)酸，小球藻在生長(zhǎng)過程中能很好的利用水解液中的小分子有機(jī)酸［13-14］。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中乙酸含量為0.8～1.2 g/L為宜。

2.2不同丙酸含量條件下小球藻Chlorellasp.的生長(zhǎng)情況

圖2　丙酸含量對(duì)小球藻Chlorella sp.生物量的影響Fig.2 Effect of propionic acid concentration onChlorella sp.biomass

由圖2可知，丙酸可以作為小球藻生長(zhǎng)的碳源，添加丙酸有利于小球藻的生長(zhǎng)。當(dāng)丙酸質(zhì)量濃度為0.4 g/L時(shí)，小球藻培養(yǎng)至第7天時(shí)的細(xì)胞數(shù)為最大，能達(dá)到7.5×107CFU/mL。研究表明，產(chǎn)酸廢水提供的碳源主要是厭氧產(chǎn)酸反應(yīng)器產(chǎn)生的丙酸等其他小分子的有機(jī)酸和乙醇，小球藻在生長(zhǎng)過程中能很好的利用水解液中的小分子有機(jī)酸［13-14］。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中丙酸含量為0.3～0.5 g/L為宜。

2.3不同丁酸含量條件下小球藻Chlorellasp.的生長(zhǎng)情況

圖3　丁酸含量對(duì)小球藻Chlorellasp.生物量的影響Fig.3 Effect of butyric acid concentration onChlorella sp.biomass

由圖3可知，丁酸可以作為小球藻生長(zhǎng)的碳源，添加丁酸有利于小球藻的生長(zhǎng)。當(dāng)丁酸質(zhì)量濃度為0.4g/L時(shí)，小球藻培養(yǎng)至第7天時(shí)的細(xì)胞數(shù)為最大，能達(dá)到7.5×107CFU/mL。研究表明，產(chǎn)酸廢水提供的碳源主要是厭氧產(chǎn)酸反應(yīng)器產(chǎn)生的丁酸等其他小分子的有機(jī)酸和乙醇，球藻在生長(zhǎng)過程中能很好的利用水解液中的丁酸［13-14］。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中丁酸含量為0.3～0.5 g/L為宜。

2.4不同戊酸含量條件下小球藻Chlorellasp.的生長(zhǎng)情況

圖4　戊酸含量對(duì)小球藻Chlorellasp.生物量的影響Fig.4 Effect of valeric acid concentration onChlorellasp.biomass

由圖4可知，戊酸也可以作為小球藻生長(zhǎng)的碳源，添加戊酸有利于小球藻的生長(zhǎng)。當(dāng)戊酸質(zhì)量濃度為0.25 g/L時(shí)，小球藻培養(yǎng)至第7天時(shí)的細(xì)胞數(shù)為最大，能達(dá)到5.7× 107CFU/mL。研究表明，產(chǎn)酸廢水提供的碳源主要是厭氧產(chǎn)酸反應(yīng)器產(chǎn)生的戊酸等其他小分子的有機(jī)酸和乙醇，小球藻在生長(zhǎng)過程中能利用水解液中的戊酸［13-14］。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中戊酸含量為0.15～0.25 g/L為宜。

2.5不同乙醇含量條件下小球藻Chlorellasp.的生長(zhǎng)情況

圖5　乙醇含量對(duì)小球藻Chlorellasp.生物量的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration onChlorellasp.biomass

由圖5可知，乙醇可以作為小球藻生長(zhǎng)的碳源，添加適量的乙醇有利于小球藻的生長(zhǎng)。當(dāng)乙醇質(zhì)量濃度為0.15 g/L時(shí)，小球藻培養(yǎng)至第7天時(shí)的細(xì)胞數(shù)為最大，能達(dá)到6.3× 107CFU/mL。研究表明，產(chǎn)酸廢水提供的碳源主要是厭氧產(chǎn)酸反應(yīng)器產(chǎn)生的乙醇和小分子的有機(jī)酸，小球藻在生長(zhǎng)過程中能很好的利用水解液中的乙醇［13-14］。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中乙醇含量為0.10～0.20 g/L為宜。

2.6不同異丁酸含量條件下小球藻Chlorellasp.的生長(zhǎng)情況

圖6　異丁酸含量對(duì)小球藻Chlorellasp.生物量的影響Fig.6 Effect of isobutyric acid concentration onChlorellasp.biomass

由圖6可知，異丁酸也可以作為小球藻生長(zhǎng)的碳源，添加適量的異丁酸也有利于小球藻的生長(zhǎng)。當(dāng)異丁酸的質(zhì)量濃度為0.15g/L時(shí)，小球藻培養(yǎng)至第7天時(shí)的細(xì)胞數(shù)為最大，能達(dá)到5.1×107個(gè)/mL。研究表明產(chǎn)酸廢水提供的碳源主要是厭氧產(chǎn)酸反應(yīng)器產(chǎn)生的異丁酸和其他小分子有機(jī)酸和乙醇，小球藻在生長(zhǎng)過程中能很好的利用水解液中的異丁酸［13-14］。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中異丁酸含量為0.3～0.5 g/L為宜。

2.7不同異戊酸含量條件下小球藻Chlorellasp.的生長(zhǎng)情況

由圖7可以看出，異戊酸可以作為小球藻生長(zhǎng)的碳源，添加適量的異戊酸有利于小球藻的生長(zhǎng)。當(dāng)異戊酸的濃度為0.2 g/L時(shí)，小球藻培養(yǎng)至第7天時(shí)的細(xì)胞數(shù)為最大，能達(dá)到4.6×107個(gè)/mL。研究表明，產(chǎn)酸廢水提供的碳源主要是厭氧產(chǎn)酸反應(yīng)器產(chǎn)生的異戊酸和其他小分子有機(jī)酸和乙醇，小球藻在生長(zhǎng)過程中能利用水解液中的異戊酸［13-14］。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中異戊酸含量為0.15～0.25 g/L為宜。

圖7　異戊酸含量對(duì)小球藻Chlorellasp.生物量的影響Fig.7 Effect of isovaleric acid concentration onChlorellasp.biomass

2.8混合酸小球藻Chlorellasp.的生長(zhǎng)優(yōu)化

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可以看出，小球藻Chlorellasp.在添加乙酸、丙酸、丁酸和乙醇的培養(yǎng)基中，生物量較高，對(duì)小球藻的生長(zhǎng)起到明顯的促進(jìn)作用，藻體的長(zhǎng)勢(shì)比較好，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙酸（A）、丙酸（B）、丁酸（C）和乙醇（D）質(zhì)量濃度為自變量，小球藻的生物量（Y）為響應(yīng)值，對(duì)其進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，確定適合小球藻生長(zhǎng)的最佳有機(jī)酸組合［15］。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

使用Design-Expert 7.0軟件數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到了各因素與小球藻細(xì)胞數(shù)的回歸方程：

使用Design-Expert 7.0軟件對(duì)表2中29組試驗(yàn)進(jìn)行分析回歸擬合后得到擬合全變量二次回歸方程的方差分析及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3　二次回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 variance analysis of response surface quadratic model

由表3可知，回歸模型極顯著（P＜0.01），回歸模型的決定系數(shù)R2=0.990 5，說明此模型與數(shù)據(jù)的擬合度較高。從回歸模型的顯著性可以看出，一次項(xiàng)中A、B、C對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），二次項(xiàng)中A2、B2、C2、D2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)中AB、AC、BD對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。失擬項(xiàng)P=0.090 6＞0.05，說明模型擬合度很好，能夠用回歸方程模擬小分子有機(jī)酸對(duì)小球藻生物量的影響。

2.9確定最佳有機(jī)酸濃度組合

根據(jù)Design-Expert 7.0軟件，繪制出小球藻生物量隨自變量變化的響應(yīng)面和等高線，結(jié)果見圖8。

圖8　丁酸、丙酸、乙酸和乙醇交互作用對(duì)小球藻生物量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.8 Response surfaces plots and contour line of effect of interaction between butyric acid，propionic acid，acetic acid and ethanol onChlorellasp.biomass

由圖8可知，乙酸、丙酸、丁酸和乙醇兩因素之間的交互作用較強(qiáng)，對(duì)藻的生長(zhǎng)能起到明顯的促進(jìn)作用。根據(jù)等高線圖和響應(yīng)面立體分析圖可以得到最佳優(yōu)化條件：乙酸1.02 g/L、丙酸0.42 g/L、丁酸0.4 g/L、乙醇0.18 g/L，預(yù)測(cè)響應(yīng)值為10.8×107CFU/mL。在此最優(yōu)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得小球藻生物量為為11.8×107個(gè)/mL，與預(yù)測(cè)值基本一致。

3　結(jié)論

以小球藻細(xì)胞數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)做單因素試驗(yàn)，可以得出乙酸、丙酸、丁酸和乙醇對(duì)小球藻生長(zhǎng)的促進(jìn)作用較為明顯，在適宜的有機(jī)酸/醇濃度下，小球藻的單位體積細(xì)胞數(shù)在培養(yǎng)至7 d時(shí)分別能達(dá)到9.4×107個(gè)/mL、7.5×107個(gè)/mL、7.5×107個(gè)/mL、6.3×107個(gè)/mL。為進(jìn)一步提高小球藻的生物量，以乙酸、丙酸、丁酸和乙醇四個(gè)關(guān)鍵因素為自變量，以小球藻的細(xì)胞數(shù)為響應(yīng)值進(jìn)行藻體培養(yǎng)條件的優(yōu)化，得到了小球藻的Chlorellasp.最優(yōu)發(fā)酵條件：乙酸1.02 g/L、丙酸0.42 g/L、丁酸0.4 g/L、乙醇0.18 g/L，預(yù)測(cè)響應(yīng)值為10.8×107CFU/mL。按照此最優(yōu)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，測(cè)得小球藻的Chlorellasp.的細(xì)胞數(shù)11.8×107CFU/mL，較優(yōu)化前的細(xì)胞數(shù)明顯提高，為獲得較高濃度的微藻生物質(zhì)提供科學(xué)參考。

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Study on the cultivation of Chlorella sp. using small molecular organic acid/alcohol

HUANG Daming1，KONG Miao1，HUO Shuhao1*，QIAN Jingya1，XU Ling1，DU Zhuorong1，ZHOU Weizheng2，CUI Fengjie1，ZOU Bin1
（1.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；2.Guangzhou Institute of Energy Conversion，Key Laboratory of Renewable Energy，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510640，China）

Chlorellasp.pure culture experiments was carried out by using the strain with tolerance properties on hydrolysis-acidification liquid and high lipid yield and adding different concentration of small molecule organic acid/alcohol（acetic acid，propionic acid，butyric acid，isobutyric acid，valeric acid，isovaleric acid and ethanol）into BG11 medium.On the basis of single factor experiments，the effect of mixed small molecule organic acids/alcohol（acetic acid，propionic acid，butyric acid and ethanol）on growth ofChlorellasp.was investigated by response surface experiments.The research indicated that when the concentration of acetic acid，propionic acid，butyric acid and ethanol were 1.02 g/L，0.42 g/L，0.40 g/L and 0.18 g/L，respectively，Chlorellasp.had a highest cell number，optimum growth situation and higher biomass（1.18×108CFU/ml）.

small molecular organic acid/alcohol；Chlorellasp.；biomass

S968，Q949.2

0254-5071（2016）02-0029-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.007

2015-11-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21506084）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20140540）；中國(guó)博士后科學(xué)基金（2014M551519；2015T80502）；中國(guó)科學(xué)院可再生能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（y507k11001）

黃達(dá)明（1962-），教授，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品生物轉(zhuǎn)化與綜合利用研究工作。

霍書豪（1983-），講師，博士，主要從事廢棄物生物轉(zhuǎn)化與生物加工技術(shù)研究工作。