曹蕾，楊紅梅，單麗芳，宋英

HPLC法同時(shí)測(cè)定金水滌痰口服液中橙皮苷和淫羊藿苷

曹蕾1，楊紅梅1，單麗芳1，宋英2

目的：建立金水滌痰口服液中橙皮苷和淫羊藿苷含量測(cè)定的方法。方法：色譜條件為Boston pHlex ODS -C18（4.6×250 mm，5 μm），色譜柱；流動(dòng)相為0.1％磷酸（A）-乙腈（B）（0 min，A=77％；11 min，A=77％；13 min，A=70％；30 min，A=70％；32 min，A=77％）進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長283 nm；流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量10∶l；柱溫30℃。結(jié)果：橙皮苷、淫羊藿苷分別在0.58～2.9μg，r=0.9999；0.4～2.0μg，r=0.9999范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為99.48％（RSD值為2.71），99.58％（RSD值為2.45％）。結(jié)論：建立的測(cè)定方法，精密度高、重復(fù)性好，大大簡化測(cè)定的操作，可用于金水滌痰口服液的質(zhì)量控制，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立奠定了基礎(chǔ)。

金水滌痰口服液 ；橙皮苷；淫羊藿苷；方法學(xué)考察；梯度洗脫

金水滌痰口服液是在金水六金煎［1］的基礎(chǔ)上加味所成，是成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科治療小兒脾腎虛寒，痰濕內(nèi)蘊(yùn)之久咳的常用方劑。主治脾肺虛寒，腎氣不足，水泛為痰，或虛、或外感、或咳嗽等癥。方中陳皮、法半夏確有鎮(zhèn)咳祛痰的作用；當(dāng)歸、熟地均可抗炎、提高機(jī)體免疫功能，當(dāng)歸尚有抗過敏、解痙、活血祛瘀、改善局部微循環(huán)的作用［2］。淫羊藿補(bǔ)腎助陽，祛風(fēng)濕，具有鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰、抗炎、鎮(zhèn)靜、促進(jìn)機(jī)體免疫功能的作用［3～6］，因此，有利于呼吸道炎癥的修復(fù)和改善癥狀，從而收到較好的臨床療效。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1儀器

HP-1100高效液相色譜儀（美國惠普公司）；HP1100型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）四元泵；DAD檢測(cè)器；HP化學(xué)工作站；色譜柱：Boston pHlex ODS-C18，4.6 mm×250 mm，5μm；BP211D電子分析天平（德國賽多利斯公司）；超聲清洗器（AS10200，天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2材料

所用藥材均購自四川新荷花中藥飲片股份有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥鑒教研室嚴(yán)鑄云教授鑒定，均符合《中國藥典》2010版一部標(biāo)準(zhǔn)；橙皮苷對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110721-201115）；淫羊藿苷對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110737-200415）。乙腈為色譜純；水為超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）；其他試劑均為分析純；金水滌痰口服液為成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院本課題所研制（批號(hào)分別為：20150311、20150314、20150317）。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件［7～9］

色譜柱：Boston pHlex ODS-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；進(jìn)樣量5 μL；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長：283 nm；柱溫：30℃。理論塔板數(shù)按橙皮苷計(jì)算應(yīng)不低于2000，按淫羊藿計(jì)不低于1500。流動(dòng)相：0.2％冰醋酸溶液為流動(dòng)相A；乙腈為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1　梯度洗脫

2.2溶液的制備

對(duì)照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷對(duì)照品10.07 mg，淫羊藿苷對(duì)照品14.52 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度。制成含橙皮苷0.4028 mg·mL-1，含淫羊藿苷0.5808 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備 吸取成品溶液5 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻。用0.45 μm 微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.3專屬性考察

按照2.1項(xiàng)下的色譜條件，精密吸取橙皮苷、淫羊藿苷混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性溶液各10 μl進(jìn)樣分析，記錄HPLC圖，見圖1。橙皮苷、淫羊藿苷與其各自相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，并且各組分互不干擾，陰性對(duì)照在相應(yīng)位置上未見色譜峰，本方法專屬性良好。

2.4線性關(guān)系考察

精密吸取2.2項(xiàng)下橙皮苷、淫羊藿苷混合對(duì)照品溶液2、4、6、8、10 mL分別注入10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，分別吸取5 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定橙皮苷和淫羊藿苷峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得淫羊藿苷的回歸方程Y1=1801.6X-14.440，r=0.9999，結(jié)果表明，進(jìn)樣量在0.58～2.9 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，計(jì)算得橙皮苷的回歸方程Y2=7481.5X-66.080 r=0.9999，結(jié)果表明，進(jìn)樣量在0.4～2.0 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖1　橙皮苷和淫羊藿苷HPLC圖

2.5精密度試驗(yàn)

精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄色譜圖，測(cè)定每次進(jìn)樣的峰面積。結(jié)果橙皮苷的RSD值為1.62％，淫羊藿苷的RSD值為2.87％，表明精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批，金水滌痰口服液（批號(hào)：20150311）5 mL， 共6份，按供試品溶液的制備方法制備，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果樣品中橙皮苷的平均含量為1.935 mg·mL-1，其含量的RSD值為1.76％，淫羊藿苷的平均含量為1.516 mg·mL-1，其含量的RSD值為2.70％。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

按2.2項(xiàng)下方法制備供試溶液（批號(hào)：20150311），取同一樣品溶液，分別于第0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，橙皮苷、淫羊藿苷的RSD值分別為1.71％和2.13％，結(jié)果表明本品在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)：20150311，橙皮苷含量為1.935 mg·mL-1，淫羊藿苷含量為1.516 mg·mL-1）1mL，共6份分別于6個(gè)25 mL容量瓶中，精密加入橙皮苷和淫羊藿苷混合對(duì)照品溶液（濃度分別為0.4028 mg·mL-1，0.5808 mg·mL-1）3 mL，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2　橙皮苷及淫羊藿苷加樣回收率試驗(yàn)

2.9樣品的測(cè)定

取3批金水滌痰口服液樣品，每批3份，精密吸取樣品5 mL，按供試品溶液的制備方法制備。分別精密吸取混合對(duì)照品溶液和樣品溶液各10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定，計(jì)算三批樣品中橙皮苷平均濃度為1.987 mg·mL-1，RSD為0.57％；淫羊藿苷平均濃度為1.535 mg·mL-1，RSD為1.50％，表明本方法重現(xiàn)性良好。

3 討論

方中，熟地黃為君藥，但是由于毛蕊花糖苷的含量特別低，而且在專屬性考察中陰性有干擾。而方中陳皮所含橙皮苷，經(jīng)離體和在體實(shí)驗(yàn)表明，具有較強(qiáng)的抗炎活性，并且具有一定的抗病毒、抗菌等作用［10］，淫羊藿味辛甘，性溫，歸肝、腎、肺經(jīng)，有補(bǔ)腎助陽、祛風(fēng)除濕之功效。李煉［11］在臨床中運(yùn)用以淫羊藿為主治療久咳虛喘28例，曾麗絢［12］用淫羊藿苷抑制大鼠慢性阻塞性肺疾病模型炎癥。而且橙皮苷和淫羊藿苷都為黃酮苷類成分，這也正是二者能同時(shí)測(cè)定的根本原因。文中建立的方法，一測(cè)多評(píng)，大大的方便了實(shí)驗(yàn)的操作。而這種方法，經(jīng)過方法學(xué)考察精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性都是合格的，為金水滌痰口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考依據(jù)。

［1］ 劉順香，肖逢燕，易錦錦.金水六君煎治療小兒痰濕型久咳20例報(bào)告［J］.中國健康月刊，2011，30（06）：744.

［2］ 倪竹南，呂圭源，樓招歡，等.當(dāng)歸揮發(fā)油化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，14（7）：93-95.

［3］ 李煉，代建中.淫羊霍善治久咳虛喘［J］.中醫(yī)雜志，2000，41（1）：12. ［4］ 夏奇卉.重用淫羊藿治療慢性支氣管炎［J］.中醫(yī)研究，2003，1：65.

［5］ 宋根偉，汪選斌，姚霜，等.高效液相色譜法測(cè)定黃龍止咳顆粒中淫羊藿苷含量［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，20（31）：3991-3992.

［6］ 喻清和，邱志楠.補(bǔ)腎化痰法在難治性呼吸系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用［J］.光明中醫(yī)，2008，23（12）：1893-1895.

［7］ 易廷平.高效液相色譜法測(cè)定腎舒康膠囊淫羊藿苷含量［J］.實(shí)用中醫(yī)藥雜志，2012，28（6）：514-515.

［8］ 喻錄容，何先元.高效液相色譜法測(cè)定補(bǔ)腎益壽膠囊中的淫羊藿苷［J］.光譜實(shí)驗(yàn)室，2013，30（3）：1071-1074.

［9］ 李順濃.延年樂口服液中淫羊藿苷的鑒別和含量測(cè)定［J］.天津藥學(xué)，2008，20（3）：19-21.

［10］ 何娟，歐陽吉德，方艷琳，等.高效液相色譜法測(cè)定化痰止咳糖漿中橙皮苷的含量［J］.湖南中醫(yī)雜志，20111，27（3）：139-140.

［11］ 李煉，代建中.淫羊藿善治久咳虛喘［J］.中醫(yī)雜志，2000，41（1）：12.

［12］ 曾麗絢.淫羊藿苷抑制大鼠慢性阻塞性肺疾病炎癥的實(shí)驗(yàn)研究［D］.上海：復(fù)旦大學(xué)，2010.

（責(zé)任編輯：傅舒）

Simultaneous determination of hesperidin and icariin in Jinshui Ditan Liquid by HPLC/

CAO Lei1，YANG Hong-mei1，SHAN Li-fang1，SONG Ying2//（1.School of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137，Sichuan； 2.Teaching Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610075， Sichuan）

Objective: To establish HPLC method for determining hesperidin and icariin in Jinshui Ditan Liquid. Method: Boston pHlex ODS-C18column （4.6×250 mm， 5 μm） was used in HPLC determination. Mobile phase was 0.1％ phosphate （A）-acetonitrile （B） with gradient elution program （0 min，A=77％；11 min， A=77％；13 min，A=70％；30 min，A=70％；32 min，A=77％）. Detection wavelength was set at 283 nm with flow rate of 1.0 mL min-1， injection volume was 10 μL， and column temperature was 30 ℃. Result: Linear ranges of hesperidin and icariin were 0.58～2.9 μg （r=0.9999） and 0.4～2.0 μg （r=0.9999），respectively. The average recoveries of them were 99.48％（RSD =2.71％） and 99.58％（RSD=2.45％）. Conclusion: The established simple method is operative with high precision and good reproducible which can be used in the quality control of Jinshui Ditan Liquid， and lay the foundation for establishment of the quality standard.

Jinshui Ditan Liquid； hesperidin； icariin； methodological study； gradient elution

R 284.1

A

1674-926X（2016）03-011-03

成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院基金項(xiàng)目（2010-D-YY-03）

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué) 四川 成都 611137 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 四川 成都 610075

曹蕾，女，在讀碩士，從事中藥制劑研究Tel：13408599958 Email：1206490185@qq.com

宋英，男，主任中藥師，從事中藥學(xué)研究Email：806380106@qq.com

2015-08-13