江華基，江小成，賀飛林，廖小卿，張文濤，張新濤北京大學(xué)深圳醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與康復(fù)科，廣東 深圳 50086；南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院骨科，廣東 廣州50000

基礎(chǔ)研究

黃芩素通過(guò)WNT/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)大鼠腱骨愈合

江華基2，江小成1，賀飛林1，廖小卿1，張文濤1，張新濤1
1北京大學(xué)深圳醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與康復(fù)科，廣東 深圳 510086；2南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院骨科，廣東 廣州510000

目的 探討黃芩素對(duì)大鼠腱骨愈合的作用及相關(guān)分子機(jī)制。方法 取40只8周齡的雄性SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組（n=20）和實(shí)驗(yàn)組（n=20）。兩組動(dòng)物均行大鼠腱骨愈合模型造模。實(shí)驗(yàn)組大鼠灌胃黃芩素10 mg/（kg·d），對(duì)照組灌胃等量的生理鹽水。術(shù)后3周、6周各處死10只大鼠并取材，通過(guò)生物力學(xué)、組織學(xué)觀察各組腱骨愈合的程度。此外，體外培養(yǎng)原代大鼠肌腱干細(xì)胞，加入不同濃度（0、0.1、1、10 μmol/L）的黃芩素處理，14 d后分別進(jìn)行ALP、茜素紅染色。Q-PCR、Western Blot檢測(cè)Runx2、OSX、OCN、一型膠原以及β-catenin的變化。隨后，在肌腱干細(xì)胞中加入10 μmol/L的黃芩素，并且加入WNT/β-catenin通路抑制劑DKK-1共培養(yǎng)，14 d后收集蛋白行Western Blot檢測(cè)，觀察β-catenin、Runx2以及OCN蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果 生物力學(xué)結(jié)果顯示術(shù)后3周和術(shù)后6周時(shí)實(shí)驗(yàn)組的腱骨愈合程度明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組織學(xué)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后3周和6周時(shí)腱骨界面細(xì)胞成熟程度更高，sharpey纖維生長(zhǎng)密集度與間質(zhì)鈣化程度更高。ALP、茜素紅染色、Q-PCR和Western Blot結(jié)果顯示不同濃度黃芩素均能提高肌腱干細(xì)胞的ALP活性，增加礦化結(jié)節(jié)形成、提高Runx2、OSX、OCN、一型膠原和β-catenin的表達(dá)。而β-catenin抑制劑DKK-1后能顯著降低黃芩素的這種促成骨作用。結(jié)論 黃芩素可以有效促進(jìn)腱骨界面細(xì)胞成熟與腱骨界面的膠原分泌，加速腱骨愈合并提高腱骨愈合質(zhì)量，這種促進(jìn)作用呈現(xiàn)WNT/β-catenin信號(hào)依賴性。

黃芩素；大鼠；腱骨愈合；肌腱干細(xì)胞；WNT/β-catenin

自體軟組織移植物是目前臨床上最為常用的前交叉韌帶（ACL）重建替代物。然而，腱骨愈合時(shí)間過(guò)長(zhǎng)與愈合結(jié)果差等問(wèn)題卻一直未得到良好的解決。因此，加快骨道內(nèi)肌腱的腱骨愈合意義重大。近年來(lái)，人工骨、含鈣骨水泥、生長(zhǎng)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白等被用來(lái)作為促進(jìn)腱骨愈合的制劑，然而，這些制劑往往價(jià)格昂貴且來(lái)源有限，難以滿足臨床的大量需求。

黃芩是唇形科植物黃芩的干燥根，是我國(guó)著名的傳統(tǒng)中藥，研究表明其具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、解熱鎮(zhèn)痛、抗變態(tài)反應(yīng)、抗糖尿病等廣泛的藥理學(xué)活性，黃芩素是從黃芩中提取的一種黃酮類化合物，是黃芩的主要有效成分之一［1］。據(jù)報(bào)道，黃芩素不僅能夠有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨分化［2］，還能有效抑制破骨細(xì)胞的生成以及誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的凋亡［3］。另一方面，有研究報(bào)道使用促進(jìn)成骨中藥三七總皂苷可以有效促進(jìn)腱骨愈合［4］。然而，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)黃芩素對(duì)腱骨愈合影響的報(bào)道。同時(shí)，以往的研究顯示，在腱骨愈合過(guò)程中肌腱含有大量的肌腱干細(xì)胞，可能對(duì)腱骨愈合起著至關(guān)重要的作用［5］。然而，目前尚無(wú)研究討論經(jīng)典中藥單體對(duì)肌腱干細(xì)胞的影響。

本研究主要探討了研究黃芩素對(duì)大鼠腱骨愈合的影響，深入研究了黃芩素對(duì)肌腱干細(xì)胞增殖及成骨分化的作用以及機(jī)制，開(kāi)拓中藥在骨科運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

DMEM培養(yǎng)基（Hyclone），I型膠原酶（Sigma），中性蛋白酶（Roche），青霉素和鏈霉素（碧云天），胎牛血清（Gibco），0.02%EDTA與胰蛋白酶1:1混合液（廣州威佳科技有限公司），黃芩素（Sigma），CCK-8（日本DOjindo），二甲基亞砜（DMSO）（Sigma），堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所），ALP染液（Sigma），茜素紅（Sigma）TRIzol RNA提取液（Life Technologies），Runx2、OSX、OCN、一型膠原（Col1α1）、β-catenin抗體均購(gòu)于Santa Cruz公司，DKK-1（Sigma），細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、移液管購(gòu)于Corning公司，4%多聚甲醛溶液（Sigma）。

1.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物模型 選取雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g（購(gòu)買(mǎi)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均進(jìn)行右側(cè)大腿腱骨愈合手術(shù)，建立大鼠關(guān)節(jié)外骨隧道-游離肌腱移植模型［6］。實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行黃芩素灌胃10 mg/（kg·d），對(duì)照組大鼠進(jìn)行等量的生理鹽水灌胃。術(shù)后3周、6周分別處死大鼠進(jìn)行取材。

1.2.2生物力學(xué)檢測(cè) 術(shù)后3、6周處死大鼠后（n=5），小心將右側(cè)后肢自髖關(guān)節(jié)離斷，迅速轉(zhuǎn)移到含有4%多聚甲醛的離心管中，4℃保存，待所有標(biāo)本收集齊后一同進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)試。測(cè)試前將標(biāo)本置于常溫下復(fù)溫3 h，小心獲取脛骨近端移植肌腱復(fù)合物，去除內(nèi)側(cè)的固定紐扣，測(cè)量隧道的長(zhǎng)度，將樣品兩頭用萬(wàn)能材料測(cè)試儀的夾具夾緊固定，檢測(cè)時(shí)保持牽拉應(yīng)力與骨隧道方向一致，以4.0 mm/s的速度施加應(yīng)力，直至肌腱被拔出或斷裂，測(cè)試過(guò)程中用生理鹽水保持組織濕潤(rùn)。應(yīng)力及位移數(shù)據(jù)由測(cè)試儀的計(jì)算機(jī)軟件系統(tǒng)（Laboratory Technology Corporation，美國(guó)）自動(dòng)生成，腱骨愈合強(qiáng)度用最大牽拉負(fù)荷與骨隧道長(zhǎng)度比值表示。、

1.2.3蘇木素-伊紅（HE）染色術(shù)后3、6周動(dòng)物處死后（n=5），立即取出脛骨近端移植肌腱復(fù)合物，去除移植肌腱以外的所有軟組織，置入體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定48 h；采用EDTA脫鈣1個(gè)月，隔天更換脫鈣液；隨后進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋，包埋時(shí)注意將骨隧道與石蠟表面垂直，采用連續(xù)切片的方法獲取隧道全長(zhǎng)不同部位的組織切片，切片厚度為5 μm；常規(guī)蘇木精-伊紅染色觀察。

1.3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1大鼠肌腱干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)取6周齡的雄性SD大鼠10只（購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)），腹腔麻醉后進(jìn)行原代肌腱干細(xì)胞分離與培養(yǎng)［7］。第3代肌腱干細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)研究。

1.3.2CCK-8實(shí)驗(yàn) 將第3代肌腱干細(xì)胞按5×104/個(gè)種植于96孔板，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入0.1、1、10、100、1000 μmol/L的黃芩素，對(duì)照組加入等量的DMSO，每組設(shè)10個(gè)平行孔。14 d后根據(jù)CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)，加入CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度（A值）。

1.3.3堿性磷酸酶（ALP）染色及活性檢測(cè) 取第3代肌腱干細(xì)胞，消化后按2×105/個(gè)種植于六孔板，隨后加入含有不同濃度（0、0.1、1、10 μmol/L）黃芩素的成骨培養(yǎng)基（DMEM、10%FBS、青霉素、鏈霉、50 μmol/L抗壞血酸、0.1 μmol/L地塞米松，10 mmol/Lβ-磷酸甘油）。每組設(shè)立4個(gè)復(fù)孔，每隔3 d換液1次。14 d后棄去六孔板中的培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍，隨后每孔加入0.5 mL 0.1%Triton X-100，置于常溫下15 min，然后根據(jù)南京建成ALP試劑盒說(shuō)明進(jìn)行ALP活性檢測(cè)。其它復(fù)孔將進(jìn)行ALP染色，將肌腱干細(xì)胞用4%多聚甲醛固定20 min，隨后用PBS清洗3遍，在加入ALP染液，置于常溫下30 min，再用PBS洗去染液，進(jìn)行拍照觀察。

1.3.4茜素紅染色及礦化結(jié)節(jié)測(cè)定取第三代肌腱干細(xì)胞，消化后按2×105/個(gè)種植于六孔板，隨后加入含有不同濃度（0、0.1、1、10 μmol/L）黃芩素的成骨培養(yǎng)基（DMEM、10%FBS、青霉素、鏈霉、50 μmol/L抗壞血酸、0.1 μmol/L地塞米松，10 mmol/Lβ-磷酸甘油）。每組設(shè)立4個(gè)復(fù)孔，每隔3 d換液1次。14 d后棄去六孔板中的培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍，經(jīng)4%多聚甲醛4℃固定30 min，行茜素紅（1 mg/mL）染色。茜素紅染色拍照后，每孔加入等量的氯化十六烷基吡啶溶液溶解礦化結(jié)節(jié)，酶標(biāo)儀測(cè)OD=560，比較各組形成礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量。

1.3.5熒光定量PCR（Q-PCR） 取第3代肌腱干細(xì)胞，消化后按2×105/個(gè)種植于六孔板，隨后加入含有不同濃度（0、0.1、1、10 μmol/L）黃芩素的成骨培養(yǎng)基（DMEM、10%FBS、青霉素、鏈霉、50 μmol/L抗壞血酸、0.1 μmol/L地塞米松，10 mmol/Lβ-磷酸甘油）。每組設(shè)立，4個(gè)復(fù)孔，每隔3天換液1次。14 d后棄去六孔板中的培養(yǎng)基，根據(jù)試劑盒說(shuō)明用TRIzol提取總RNA，用NanoDrop 8000全光譜紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，采用美國(guó)Bio-Rad公司的反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒和Veriti?96-Well Thermal Cycler儀器進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)條件為25℃5 min，42℃30 min和85℃5 min。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行加樣，應(yīng)用ABI 7900HT高通量熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)條件為95℃10 s，60℃10 s，72℃10 s，共40個(gè)循環(huán)。讀取CT值后以GAPDH的CT值作為內(nèi)參，采用2-ΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.6蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）取第3代肌腱干細(xì)胞，消化后按2×105/個(gè)種植于六孔板，隨后加入含有不同濃度（0、0.1、1、10 μmol/L）黃芩素的成骨培養(yǎng)基（DMEM、10%FBS、青霉素、鏈霉、50 μmol/L抗壞血酸、0.1 μmol/L地塞米松，10 mmol/Lβ-磷酸甘油）。每組設(shè)立，4個(gè)復(fù)孔，每隔3 d換液1次。14 d后棄去培養(yǎng)基，加入PBS漂洗2遍后，加入500 μL的細(xì)胞裂解液于冰上靜置30 min使細(xì)胞充分裂解。4℃12 000 r/min離心15 min，取上清，用BCA法進(jìn)行總蛋白濃度的測(cè)定。95℃變性4 min，各組取含20 μg蛋白質(zhì)樣品，經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉室溫下?lián)u床振蕩封閉2 h，然后分別加入一抗，4℃過(guò)夜。次日加入二抗，37℃孵育2 h，每進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)前PVDF膜均用4℃預(yù)冷的TBST搖床漂洗4次，每次8 min，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白，X光片曝光時(shí)間視效果而定，灰度值使用Image-Pro plus6.0進(jìn)行掃描測(cè)定。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1黃芩素提高大鼠腱骨愈合的生物力學(xué)強(qiáng)度

在術(shù)后3周和6周，分別取材進(jìn)行生物力學(xué)檢測(cè)腱骨愈合強(qiáng)度（N/mm），結(jié)果顯示術(shù)后3周和術(shù)后6周中實(shí)驗(yàn)組的腱骨愈合強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2黃芩素對(duì)Yamakado界面形態(tài)分型的影響

兩組動(dòng)物Yamakado界面形態(tài)分型結(jié)果顯示術(shù)后3周：對(duì)照組腱骨界面主要為疏松結(jié)締組織，其中7例為結(jié)締組織，3例腱骨分離；實(shí)驗(yàn)組腱骨界面主要為結(jié)締組織，其中3例間接連接，6例為結(jié)締組織，1例為腱骨分離。術(shù)后6周：對(duì)照組腱骨界面以結(jié)締組織為主，其中5例為間接鏈接，5例結(jié)締組織；實(shí)驗(yàn)組腱骨界面主要為較致密的結(jié)締組織，其中8例為間接鏈接，2例為結(jié)締組織。兩組均未出現(xiàn)典型的直接連接。

2.3黃芩素促進(jìn)腱骨界面的骨化形成

術(shù)后3周，對(duì)照組腱骨界面內(nèi)大量成纖維細(xì)胞聚集，細(xì)胞混亂無(wú)固定排列，骨隧道附近未見(jiàn)軟骨樣細(xì)胞，間質(zhì)鈣化不明顯，隧道壁表面新骨量少（圖1A）；實(shí)驗(yàn)組腱骨界面內(nèi)有大量成纖維細(xì)胞聚集，細(xì)胞排列有序，骨隧道附近有軟骨樣細(xì)胞出現(xiàn)，并且細(xì)胞間質(zhì)有鈣化趨勢(shì)，隧道壁表面新骨較多（圖1B）。術(shù)后6周，對(duì)照組腱骨界面有6個(gè)標(biāo)本出現(xiàn)sharpey纖維，排列教紊亂，隧道壁附近發(fā)現(xiàn)有軟骨樣細(xì)胞，且細(xì)胞基質(zhì)有鈣化趨勢(shì)，隧道壁表面少量新骨，但腱骨界面內(nèi)無(wú)新骨形成（圖1C）；實(shí)驗(yàn)組的所有腱骨界面均有明顯的sharpey纖維連接，排列有序，骨隧道附近軟骨樣細(xì)胞較多，基質(zhì)鈣化明顯，腱骨界面內(nèi)還有片狀新骨形成，隧道壁表面新骨形成多（圖1D）。

2.4黃芩素對(duì)肌腱干細(xì)胞增殖的影響

使用不同濃度的黃芩素處理肌腱干細(xì)胞14 d后，CCK-8結(jié)果顯示0.1、1、10、100 μmol/L的黃芩素對(duì)肌腱干細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯毒性，而1000 ng/mL的骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)肌腱干細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。

2.5黃芩素促進(jìn)肌腱干細(xì)胞的成骨分化

在用0.1、1、10 μmol/L的黃芩素處理肌腱干細(xì)胞14 d后，ALP釋放量及ALP染色結(jié)果（圖2A）顯示不同濃度的黃芩素均能促進(jìn)肌腱干細(xì)胞ALP的分泌，并且呈濃度依賴性增加。同樣，茜素紅染色和礦化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)結(jié)果顯示黃芩素能顯著促進(jìn)肌腱干細(xì)胞的礦化（圖2B）。Western blotting結(jié)果顯示不同濃度黃芩素可以促進(jìn)成骨因子（Runx2、OSX、OCN、Col1α1）表達(dá)，并且呈濃度依賴性增加（圖3）。

2.6黃芩素通過(guò)激活WNT/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)腱骨愈合

Western blottingt結(jié)果顯示，不同濃度的黃芩素能促進(jìn)肌腱干細(xì)胞的β-catenin蛋白的表達(dá)，并且呈濃度依賴性增加（圖4A）。在加入DKK-1后，能有效抑制黃芩素對(duì)β-catenin蛋白的促進(jìn)作用（圖4B）。

3　討論

腱骨界面的骨化程度對(duì)腱骨愈合具有重要的意義，過(guò)往的研究表明，黃芩素可以通過(guò)mTORC1信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨分化［2，8-9］，并有效抑制破骨細(xì)胞的激活［3］，此外，黃芩素還能有效緩解去卵巢小鼠的骨丟失［8］。在活體實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)黃芩素干預(yù)組的大鼠愈合界面的生物力學(xué)強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組，而Yamakado界面形態(tài)分型中，黃芩素組的腱骨愈合類型優(yōu)于對(duì)照組。同時(shí)，經(jīng)黃芩素干預(yù)后，腱骨界面膠原生長(zhǎng)旺盛，且早于對(duì)照組出現(xiàn)sharpey纖維。以上結(jié)果都提示黃芩素可以在體內(nèi)可以有效促進(jìn)大鼠腱骨界面的愈合。

移植的肌腱中含有肌腱干細(xì)胞，在創(chuàng)傷后被炎癥反應(yīng)激活［10］，肌腱干細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞相似，可以在不同條件下向成骨、成脂及成軟骨方向分化［11］，而其成骨分化在腱骨愈合的過(guò)程中起著重要的作用。本研究中選用肌腱干細(xì)胞作為突破點(diǎn)，在體外實(shí)驗(yàn)中探討了黃芩素對(duì)肌腱干細(xì)胞成骨分化的作用及機(jī)制，闡明黃芩素促進(jìn)腱骨愈合的作用機(jī)理。骨形成是腱骨愈合中的一個(gè)重要步驟，因此肌腱干細(xì)胞的成骨分化對(duì)腱骨愈合具有重要的促進(jìn)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素能有效促進(jìn)肌腱干細(xì)胞的成骨分化，并且這種促進(jìn)作用呈現(xiàn)濃度依賴性。

WNT/β-catenin信號(hào)通路是一個(gè)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和分化的重要信號(hào)途徑。近年來(lái)，有大量研究報(bào)道WNT/β-catenin信號(hào)通路在成骨分化及骨形成過(guò)程中扮演著重要角色［12］。首先，黃芩苷可以激活WNT/ β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化［13］，另一方面，機(jī)械牽張應(yīng)力可以通過(guò)激活WNT/ β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)肌腱干細(xì)胞的成骨分化［14］。本研究結(jié)果顯示，黃芩素在促進(jìn)肌腱干細(xì)胞成骨分化的同時(shí)，激活了WNT/β-catenin信號(hào)通路，而在使用WNT/ β-catenin信號(hào)通路抑制劑DKK-1后可以顯著抑制黃芩素的促成骨作用。因此可以推斷出黃芩素是通過(guò)WNT/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)肌腱干細(xì)胞成骨分化，從而促進(jìn)腱骨界面的骨形成。

綜上所述，黃芩素可以通過(guò)激活WNT/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)肌腱干細(xì)胞的成骨分化，達(dá)到腱骨愈合。本實(shí)驗(yàn)首次從肌腱干細(xì)胞角度探討了對(duì)腱骨愈合的機(jī)制，揭示了黃芩素可以通過(guò)激活WNT/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)肌腱干細(xì)胞的成骨分化，并且成功建立了大鼠關(guān)節(jié)外骨隧道-游離肌腱移植模型，驗(yàn)證了中藥黃芩的有效成分黃芩素在腱骨愈合中的促進(jìn)作用。本研究有肯定黃芩素對(duì)腱骨愈合的影響，從而為黃芩素的臨床研究和推廣應(yīng)用提供初步的理論依據(jù)，開(kāi)拓中藥在骨傷科及運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

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Baicalein promotes rat extra-articular tendon-to-bone transplanting healing through WNT/β-catenin signaling

JIANG Huaji2，JIANG Xiaocheng1，HE Feilin1，LIAO Xiaoqing1，ZHANG Wentao1，ZHANG Xintao1
1Department of Sports Medicine and Rehahilitation，Shenzhen Hospital of Peking University，Shenzhen 510086，China；2Department of Orthopedics，The Third Affiliated Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510000，China

Objective To investigate the effect of baicalein on tendon healing in bone tunnel and reveal its related molecular mechanism.MethodsIn vivo，40 Sprague Dawley male rats were used to establish rat extra-articular tendon-to-bone transplanting healing，then randomly divided into 2 groups.Experiment group was treated with baicalein 10 mg/（kg·d），while control group was treated by normal saline（0.9%）with the same volume.Biomechanical testing and histological detection were tested at 3 weeks and 6 weeks after surgery.In vitro，tendom stem cells were isolated from rat Achilles tendon，and being treated with various concentrations of baicalein for 14 days.The expression of alkaline phosphatase（ALP）and mineralized nodule was detected by ALP activity/staining assays and Alizarin red staining respectively，while the expression of Runx2，OSX，OCN，Collagen I were tested by Q-PCR and the expression of Runx2，OSX，OCN and β-catenin were evaluated by Western Blot assay.Results Tendon bone healing strength of experiment group was obviously stronger than control group in 3 weeks as well as in 6 weeks.In experiment group，there were more mature fibroblasts，more Sharphey fibers，and larger new bone formation area compared with control group.After intervention for 14 days，the expression of ALP，Runx2，OCN and VEGF were up-regulated，and WNT/β-catenin signaling were enhanced in vitro.Conclusion Baicalein can promotes osteogenic differentiation of tendon stem cells through WNT/β-catenin signaling in vitro，and stimulate tendon-bone healing in bone tunnel and enhance the connection between tendon and bone.

baicalein；rat；n tendon-bone healing；tendon stem cells；WNT/β-catenin signaling

2016-05-21

深圳市衛(wèi)生計(jì)生系統(tǒng)科研項(xiàng)目（201302058）

江華基，在讀碩士研究生，E-mail:gukejianghuaji@163.com

張新濤，博士，副主任醫(yī)師，E-mail:zhangxintao@sina.com