歐陽(yáng)小明，郅 程，周 蕓，廖德貴，賴(lài)妙玲廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科，檢驗(yàn)科，廣東 廣州 5060

基礎(chǔ)研究

黃芪注射液對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞β-catenin和E-cadherin表達(dá)的影響

歐陽(yáng)小明1，郅 程1，周 蕓2，廖德貴1，賴(lài)妙玲1
廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院1病理科，2檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510260

目的 研究黃芪注射液對(duì)子人宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞β-catenin和E-cadherin基因和蛋白表達(dá)的影響。方法 分別采用RT-PCR和免疫組化的方法檢測(cè)β-catenin和E-cadherin基因和蛋白的表達(dá)。用含不同濃度的黃芪注射液的條件培養(yǎng)基分別培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1-B 24、48、72 h后，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中β-catenin、E-cadherin基因表達(dá)，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)HEC-1-B中β-catenin、E-cadherin蛋白表達(dá)。結(jié)果 RT-PCR結(jié)果顯示，隨著子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞在含有黃芪注射液的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞中E-cadherin基因表達(dá)逐步增強(qiáng)（P＜0.05），而β-catenin基因表達(dá)逐步減弱（P＜0.05）。免疫組化染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，黃芪注射液可明顯降低子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá)、增加E-cadherin蛋白的表達(dá)（P＜0.05），而且黃芪注射液濃度越高處理時(shí)間越長(zhǎng)β-catenin表達(dá)更低（P＜0.05），黃芪注射液濃度越高E-cadherin表達(dá)更高（P＜0.05）。結(jié)論 黃芪注射液可呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性促進(jìn)E-cadherin基因和蛋白的表達(dá)、抑制β-catenin基因和蛋白的表達(dá)，從而使WNT信號(hào)通路受到抑制。這可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制之一。

黃芪注射液；人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞；β-catenin；E-cadherin

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，近年來(lái)，隨著生活水平的提高、人口的老齡化、激素替代治療的廣泛應(yīng)用，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)［1-2］。目前的治療措施以手術(shù)及放療為主，對(duì)于要求生育或晚期、復(fù)發(fā)患者需輔助激素治療或化學(xué)治療，然而化學(xué)治療及激素治療存在明顯的禁忌癥及毒副作用。因此，尋找安全、高效，適用范圍廣的抗子宮內(nèi)膜癌新藥是研究的熱點(diǎn)。近幾年利用天然藥物防治子宮內(nèi)膜癌是研究趨勢(shì)，中醫(yī)藥抗子宮內(nèi)膜癌的研究備受關(guān)注。

黃芪是一味常用的中藥，在臨床上應(yīng)用廣泛，其所含的有效成分主要有皂苷、黃酮和多糖等［3］。近年來(lái)研究顯示，傳統(tǒng)的補(bǔ)氣藥黃芪具有抗腫瘤能力。本研究使用含有黃芪注射液的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，并通過(guò)RT-PCR技術(shù)及免疫組化法研究黃芪注射液對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞WNT信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-Catenin和E-cadherin表達(dá)的影響，以初步探討黃芪注射液對(duì)人子宮內(nèi)膜癌WNT信號(hào)通路的影響。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1藥物與試劑黃芪注射液（AI），黃色的澄明液體，批號(hào)1001066，10 mL/支，每支相當(dāng)于含生藥20 g，成都地奧九泓制藥廠生產(chǎn)；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品；TRIzol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；RevertAidTM FirstStrandcDNA SynthesisKit為 Fermentas公司產(chǎn)品；RealMasterMix（SYBRGreen）、50 bp DNALadder為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；β-Catenin引物和E-cadherin引物為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；細(xì)胞爬片由江蘇世泰公司生產(chǎn)；β-Catenin和E-cadherin抗體購(gòu)自美國(guó)羅氏公司；En-Vision兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒由基因科技（上海）有限公司生產(chǎn)。

1.1.2細(xì)胞株 人子宮內(nèi)膜癌腺癌HEC-1-B細(xì)胞株購(gòu)買(mǎi)自上海細(xì)胞庫(kù)，目錄號(hào)為T(mén)CHu115。

1.1.3主要儀器醫(yī)用超凈工作臺(tái)為上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；水套式CO2培養(yǎng)箱為美國(guó)Forma產(chǎn)品；Nanodrop1000紫外分光光度計(jì)為T(mén)hermo產(chǎn)品；PTC-220多通道PCR儀為美國(guó)Bio-rad產(chǎn)品；GelDoc2000凝膠電泳成像分析系統(tǒng)為美國(guó)Bio-Rad產(chǎn)品；免疫組化盒子為福建邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)；普通光學(xué)顯微鏡為重慶奧特光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將人子宮內(nèi)膜癌腺癌HEC-1-B細(xì)胞接種于含10%（體積分?jǐn)?shù)）滅活胎牛血清、1×105U/L青霉素和1×105U/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置37℃、飽和濕度、5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2恒溫培養(yǎng)箱中。

1.2.2半定量RT-PCR 將HEC-1-B細(xì)胞接種于250 mL的培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞融合生長(zhǎng)后，實(shí)驗(yàn)分為黃芪組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別設(shè)100、200、300 mg/mL三個(gè)劑量小組。各組分別加入含藥培養(yǎng)液2 mL，對(duì)照組加入2 mL正常培養(yǎng)液，分別繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h。收集細(xì)胞，按照Trizol試劑說(shuō)明的方法提取細(xì)胞總RNA。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄（1 μg RNA，10 μL反應(yīng)體積）得到10 μL cDNA，直接PCR。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，引物由華大基因科技有限公司合成，經(jīng)PAGE純化。該兩對(duì)引物跨越內(nèi)含子，可以排除基因組DNA的影響。經(jīng)PCR（25 μL反應(yīng)體系），上樣電泳，平行作一孔DNA Marker（3 μL）。紫外燈下觀察DNA條帶拍照片記錄。電泳膠立即進(jìn)行光密度掃描，以GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物校正作相對(duì)量分析。

1.2.3細(xì)胞爬片免疫組化 將消毒高壓滅菌后的爬片置于孔板內(nèi)，每孔1片。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEC-1-B細(xì)胞，用胰酵消化，調(diào)成一定的濃度，接種于不同的有爬片的孔板內(nèi)，于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)基，按1.2.2中分組進(jìn)行處理。采用二步法行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。結(jié)果判定：β-Catenin以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜棕黃色為陽(yáng)性，E-cadherin以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)棕黃色為陽(yáng)性，高倍視野下隨機(jī)選取6個(gè)視野，參照許良中［4］選取染色部位較為集中的區(qū)域進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和結(jié)果判定，染色強(qiáng)度分級(jí)和記分標(biāo)準(zhǔn)：棕褐色計(jì)3分，棕黃色計(jì)2分，淡黃色計(jì)1分，無(wú)著色計(jì)0分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量分級(jí)和記分標(biāo)準(zhǔn)：一個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性著色細(xì)胞＞75%計(jì)4分，51%～75%計(jì)3分，11%～50%計(jì)2分，1%～10%計(jì)1分；無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為陰性，計(jì)分。將染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量?jī)身?xiàng)積分相加，結(jié)果判定：0～3分為陰性，4～7分為陽(yáng)性。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 所有計(jì)數(shù)資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，多組間用單因素方差分析，兩組間用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較分析，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 10.0進(jìn)行處理。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1RT-PCR結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳與DNA Marker比較，證實(shí)擴(kuò)增的目的片段大小完全吻合。用圖像采集分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，作掃描面積積分半定量分析，比較各組E-cadherin/GAPDH和β-Catenin/GAPDH灰度比值。結(jié)果顯示，隨著子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞在含有黃芪注射液的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞中E-cadherin基因表達(dá)逐步增強(qiáng)，而β-catenin基因表達(dá)逐步減弱（P＜0.05，圖1）。重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果反映一致，說(shuō)明黃芪可促進(jìn)體外培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的E-cadherin mRNA表達(dá)，同時(shí)也可抑制其β-catenin mRNA表達(dá)。

2.2免疫組化結(jié)果

細(xì)胞爬片免疫組化染色結(jié)果顯示（表2、圖2，3），與對(duì)照組比較，黃芪注射液可明顯降低子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá)、增加E-cadherin蛋白的表達(dá)（P＜0.05），而且黃芪注射液濃度越高處理時(shí)間越長(zhǎng)β-catenin表達(dá)更低，黃芪注射液濃度越高E-cadherin表達(dá)更高（P＜0.05）。

3　討論

中草藥作為我國(guó)傳統(tǒng)藥物，其在抗腫瘤中具有多靶點(diǎn)、多效應(yīng)、不良反應(yīng)小、不易產(chǎn)生耐藥性、安全有效等優(yōu)點(diǎn)，但其化學(xué)成分復(fù)雜，藥理作用廣泛，很難從單一的方面來(lái)簡(jiǎn)單闡述?，F(xiàn)有研究［5］顯示黃芪有較明確的有效抗腫瘤化學(xué)成分，主要有多糖、黃酮類(lèi)及皂苷類(lèi)等，黃芪注射液是利用從黃芪中提取的這些有效成分精制而成的中藥注射液，作為提高人體免疫力的藥物，目前在臨床上廣泛運(yùn)用于惡性腫瘤的輔助治療。黃芪主要的抗腫瘤作用機(jī)制可能為直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖、抑制腫瘤血管生成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫水平、阻止細(xì)胞周期蛋白復(fù)合物的磷酸化和通過(guò)抗氧化作用來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制等方式［6］。但黃芪的化學(xué)成分復(fù)雜，其所包含的其他成分是否也具有抗腫瘤作用及各種化學(xué)成分抗腫瘤作用的具體機(jī)制尚不明確，仍需大量的研究工作。本研究利用RT-PCR技術(shù)和免疫組化染色的方法首次探究了含黃芪注射液的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中β-catenin和E-cadherin基因、蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：黃芪注射液可顯著降低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中β-catenin基因、蛋白的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)E-cadherin基因、蛋白的表達(dá)，并呈現(xiàn)一定的時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)。

表2　黃芪注射液對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞β-catenin和E-cadherin蛋白表達(dá)的影響（n=6，）

表2　黃芪注射液對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞β-catenin和E-cadherin蛋白表達(dá)的影響（n=6，）

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與100 mg/mL黃芪注射液組比較，#P＜0.05；與24 h黃芪注射液組比較，ΔP＜0.05.

組別48 h β-catenin 93.10±0.16 89.21±0.25* 86.56±0.20*#82.84±0.36*#E-cadherin 29.23±0.15 36.18±0.34*Δ38.25±0.29*#Δ46.37±0.33*#Δ對(duì)照組100 mg/mL黃芪注射液組200 mg/mL黃芪注射液組300 mg/mL黃芪注射液組24 h β-catenin 92.86±0.21 91.17±0.31* 88.72±0.33*#85.04±0.28*#E-cadherin 28.79±0.18 31.43±0.24* 32.05±0.42*#37.56±0.37*#E-cadherin 29.10±0.22 32.27±0.30* 35.94±0.40*#40.13±0.24*#72 h β-catenin 93.24±0.14 85.42±0.32*Δ82.96±0.37*#Δ77.52±0.16*#Δ

β-catenin是一種重要的粘附分子，一方面它與鈣粘附蛋白相互作用形成E-cadherin/catenin復(fù)合體維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性［7］，另外它是WNT信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)［8］。子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的一個(gè)重要因素就是WNT通路的異常激活，而這種異常激活的關(guān)鍵環(huán)節(jié)就是β-catenin由于降解障礙而在胞漿中異常聚集［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌中β-catenin在核、漿中聚集明顯高于正常子宮內(nèi)膜，并且其在子宮內(nèi)膜癌中的異常表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［11］。腫瘤細(xì)胞向子宮肌層的快速浸染、轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后不良的主要原因。研究表明，正常子宮內(nèi)膜中E-cadherin全部陽(yáng)性表達(dá)，而在子宮內(nèi)膜癌中E-cadherin表達(dá)下降，這在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、侵襲中起重要作用［12］。

本研究顯示黃芪注射液可在促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)增強(qiáng)的同時(shí)抑制其β-catenin在胞核、胞漿的聚集。而這可能進(jìn)一步影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。這提示我們黃芪注射液可能是一種潛在的Wnt信號(hào)通路抑制藥物，它可能通過(guò)多靶點(diǎn)的作用于β-catenin和E-cadherin等分子從而抑制腫瘤WNT通路的異常激活以起到抗腫瘤的作用。在這一過(guò)程中，黃芪注射液中具體起作用的組分及其潛在的作用機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步的進(jìn)行體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)來(lái)探究。

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Effects of astragalus injection on the expression of β-Catenin and E-cadherin in human endometrial carcinoma cells

OUYANG Xiaoming1，ZHI Cheng1，ZHOU Yun2，LIAO Degui1，LAI Miaoling1
1Department of Pathology，2Clinical Laboratory Second Affiliated Hospital，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China

Objective To investigate the effects of astragalus injection on the mRNA and protein expression of β-catenin and E-cadherin in HEC-1-Bendometrial carcinoma cells.Methods Cell climbing slices of HEC-1-B cells were prepared for the intervening experiment of astragalus injection on endometrial carcinoma cells，then their mRNA and protein expression of β-catenin and E-cadherin detected by RT-PCR and immunohistochemistry.Results RT-PCR results showed that with the incubation time of endometrial cancer cells in conditioned medium containing astragalus injection increased，E-cadherin gene expression of the cells gradually increased（P＜0.05），while the β-catenin gene expression gradually decreased（P＜0.05）.The immunocytochemistry result indicated thatastragalus could significantly decrease β-catenin expression and increase E-cadherin expression in HEC-1-B cells（P＜0.05）.Moreover，accompanied by elevated concentration and treatment time of astragalus injection，β-catenin expression dropped progressively（P＜0.05），meanwhile with the concentration of astragalus injection raised，E-cadherin expression gradually increased（P＜0.05）.Conclusion Astragalus injection could significantly inhibit WNT signaling pathway by promoting mRNA andprotein expression of E-cadherin，decreasing mRNA and protein expression ofβ-cateninin a dose-and time-dependent manner，which might be one of the mechanisms for its anti-tumor effect.

astragalus；endometrial carcinoma cells；β-catenin；E-cadherin

2016-04-15

廣東省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（20131265）

歐陽(yáng)小明，E-mail:gzoyxm@163.com