李新麗，張厚森，賈 濤，高 宏，朱成晶

(江蘇省理化測(cè)試中心，江蘇 南京 210042)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豆制品中的烏洛托品

李新麗，張厚森，賈 濤，高 宏，朱成晶

(江蘇省理化測(cè)試中心，江蘇 南京 210042)

建立了用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豆制品中烏洛托品含量的方法。樣品用乙腈提取、正己烷凈化，弱堿性流動(dòng)相、梯度洗脫、正離子電噴霧多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)。本方法適用于腐竹、大豆粉、豆?jié){粉、大豆蛋白粉等豆制品中烏洛托品的測(cè)定。方法定量限為4 μg/kg，回收率86.2 %～102.0 %，精密度RSD<5 %。實(shí)驗(yàn)表明本方法前處理簡(jiǎn)單，定性定量方法準(zhǔn)確，能對(duì)豆制品中烏洛托品進(jìn)行確證。

烏洛托品;液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法;測(cè)定

烏洛托品(別名六亞甲基四胺)是衛(wèi)生部公布的非食用物質(zhì)之一，在弱酸條件下分解產(chǎn)生甲醛，具有殺菌、防腐的作用。衛(wèi)生部報(bào)道可能有些不法廠家違法使用烏洛托品以替代吊白塊,意在保持產(chǎn)品的色澤和延長(zhǎng)保質(zhì)期。烏洛托品本身屬低毒類，可作為藥物服用，但其在酸性條件下，分解出的甲醛易與體內(nèi)多種化學(xué)結(jié)構(gòu)的受體發(fā)生反應(yīng)，如與氨基化合物可以發(fā)生縮合，與巰基化合物加成，使蛋白質(zhì)變性。甲醛在體內(nèi)還可還原為醇，故可表現(xiàn)出甲醇的毒理作用。對(duì)人體的腎、肝、中樞神經(jīng)、免疫功能、消化系統(tǒng)等均有損害。因?yàn)闉趼逋衅吩趐H小于6.5就會(huì)分解放出甲醛，在食品中的殘留量會(huì)隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，在市場(chǎng)調(diào)查收集的陽(yáng)性樣品中烏洛托品的殘留量都在10 mg/kg以下。衛(wèi)生部發(fā)布的第四批《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單》中明確規(guī)定烏洛托品屬于違法添加的非食用物質(zhì)。目前現(xiàn)有食品中烏洛托品測(cè)試的國(guó)標(biāo)方法有SN/T 2226-2008《進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中

烏洛托品殘留量的檢測(cè)方法》[1]，適用于雞肉、雞肝臟、雞腎臟和豬肉中烏洛托品殘留量的檢測(cè)和確證，因?yàn)闃悠坊|(zhì)差別太大，該檢測(cè)方法不適用豆制品。報(bào)道的食品中烏洛托品的檢測(cè)主要有氣相色譜法[2-3]、分光光度法[4-5]、離子色譜法[6]、液質(zhì)法[7-17]等，本文介紹的方法前處理更為簡(jiǎn)單、快速。和同類液質(zhì)法相比，因?yàn)椴捎锰荻认疵摲蛛x了豆制品中的干擾物質(zhì)，從而簡(jiǎn)化了目標(biāo)物提取過(guò)程中去雜質(zhì)的步驟，降低了檢測(cè)成本、提高了檢測(cè)速度。

本文通過(guò)對(duì)不同提取方法、提取溶劑、色譜條件的研究，建立了用乙腈震蕩提取、正己烷凈化，弱堿性流動(dòng)相、梯度洗脫的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豆制品中烏洛托品殘留量的分析方法，該方法操作過(guò)程簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度、靈敏度和精密度好。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

烏洛托品(純度99.0 %) 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；氨水，正己烷，甲酸銨均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)；乙腈為色譜純， 美國(guó)TEDIA 公司； 0.22 um微孔濾膜，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓液相色譜三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(HPLC-MS/MS)，型號(hào)Agilent1260-6430 美國(guó)安捷倫公司；高速離心機(jī)；電動(dòng)振蕩器；渦旋混勻器。

1.3 液相色譜與質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜柱為科奧美萃生物科技公司生產(chǎn)的Kinetex HILIC 100A 柱(50 mm*2.1 mm,2.6 um)；流動(dòng)相為10 mmol/L甲酸銨溶液(pH=7.5±0.3)，乙腈；色譜柱溫度25℃；進(jìn)樣量5μL。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相及梯度洗脫條件

1.3.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜掃描采集方法為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；質(zhì)譜離子源為電噴霧(ESI)電離源，正離子模式，脫溶劑氣為氮?dú)?，溫?00 ℃，流量9 L/min；噴霧器壓力103.4KPa；碰撞氣為高純氮?dú)?；毛?xì)管電壓4000 V；其它質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

表2 烏洛托品多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試樣預(yù)處理

取有代表性的樣品約200 g，用粉碎機(jī)粉碎，混勻，均分成兩份作為試樣，分別裝入潔凈容器，密封并做好標(biāo)識(shí)，于-18 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.4.2 提取

準(zhǔn)確稱取試樣2 g(精確至0.001 g)，于50 mL具塞離心管中，用移液管準(zhǔn)確加入10 mL乙腈，渦旋混勻，于震蕩器(震蕩頻率300次/分)上震蕩提取20min，以4000 r/min離心2 min，吸取上清液2 mL于10 mL離心管中，加入2 mL乙腈飽和的正己烷溶液，渦旋混勻1 min ，在4000 r/min下離心1 min，棄去上層正己烷，重復(fù)用乙腈飽和的正己烷溶液萃取一次，下層液過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取烏洛托品標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液在0 ℃～4 ℃冰箱避光保存，可使用6個(gè)月。使用前用乙腈配制濃度為0.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.6 測(cè)定

1.6.1 定性測(cè)定

按照上述條件測(cè)定樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液，如果樣品與標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)物的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間一致；且在扣除背景后的樣品質(zhì)量色譜圖中，所選擇的離子對(duì)均出現(xiàn)，同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)豐度允許偏差不超過(guò)表3規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物。

表3 定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差

1.6.2 定量測(cè)定

以標(biāo)準(zhǔn)使用液分別進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量，樣液中烏洛托品的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)使用液線性范圍內(nèi)。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法選擇

在選擇提取溶劑時(shí)考察了水、甲醇、乙醇、乙腈等溶劑，水的提取液渾濁，很難分離出澄清液，容易發(fā)生堵塞；乙醇能和正己烷互溶，影響脂溶性雜質(zhì)的分離，增加基質(zhì)效應(yīng)；甲醇和乙腈的提取效率相近，考慮甲醇的沸點(diǎn)低和毒性較大，故選擇乙腈。

考察了超聲提取和震蕩提取法，發(fā)現(xiàn)超聲提取會(huì)使目標(biāo)物發(fā)生分解，回收率降低、且數(shù)據(jù)不穩(wěn)定；考察了震蕩提取的震蕩頻率、提取時(shí)間和提取次數(shù)等因素，用陽(yáng)性樣品實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)震蕩頻率300 次/min時(shí)，提取20 分鐘一次就能達(dá)到最大提取值，加標(biāo)回收率90 %以上、精密度也能滿足要求。

在凈化方法的選擇上，考察了固相萃取小柱凈化和正己烷凈化，參照SN/T2226-2008,采用離子交換樹(shù)脂小柱，但因?yàn)槎怪破分锌扇苡谝译娴幕|(zhì)復(fù)雜，采用小柱并不能消除基質(zhì)干擾，且因?yàn)槊總€(gè)小柱的填充差異，影響了方法的精密度和準(zhǔn)確性，選擇正己烷凈化不但步驟簡(jiǎn)單，成本低，而且消除基質(zhì)效應(yīng)比小柱好。

2.2 儀器條件選擇

烏洛托品在酸性條件下會(huì)分解放出甲醛，采用堿性甲酸銨緩沖鹽溶液和乙腈作為流動(dòng)相不僅可以為質(zhì)譜的電離源提供足夠的帶電離子而且可以將整個(gè)分離過(guò)程維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的堿性環(huán)境中，可以避免烏洛托品在酸性條件下的分解。

實(shí)驗(yàn)表明，采用電噴霧正模式電離、堿性色譜條件下比酸性條件下的色譜峰響應(yīng)值高。

豆制品特別是腐竹經(jīng)過(guò)了復(fù)雜加工后，基質(zhì)復(fù)雜，對(duì)烏洛托品檢測(cè)干擾很大，即使在前處理中用正己烷進(jìn)行凈化，但基質(zhì)效應(yīng)仍然較大，而且相同種類不同品牌豆制品的基質(zhì)效應(yīng)也差別較大，為此考察了不同比例流動(dòng)相的等度洗脫、梯度洗脫、不同流速的選擇等。實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)進(jìn)樣量5 μL、流速0.2 mL/min、梯度洗脫時(shí)可以消除所有基質(zhì)干擾，用乙腈配置標(biāo)準(zhǔn)曲線，基質(zhì)提取液加標(biāo)回收率達(dá)到95 %～100 %。

圖1 樣品中烏洛托品的總離子流圖

圖2 烏洛托品標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖

圖3 烏洛托品質(zhì)譜圖

2.3 方法的線性關(guān)系和檢出限

對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，在5 μg/kg ～100 μg/kg范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r2大于0.999。

在空白樣品基質(zhì)溶液中加入估計(jì)檢出限濃度(大于3倍信噪比)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢出限測(cè)試，結(jié)合回收率確定腐竹、大豆粉、豆?jié){粉、大豆蛋白粉等豆制品中烏洛托品的檢出限小于1 μg/kg。

2.4 方法回收率和精密度

在陰性樣品中加入烏洛托品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，添加的標(biāo)準(zhǔn)品使測(cè)試溶液濃度分別為5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L，進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn)。腐竹因?yàn)榛|(zhì)復(fù)雜，不同品牌基質(zhì)差異較大，實(shí)驗(yàn)過(guò)程選擇3個(gè)不同產(chǎn)地和品牌的腐竹樣品進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)表明方法精密度RSD=0.69%～2.89%，方法回收率為88.8%～102.4%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 精密度和準(zhǔn)確度測(cè)試數(shù)據(jù)(平行測(cè)定次數(shù)n=6)

3 結(jié)論

對(duì)市售腐竹陽(yáng)性樣品研究發(fā)現(xiàn)，在常溫下烏洛托品在緩慢分解，在-18℃下儲(chǔ)存可停止分解，從獲得的陽(yáng)性樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)看，烏洛托品的殘留量都在1 mg/kg以上，本法能滿足豆制品中違法添加烏洛托品的有效檢出，可以在豆制品的食品安全監(jiān)管以及監(jiān)督中發(fā)揮作用。

[1] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，SN/T 2226-2008進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中烏洛托品殘留量的檢測(cè)方法液.

[2] 黃國(guó)春.氣相色譜法測(cè)定腐竹中烏洛托品含量的研究[J].廣西輕工業(yè)，2008，6(6)：26．27.

[3] 王庭欣,等，腐竹中烏洛托品的高效氣相色譜檢測(cè)技術(shù)[J].河北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，33(5)：477-483.

[4] 魏運(yùn)金，糧食制品中雕(吊)白塊六亞甲基甲四胺的檢測(cè)[J].福建輕紡，2004，183(8)：16-19，33.

[5] 唐紅霞,等.分光光度法檢測(cè)腐竹中烏洛托品[J].糧油食品科技，2014,22(5);62-65.

[6] 張社利,等.離子色譜法檢測(cè)腐竹、粉絲中的烏洛托品[J].應(yīng)用化學(xué)，2014,31(11);1352-1355.

[7] 溫 韜，等.高效液相色譜法測(cè)定腐竹中的烏洛托品[J].洛陽(yáng)理工學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 2013,23(3);1-4.

[8] 周秀云,等.SPE-UPLC-MS/MS快速測(cè)定豆制品中的烏洛托品[J].河北省科學(xué)院學(xué)報(bào)，2013,30(1);64-68.

[9] 汪 輝,等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定食品中的烏洛托品[J].食品與機(jī)械， 2013,29(3);72-78.

[10] 喬 玲,等.凝膠凈化色譜-快速液相串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豆制品中烏洛托品的含量[J].食品科技，2014,39(5)；275-278.

[11] 楊 芳,等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中的烏洛托品[J].食品工業(yè)，2014,35(9);278-281.

[12] 張愛(ài)芝,張書芬,王全林,沈 堅(jiān).超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定腐竹、米線、年糕中的烏洛托品[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2013,4(2):472-478.

[13] 冼燕萍,l等.UPLC-MS/MS測(cè)定腐竹和米粉中的烏洛托品[J].江南大學(xué)學(xué)報(bào)，20l2， 11(1)，78-82.

[14] 高 潔,等.離子交換固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定腐竹中的烏洛托品[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào), 2014,5(10):3210-3214.

[15] 張厚森,等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定腐竹中烏洛托品殘留量[M].理化檢驗(yàn)：化學(xué)分冊(cè)，2014,50(10):1245-1248.

[16] 馬雪濤,等.離子交換固相萃取結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豆制品中烏洛托品殘留量[J].食品科學(xué),2014,35(10);166-169.

[17] 徐 幸,等.高效液相色譜-穩(wěn)定性同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定米線中烏洛托品的不確定度評(píng)[J].食品科學(xué)，2015, 36(16)：246-250.

(本文文獻(xiàn)格式：李新麗，張厚森，賈 濤，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豆制品中的烏洛托品[J].山東化工，2016，45(14)：63-66.)

Determination of Urotropine content in Bean Products by HPLC-MS/MS

LiXinli，ZhangHousen，JiaTao，GaoHong，ZhuChengjing

(Physics and Chemistry Testing Center of Jiangsu Province，Nanjing 210042, China)

Determination content of Urotropine in Bean Products is descripted in this paper. The samples were extracted by acetonitrile, purified by hexane, gradient elution separated by weak basic mobile phase, and determined by electrospray ionization and positive ion monitoring mode. This method can used to determine the content of Urotropine in beancurd skin, soybean flour, soymilk powder, and soyabean protein powder. The limitation is 4μg/kg, the total recovery rate is in the range of 86.2 %～102.0 %, and RSD<5 %. Its advantages include simple pretreatment and high accuracy.

Urotropine, HPLC-MS/MS ,Determination

2016-05-11

食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)JSSPDB2012-004

李新麗(1968—)，女，高工，從事分析測(cè)試與研究工作。

O657.63；TS207.3

A

1008-021X(2016)14-0063-04