□ 劉　萌　王焯筠　鄭州工程技術(shù)學院

響應(yīng)面法提取海帶中活性成分甘露醇

□ 劉萌王焯筠鄭州工程技術(shù)學院

本文選用海帶為材料，采用水浴法提取分離甘露醇。通過單因素實驗確定影響甘露醇提取的主要因素，并在此基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面分析法對海帶中甘露醇提取工藝進行優(yōu)化。通過嶺脊分析尋優(yōu)得出，在時間為3 h，溫度為30℃，固液比（海帶/水溶液）為1/50的條件下，甘露醇的得率最高為22.1 mg/g，比初始條件提高了23%。

甘露醇是一種無色、不吸濕的晶體，在食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)中，甘露醇都具有廣闊的應(yīng)用前景。甘露醇可采用葡萄糖或蔗糖溶液電解還原或催化還原的方法獲得，也可從海帶、海藻中提取。目前，我國海帶養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展成熟，海帶產(chǎn)量也躍增至世界第一位。海帶功能眾多，養(yǎng)殖成本低，在食品加工和有益物質(zhì)的提取中作用明顯，因此利用海帶作為生產(chǎn)甘露醇的原料，即可使資源得到更有效的開發(fā)，也體現(xiàn)了海帶更重要的經(jīng)濟價值。本文的研究工作旨在優(yōu)化甘露醇提取工藝條件，提高甘露醇的提取率，獲得較高的經(jīng)濟效益，為海帶活性物質(zhì)的提取提供有力依據(jù)。

材料與儀器

實驗材料

干海帶，市售，產(chǎn)于山東省長島縣，人工養(yǎng)殖；濃鹽酸、濃硫酸、無水乙醇、乙酸銨等均為分析純。D-甘露醇，純度≥98%，中國藥品生物制品檢定所。

主要儀器

KDC-16H高速離心機、HZS-H恒溫水浴鍋、臺式M295356低速離心機、T6新世紀紫外可見分光光度計、PHS-3C精密pH計。

實驗方法

海帶中甘露醇的提取

稱取3.0 g剪碎的干海帶，于20℃下在150 mL蒸餾水中浸泡，并用硫酸不斷調(diào)節(jié)pH值，使浸泡液的pH值達到2。過濾后，以濃度為1.0 mg/mL的石灰水中和濾液，分離過濾兩次，提取清液并濃縮清液至原體積的1/4。在清液中加入3倍體積的無水乙醇，得到的沉淀即為甘露醇。

甘露醇標準曲線的繪制

準確稱取0.1 g D-甘露醇，加水溶解并于100 mL容量瓶中定容，配制濃度為1 mg/mL的甘露醇標準溶液。吸取甘露醇標液1、2、3、4、5、6 mL分別置于100 mL容量瓶，用蒸餾水稀釋定容，配置濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的甘露醇溶液。吸取上述溶液各1 mL，置于標號為1、2、3、4、5、6的試管內(nèi)，分別加入高碘酸鈉溶液1 mL，混合均勻，室溫放置10 min，再依次加入Nash試劑4 mL，53℃水浴保溫15 min后冷卻到室溫，以蒸餾水作為空白對照，于413 nm波長處測定其吸光度。以吸光度為橫坐標，甘露醇標準液的體積濃度為縱坐標，繪制標準曲線如圖1所示。

圖1　甘露醇的標準曲線

海帶中甘露醇提取量的測定

吸取8 mL制備得到的粗甘露醇溶液于100 mL的容量瓶內(nèi)稀釋定容。從上述溶液中吸取1.0 mL按照2.2中的步驟測定其吸光度。在標準曲線上讀取甘露醇的體積濃度。

提取量=（體積濃度×100 mL×粗提液的體積/吸取的體積）/原料的質(zhì)量

單因素實驗設(shè)計

選取影響甘露醇提取得率的主要因素：溫度選取20℃、30℃、40℃、50℃ 4個水平；提取時間為1 h、2 h、3 h、4 h 4個水平；固液比（海帶/水溶液）選取1/40、1/50、1/60、1/70 4個水平分別進行單因素實驗。

響應(yīng)面法實驗設(shè)計

以單因素實驗的結(jié)果為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-BenhnKen中心組合的設(shè)計原理，設(shè)定水平編碼表，見表1。

表1　響應(yīng)面分析實驗因素水平表

結(jié)果與分析

單因素實驗設(shè)計結(jié)果與分析

通過單因素實驗確定提取溫度、提取時間、固液比對甘露醇提取量的影響如圖2、圖3、圖4所示。

圖2　提取溫度對甘露醇提取量的影響

圖3　提取時間對甘露醇提取量的影響

由圖2可知，在提取時間為3 h，固液比（海帶/水溶液）為1/50（g/ mL）的條件下，當提取溫度小于30℃時，甘露醇提取量隨溫度的升高而增大；當溫度大于30℃，提取量隨溫度的升高而下降；當溫度達到30℃，提取量最高。

在提取溫度為20℃，固液比（海帶/水溶液）為1/50（g/mL）的條件下，提取時間對甘露醇提取量的影響如圖3所示。由圖3可知，甘露醇的提取量隨著提取時間的增長而增大。當提取時間大于3 h，提取量變化不大。

圖4　固液比對甘露醇提取量的影響

在提取時間為3 h，提取溫度為20℃的條件下，固液比（海帶/水溶液）對甘露醇提取量的影響如圖4所示。隨著固液比的增大，提取量幾乎直線上升，當固液比（海帶/水溶液）達到1/50時，提取量最大，隨后就趨于下降。

響應(yīng)面法實驗結(jié)果與分析

以單因素實驗結(jié)果為基礎(chǔ)，運用Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計方案，甘露醇提取量的測定結(jié)果如表1所示。

1數(shù)據(jù)分析

根據(jù)表1的實驗結(jié)果，用SAS統(tǒng)計分析軟件進行多元回歸分析，經(jīng)回歸方程擬合后，實驗因子對甘露醇的粗提取量的影響以回歸方程表示為：Y1=21.47667+1.575*X-1+0.13*X2-0.0125*X3-3.153333*X-1*X1-0.1*X1*X2- 0.365*X1*X3 -1.918333*X2*X2+0.32*X-2*X3-0.513333*X3*X3

從表2中可以看出，用上述回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系時，其因變量和自變量之間的線性關(guān)系顯著，決定系數(shù)為96.93%，回歸方程擬合程度很好。

表3中的F檢驗顯示，總回歸達到顯著。表明時間、溫度、固液比三個因素與對海帶中甘露醇提取率總的來說存在顯著的回歸關(guān)系。

2尋取最優(yōu)值

利用SAS軟件進行嶺脊分析以確定各因素的最佳取值。通過分析后，得出回歸模型存在最大值點，Y的最大估計值為21.9 mg/g，各因素的取值分別為：溫度30℃，時間3 h，固液比(海帶/水溶液)1/50，在以上優(yōu)化條件下進行驗證實驗，共進行3批次甘露醇提取實驗，證明預(yù)測值21.9 mg/g與實驗平均值22.1 mg/g非常接近。

表1　Box-Benhnken實驗設(shè)計方案與實驗結(jié)果

表2　回歸方程偏回歸系數(shù)的估計值

表3　回歸方程的方差分析

結(jié)論

本文通過單因素實驗和響應(yīng)面實驗優(yōu)化海帶中甘露醇的提取條件，最終確定影響提取量的因素的主次順序為固液比（海帶/水溶液）>提取溫度>提取時間，最佳提取條件為：溫度為30℃，時間為3 h，固液比（海帶/水溶液）為1/50（g/mL）。在此最佳條件下，海帶中甘露醇的提取量為22.1 mg/g，比初始條件提高了23%。

劉萌（1986-），女，河南平頂山人，碩士研究生，助教。研究方向：生物學。王焯筠（1988-），女，河南駐馬店人，碩士研究生，助教。研究方向：食品。