溫 含，葛新發(fā)，Δ，董貴俊，龐洪波，張力輝

骨骼肌鈍挫傷恢復(fù)過程中HIF-1α、AMPKα2表達(dá)的改變*

溫 含1，葛新發(fā)1，2Δ，董貴俊2，龐洪波3，張力輝4

（1.上海體育學(xué)院 ，上海200438；2.山東體育學(xué)院 ，濟(jì)南250102；3.天津市殘疾人康復(fù)服務(wù)指導(dǎo)中心 ，天津300381；4.河北港口集團(tuán)有限公司港口醫(yī)院 ，秦皇島066002）

目的:觀測(cè)大鼠骨骼肌鈍挫傷（SMBI）恢復(fù)進(jìn)程中腺苷酸活化蛋白激酶α2（AMPKα2）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α （HIF-1α）的表達(dá)變化，探討SMBI恢復(fù)可能生物學(xué)機(jī)制。方法:雄性Wistar大鼠48只，隨機(jī)選取6只作為正常對(duì)照組；另42只大鼠重物砸傷后肢小腿建立鈍挫傷模型后分7組（n=6），造模后各組分別在傷后12 h、2 d、5 d、7 d、10 d、15 d、30 d取材，檢測(cè)小腿三頭肌HIF-1α、AMPKα2表達(dá)的變化。結(jié)果:損傷后12 h HIF-1α、AMPKα2表達(dá)均明顯升高，在傷后15 d開始回落接近正常；HIF-1α、AMPKα2表達(dá)的峰值出現(xiàn)在傷后2 d內(nèi)，傷后5 d后表達(dá)量開始下降；除HIF-1αmRNA在傷后2 d組表達(dá)出現(xiàn)峰值外，其余時(shí)間點(diǎn)二者mRNA與蛋白表達(dá)時(shí)程變化基本一致。結(jié)論:SMBI后，HIF-1α、AMPKα2可能通過參與調(diào)解缺氧適應(yīng)、肌細(xì)胞再生、能量代償起到促進(jìn)傷后恢復(fù)的作用。

骨骼肌鈍挫傷；腺苷酸活化蛋白激酶α2；缺氧誘導(dǎo)因子-1a；線粒體自噬；能量代償；大鼠

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.018

在運(yùn)動(dòng)損傷中SMNI極為常見，如若恢復(fù)過程不當(dāng)、恢復(fù)不完全或反復(fù)受傷會(huì)嚴(yán)重影響骨骼肌的生理功能，造成人體運(yùn)動(dòng)能力的下降，甚至影響運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)壽命［1］，其中以股四頭肌和腓腸肌的鈍挫傷最為常見［2］。有研究發(fā)現(xiàn)，有氧代謝能力顯著下降是鈍挫傷恢復(fù)過程中重要影響因素［3］。傷后受損組織由于細(xì)胞損壞、血管破損、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、缺血后再灌注等因素導(dǎo)致局部組織供氧不足，利用氧的能力繼續(xù)下降，進(jìn)而能量代謝紊亂，不利于受損部位通過自身循環(huán)代謝完成自身免疫、肌纖維再生與重組，從而嚴(yán)重影響損傷后恢復(fù)速度［4］。作為細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器的腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）和調(diào)節(jié)缺氧適應(yīng)能力的重要因子缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）在缺氧、炎癥的情況下會(huì)積極參與能量代償?shù)恼{(diào)節(jié)與線粒體自噬的發(fā)生，故推測(cè)二者在SMBI發(fā)生后可能參與骨骼肌恢復(fù)的能量代償和缺氧適應(yīng)。本文通過局部砸傷骨骼肌造模，來證明和探討所提假設(shè)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雄性Wistar大鼠48只，體重210～230 g，隨機(jī)選取6只作為正常對(duì)照組；另42只大鼠重物砸傷后肢小腿建立鈍挫傷模型后分7組（n=6），造模后各組分別在傷后12 h、2 d、5 d、7 d、10 d、15 d、30 d取材。

1.2 大鼠腓腸肌鈍挫傷模型的建立及取材

參考Rice KG［5］等的造模方法，大鼠腹腔注射10 g/L硫噴托納，麻醉后固定下肢，用木質(zhì)圓柱體自由下落造成右后肢小腿內(nèi)側(cè)面（皮下為腓腸肌中段）一次性打擊傷。打擊面直徑110 cm，圓柱體長(zhǎng)度20 cm，質(zhì)量620 g，下落高度40 cm，實(shí)際重力為6 108 N，實(shí)際動(dòng)能為2 143 J。造模后傷處腫脹但無出血，傷腿功能受限；處死大鼠發(fā)現(xiàn)皮下血腫明顯；去骨骼肌做切片HE染色后光鏡下觀察可見大量肌纖維斷裂、完整性缺失，纖維走形混亂，細(xì)胞外基質(zhì)中可見紅細(xì)胞，證實(shí)造模成功。取腓腸肌，冰水中去除凝血塊、脂肪和筋膜，錫箔紙包裹標(biāo)記組別后迅速置入液氮中，后放入-80℃冰箱保存。

1.3 主要儀器、試劑

溫控?fù)u床，Powerpac Basic電泳儀，Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System，BIO-RAD ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)，Trizol，SYBRGreenMix，引物，Real-Time PCR儀，ABI，Sep One Plus，各蛋白抗體

1.4 Western blot測(cè)定HIF-1、AMPK蛋白

取適量組織于離心管中，加入RIPA裂解液，手動(dòng)勻漿，冰上放置30min。14 000 r/min離心20min，吸取上清，轉(zhuǎn)移至新離心管中，-80℃保存?zhèn)溆?。使用Nanodrop超微量核酸蛋白測(cè)定儀進(jìn)行蛋白定量。100℃煮沸變性5 min。配制10%分離膠凝膠，濃縮膠濃度為4%。電泳條件:濃縮膠恒壓80 V，約40 min；分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部。設(shè)置恒流300 mA，冰浴轉(zhuǎn)膜2 h。將膜浸沒在封閉液Ⅱ中室溫輕搖90 min。封閉液，一抗孵育4℃過夜。稀釋二抗，目的蛋白用羊抗鼠-HRP 1∶20 000或羊抗兔-HRP 1∶10 000（根據(jù)一抗進(jìn)行選擇）室溫孵育60min。ECL反應(yīng)、曝光掃描得到蛋白表達(dá)圖片及灰度值。

1.5 RT-PCR測(cè)定HIF-1α、AMPKα2mRNA

實(shí)驗(yàn)條件參考湯強(qiáng)［6］等方法?？俁NA的提取: 取100mg骨骼肌加入1ml Trizol液，冰浴磨碎后，加氯仿、異丙醇、酒精等處理提取總RNA。在紫外分光光度下檢測(cè)波長(zhǎng)在260 nm和280 nm吸光度值，分析提取物RNA純度。制作2%的瓊脂糖凝膠，點(diǎn)入RAN樣品，60 V電壓下電泳30min，電泳后的膠板放入紫外透視儀下觀察，要求出現(xiàn)三個(gè)條帶，并且28 s的條帶亮度要高于18 s，說明抽提中沒有RNA的明顯降解。根據(jù)測(cè)試的RNA濃度將所有的樣品濃度用 Rnase Freewater調(diào)整為 1μg/μl。以O(shè)ligdT（18）為引物反轉(zhuǎn)錄（RT）合成cDNA。各目的基因引物見表3，PCR擴(kuò)增條件:95℃0.5min；95℃5 s，60℃34 s（40個(gè)循環(huán)）；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及處理

2 結(jié)果

2.1 SMBI后骨骼肌缺氧相關(guān)因子 HIF-1α、AMPKα2蛋白表達(dá)變化

SMBI恢復(fù)過程中，在傷后12 h、2 d取材組HIF-1α、AMPKα2蛋白表達(dá)增高非常顯著（P＜0.01）。傷后10 d，HIF-1α表達(dá)均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），從傷后15 d起HIF-1α表達(dá)接近正常；而AMPKα2僅在傷后5 d表達(dá)仍顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），自傷后10 d起，表達(dá)回歸至正常水平（表1）。

Tab.1 Mean valuesof the expressionsof HIF-1αand AMPKα2 on each time-point（±s，n =6）

Tab.1 Mean valuesof the expressionsof HIF-1αand AMPKα2 on each time-point（±s，n =6）

HIF-1α:Hypoxia inducible factor-1 alpha；AMPKα2:AMP-activated protein kinase alpha 2*P＜0.05，**P＜0.01 vs controlgroup

Group　HIF-1α　AMPKα2 .76±0.05 Control　0.25±0.06　0.77±0.12 12 h　0.44±0.09**　1.05±0.15**2 d　0.43±0.09**　1.06±0.21**5 d　0.34±0.06*　0.94±0.14*7 d　0.29±0.06*　0.81±0.09 10 d　0.26±0.03*　0.75±0.11 15 d　0.258±0.05　0.77±0.09 30 d　0.25±0.02　0

2.2 SMBI后骨骼肌缺氧相關(guān)因子 HIF-1α、AMPKα2mRNA表達(dá)變化

在SMBI恢復(fù)過程中，HIF-1αmRNA在傷后第2天表達(dá)出現(xiàn)峰值，與對(duì)照組有非常顯著性差異（P＜0.01），傷后第5天表達(dá)有下降趨勢(shì)，但仍較對(duì)照組有顯著升高（P＜0.05），傷后第7天表達(dá)回落正常，；而AMPKα2mRNA從傷后12 h表達(dá)較對(duì)照組有非常顯著的升高且達(dá)到峰值，該趨勢(shì)一直延續(xù)至傷后第2天，傷后第5天表達(dá)雖顯著高于對(duì)照組，但表達(dá)缺呈下降趨勢(shì)，傷后第7天表達(dá)回歸正常水平延續(xù)至傷后30 d。從趨勢(shì)上來看，AMPKα2變化趨勢(shì)與其mRNA表達(dá)基本吻合；而傷后12 h骨骼肌中HIF-1α表達(dá)量已達(dá)峰值，此時(shí)其mRNA卻仍接近正常，其他時(shí)間點(diǎn)蛋白與RNA表現(xiàn)基本一致（表2）。

Tab.2 Mean values of HIF-1αand AMPKα2 on each time-point （±s，n =6）

Tab.2 Mean values of HIF-1αand AMPKα2 on each time-point （±s，n =6）

HIF-1α:Hypoxia inducible factor-1 alpha；AMPKα2:AMP-activated protein kinase alpha two*P＜0.05，**P＜0.01 vs controlgroup

Group　HIF-1α　AMPKα2 Control　0.87±0.15　1.01±0.18 12 h　1.22±0.28　3.46±0.82**2 d　4.73±0.85**　3.29±0.71**5 d　2.23±0.44*　1.49±0.25*7 d　1.02±0.35　1.04±0.30 10 d　1.05±0.29　1.06±0.26 15 d　1.00±0.29　1.02±0.30 30 d　1.04±0.26　1.02±0.27

3 討論

作為能量調(diào)節(jié)中心的AMPK近年來一直是能量代謝研究的熱點(diǎn)。AMPK不但維持細(xì)胞能量的穩(wěn)定，還在機(jī)體對(duì)特殊情況產(chǎn)生適應(yīng)性中發(fā)揮重要作用［7-9］。AMPK主要在兩種情況下可被激活:（1）AMP/ATP的比值升高時(shí)（能量產(chǎn)生不足）；（2）缺氧應(yīng)激因子脯氨酸羥化酶（PHDs）經(jīng)AMPK上游激酶（AMPKK）途徑激活A(yù)MPK［10］。SMBI后，肌組織被破壞，同時(shí)出現(xiàn)血管損壞、細(xì)胞破損、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、炎性因子聚集、線粒體腫脹破壞等病理性改變，造成局部供血不足，組織缺血缺氧同時(shí)線粒體病變共同導(dǎo)致ATP生成障礙，此時(shí)AMP/ATP升高激活A(yù)MPK；另外供血不足導(dǎo)致局部組織細(xì)胞缺氧環(huán)境的形成，可直接通過缺氧應(yīng)激因子脯氨酸羥化酶（PHDs）經(jīng)AMPK上游激酶（AMPKK）途徑激活A(yù)MPK。

作為對(duì)缺氧敏感的另一因子低氧誘導(dǎo)因子HIF-1，廣泛表達(dá)于各組織細(xì)胞中，在缺氧應(yīng)激發(fā)生時(shí)可促進(jìn)機(jī)體和細(xì)胞產(chǎn)生低氧適應(yīng)。低氧可直接導(dǎo)致HIF-1表達(dá)升高，但有觀點(diǎn)認(rèn)為低氧誘導(dǎo)的HIF-1表達(dá)改變僅發(fā)生在蛋白水平，其mRNA并不發(fā)生改變［11，12］，同時(shí)大量的炎性因子對(duì)HIF-1的聚集、DNA結(jié)合活性及下游因子表達(dá)也起到明顯調(diào)節(jié)作用［13］。

AMPK作為能量代謝樞紐，在調(diào)節(jié)體內(nèi)能量代謝的平衡中扮演了尤為重要的角色，活化的AMPK可激活PGC-1α，PGC-1α能夠調(diào)控許多細(xì)胞核編碼的線粒體基因表達(dá)，通過PGC-1α-NRFs-Tfam途徑啟動(dòng)線粒體的生物發(fā)生，在線粒體生物發(fā)生過程中起到重要的調(diào)控作用［14，15］，為損傷肌纖維補(bǔ)充線粒體數(shù)量?；罨腁MPK還能通過促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）基因的表達(dá)來增加肌纖維對(duì)糖的攝取。大量實(shí)驗(yàn)證明，激活的AMPK通過磷酸化下游靶蛋白來關(guān)閉體內(nèi)合成代謝，增加分解代謝產(chǎn)生ATP?；罨腁MPK可激活真核細(xì)胞延長(zhǎng)因子2 （eukaryote elongation factor，eEf2）上游激酶，從而磷酸化eEf2來抑制蛋白合成［16］，AMPK還可以通過抑制mTOR來抑制蛋白質(zhì)的合成［17］，從而節(jié)省為合成蛋白所消耗的ATP。AMPK由上述原因可促進(jìn)分解代謝增加，為病理狀態(tài)下的機(jī)體提供能量供應(yīng)，減少細(xì)胞壞死。

HIF-1由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞基組成［18］，其中HIF-1β在大多數(shù)細(xì)胞中表達(dá)穩(wěn)定，HIF-1α在常氧水平下處于降解與表達(dá)的動(dòng)態(tài)平衡［19］。HIF-1α對(duì)細(xì)胞存活有較強(qiáng)的調(diào)控能力，低氧發(fā)生時(shí)HIF-1可以抑制凋亡分子的活性同時(shí)激活抗凋亡分子來調(diào)控細(xì)胞適應(yīng)低氧應(yīng)激，促進(jìn)細(xì)胞存活［20］。HIF-1對(duì)細(xì)胞低氧的適應(yīng)性調(diào)節(jié)是通過調(diào)控下游靶基因介導(dǎo)間接的作用。Ono等在觀察C2C12細(xì)胞在成肌分化過程中HIF-1α變化時(shí)分析發(fā)現(xiàn)，HIF-1α是C2C12細(xì)胞成肌分化所必需的條件［21］。HIF-1α可調(diào)控促紅細(xì)胞生成素，Ogilvie［22］等發(fā)現(xiàn)EPO能刺激成肌細(xì)胞的增值，可能參與損傷組織的修復(fù)過程。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳皬膶?duì)SMBI的動(dòng)物模型的建立上來看，與受傷實(shí)際情況還有明顯差別，損傷分級(jí)也并不夠明確，這些都有待于進(jìn)一步完善。

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The changes of HIF-1αand AMPKα2 exp ression levels during skeletal muscle blunt injury recovery

WEN Han1，GEXin-fa1，2Δ，DONGGui-jun2，PANG Hong-bo3，ZHANG Li-hui4
（1.Shanghai University of Sport，Shanghai 200438；2.Shandong Spot University，Jinan 250102；3.Tianjin Disabled Rehabilitation Center，Tianjin 300381；4.Qinhuangdao Port Hospital of Hebei Port Group Co.，Ltd，Qinhuangdao 066002，China）

【ABSTRACT】Objective:To explore the possible biologicalmechanismsof skeletalmuscle injury recovery by observing the changesof AMP-activated protein kinaseα2（AMPKα2）and hypoxia inducible factor-1α（HIF-1α）expression levels of rats in the skeletalmuscle blunt injury recovery process.Method:Six of the 48maleWistar ratswas randomly selected as the normal controlgroup.The blunt injurymodelwas set up by injuring the hind legs of remaining 42 ratswith heavy objects.Then theywere divided into 7 groups（n=6）.The changes of AMPKα2and HIF-1αexpression levelswere tested in the hind limb triceps surae of themodel rats from each of the 7 groups at 12 hours，2 days，5days，7 days，10 days，15 days and 30 days respectively following the injury.Results:The expression levelsof AMPKα2 and HIF-1αall increased significantly at12 hours following the injury and fell close to normal levels at 15 days following the injury.The valuesof AMPKα2 and HIF-1αexpression peaked within 2 days after injury and the expression levels began to decline at 5 days after injury.Except the peak，the changes of themRNA expressionsof the two proteinswere basically consistentwith those of protein expression at the other time points.Conclu sion:HIF-1αand AMPKα2might play roles inmediating hypoxia adaptation，muscle cell regeneration，and energy compensation to promote recovery after injury.

skeletalmuscle blunt injury； AMPKα2； HIF-1a； mitochondrial autophagy； the energy compensation； mouse

R33

A

1000-6834（2016）03-260-04

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（ZR2012CMO13）；運(yùn)動(dòng)健身科技省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（上海體育學(xué)院）資助項(xiàng)目

2015-11-13

2016-02-14

Tel:18553101017；E-mail:gexinfa@163.com