杜瑞雪，葉 平△，顏光濤，鄧子輝，梁文濤，郭子寬，張紅紅，耿 淼

瑞舒伐他汀對頸動脈粥樣硬化患者單個核細胞CCR2表達的影響及機制*

杜瑞雪1，葉 平1△，顏光濤2，鄧子輝2，梁文濤3，郭子寬5，張紅紅4，耿 淼4

（1.解放軍總醫(yī)院南樓心內(nèi)科 ，2.基礎醫(yī)學研究所 ，3.普通外科研究所 ，4.老年醫(yī)學研究所 ，北京100853；5.軍事醫(yī)學科學院放射與免疫研究所，北京100850）

目的:探討瑞舒伐他汀對頸動脈粥樣硬化患者單個核細胞CC類趨化因子受體2（CCR2）表達的影響及上游機制。方法:選擇頸動脈粥樣硬化患者20例。予瑞舒伐他汀5～20mg/d治療。在基線、3月時采集血標本，測定單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）及血脂水平；分離單個核細胞，流式細胞學檢測單個核細胞上的CCR2表達；熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測CCR2、過氧化物酶體增生物激活受體（PPAR）βmRNA的表達；Western印跡法檢測PPARβ蛋白的表達。結果:瑞舒伐他汀治療3個月后，患者低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平明顯降低（P＜0.01），MCP-1及單個核細胞CCR2表達顯著下降（P＜0.05），PPARβmRNA及蛋白表達均較前增加（P＜0.05）。結論:瑞舒伐他汀可能通過PPARβ途徑降低MCP-1，抑制單個核細胞CCR2的表達。

瑞舒伐他??；動脈粥樣硬化；CC類趨化因子受體2；過氧化物酶體增生物激活受體β

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.003

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥性疾病。他汀類藥物可降低缺血性心腦血管疾病的發(fā)生率和死亡率［1］，其機制除主要與降低血漿膽固醇水平有關外 ，還可能涉及到抗炎作用［2-4］，其中多條炎癥信號通路參與其中。單核細胞趨化蛋白-1 （monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）是誘導AS慢性炎癥發(fā)生的主要趨化因子，對單個核細胞具有很強的趨化活性。這種趨化作用主要靠MCP-1與單個核細胞上的CC類趨化因子受體（C-C chemokine receptor，CCR2）結合實現(xiàn)。然而，目前他汀作用于CCR2的研究多來源于動物實驗和體外細胞培養(yǎng)［5，6］，在體研究還很少，且機制不清。本研究初步探討了瑞舒伐他汀對頸動脈粥樣硬化患者單個核細胞CCR2的影響以及和過氧化物酶體增生物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）β途徑之間的關系，以期為防治AS提供新的思路和治療靶點。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇在解放軍總醫(yī)院門診及周圍社區(qū)醫(yī)院就診的頸動脈粥樣硬化患者共20例，男性17例，女性3例。所有患者均符合以下入選標準:年齡40～70歲；低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoproteincholesterol，LDL-C）2.0～6.5 mmol/L；甘油三酯≤4.0mmol/L；超聲證實有明確的頸動脈粥樣硬化斑塊且含有脂核；既往從未使用過他汀類藥物；隨訪期間能保持低膽固醇飲食（遵照中國成人血脂異常防治指南中有關低膽固醇的飲食的要求）。排除標準:嚴重肝腎疾病、既往有腦出血病史、繼發(fā)性血脂代謝異?；蛴屑易逍愿吣懝檀佳Y、惡性腫瘤、有急、慢性炎癥性疾病或處于免疫缺陷狀態(tài)者、隨訪期內(nèi)必須應用其他降脂藥等。該研究經(jīng)解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 治療用藥及隨訪

入選患者予瑞舒伐他汀10 mg/d作為起始劑量，4周后測量空腹血脂水平，并監(jiān)測肝腎功能、肌酸激酶。如果LDL-C≥2.0 mmol/l或HDL-C＜1.0 mmol/l，瑞舒伐他汀的劑量將增至20mg/d，如TC≤3.0mmol/l，瑞舒伐他汀則減量為5mg/d。治療3月后隨訪結束。所有患者在基線、12周時采集血標本用于流式細胞學檢測、單個核細胞制備及血漿分離，并化驗血脂、肝腎功能、肌酸激酶、血常規(guī)。

1.3 主要試劑

Ficoll-Paque PLUS；Human MCP-1 ELISA試劑盒；鼠來源單克隆CCR2抗體（Alexa Fluor 647）；鼠來源單克隆CD14抗體（FITC）；鼠來源單克隆CD3抗體（PE-Cy5）；以上抗體鼠來源同型對照；總RNA提取試劑TRIzol；RT試劑盒；核蛋白提取試劑盒；鼠來源單克隆PPARβ抗體。

1.4 血漿單核細胞趨化蛋白-1濃度測定

取血漿0.5 ml，采用ELISA雙抗體夾心法按試劑盒說明書測定血（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）含量，方法按操作說明進行。

1.5 密度梯度離心法制備單個核細胞

將l0ml抗凝血2 000 r/min離心10min，取上層血漿，存放于-80℃冰箱，備用。下層全血細胞與PBS液1∶2混勻后，緩慢加入到人單個核細胞分離液Ficoll-Paque PLUS的液面上，細胞懸液與單個核細胞分離液比例為4∶3，2 000 r/min離心20 min。收集單個核細胞層至新的離心管，加入其體積5倍的PBS液，2 000 r/min離心5min，棄上清液。加入PBS液重懸細胞，重復上述過程，即得單個核細胞。用1.5ml PBS液重懸細胞，細胞計數(shù)后，其中0.5ml細胞懸液用于提取RNA，剩余的1ml細胞懸液用于提取核蛋白。

1.6 流式細胞學測定單個核細胞表面CCR2的表達

在5 ml流式管中避光加入抗CD3、抗CD14、及抗CCR2各20μl，對照管中加入以上抗體鼠來源的同型對照。加200μl全血，室溫避光孵育15min；加入1×溶血素（10倍稀釋）2 ml，室溫避光孵育10 min；離心1 500 r/min 5min，之后去上清；加入2ml PBS液，離心1 500 r/min 5min，去上清，重復上述步驟一次；加入500μl PBS，BD流式細胞儀檢測CD3+/ CCR2+，CD14+/CCR2+陽性細胞數(shù)，結果以上述免疫標志占CD3+，CD14+陽性細胞數(shù)的百分比表示。

1.7 熒光定量RT-PCR測定單個核細胞CCR2、PPARβ的mRNA表達

TRIzol RNA提取試劑盒提取單個核細胞總RNA；使用如下體系體外逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA:42℃30 min，99℃5min，5℃5min。采用熒光定量RT-PCR測定CCR2、PPARβmRNA的表達，引物由上海生工公司合成。其中CCR2引物 （擴增片段長度99 bp）上游:5'-CCATCATCTATGCCTTCGTTG-3'，下游:5'-GGACCTCCACACACTGGTTT-3'；PPARβ引物（擴增片段長度105 bp）上游:5'-TCAGAGCACAGAGGTAGG AGAA-3'，下游:5'-CACTTCCACCCAGAGTCACA-3'。以β-actin為內(nèi)參基因。反應條件為:95℃預變性2 min；擴增；95℃變性20 s，59℃退火25 s，72℃延伸30 s，共45個循環(huán)?；虻谋磉_量用2-△△Ct法進行計算。

1.8 Western blot測定單個核細胞PPARβ的蛋白表達

按照核蛋白提取試劑盒說明冰上操作提取單個核細胞核蛋白，BSA法進行蛋白含量的測定。以30 μg蛋白/泳道上樣，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，加入PPARβ抗體，4℃孵育過夜；洗滌后再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗孵育。應用ECL顯色試劑盒顯色，暗室下顯像及拍片。以Histone作為內(nèi)參照，凝膠分析成像軟件分析結果。實驗中所用抗體濃度:鼠來源單克隆PPAR-β抗體濃度1∶500；鼠來源單克隆Histone抗體濃度1∶1 000；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG濃度1∶3 000。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 病人一般臨床資料

20例病人全部完成隨訪。瑞舒伐他汀的最終服用劑量:5mg者7例；10mg者7例；15～20mg者6例（表1）。

Tab.1 General data of patients（n =20）

2.2 瑞舒伐他汀對血脂及血漿MCP-1的影響

瑞舒伐他汀治療3個月后，患者的LDL-C、TC、TG水平較基線均降低（P＜0.05），尤以LDL-C降低明顯，HDL-C水平有一定程度增加但與基線比較，差異無統(tǒng)計學意義。瑞舒伐他汀治療后，MCP-1水平降至51.27（40.46，69.23）pg/ml，與基線相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表2）。

2.3 熒光定量RT-PCR檢測瑞舒伐他汀對單個核細胞CCR2mRNA及PPARβmRNA表達的影響

熒光定量RT-PCR顯示，瑞舒伐他汀治療3月后，單個核細胞CCR2 mRNA從基線1.12（0.81，2.23）降至1.08（0.70，1.21）。PPARβmRNA表達則明顯增加，從1.28（0.64，1.48）升至2.60（1.50，3.81）（P＜0.05）。

2.4 流式細胞學檢測瑞舒伐他汀對單個核細胞CCR2表達的影響

應用細胞表面特異性抗原CD3標記T淋巴細胞，CD14標記單核細胞，流式細胞學檢測結果顯示，瑞舒伐他汀對兩種細胞CCR2表達均表現(xiàn)出明顯的抑制作用。其中CCR2陽性淋巴細胞數(shù):基線為8.42%（6.27%，10.68%），3月為1.51%（1.02%，2.32%）（P＜0.05，圖1）。CCR2陽性單核細胞數(shù):基線為95.88%（91.03%，98.17%），3月為87.52%（84.92%，89.92%）（P＜0.05，圖2）。

Tab.1 Effectof rosuvastatin on expression of CCR2 in lymphocyte cells

Tab.2 Effect of rosuvastatin on expression of CCR2　in macrophage cellsCCR2:C-C chemokine receptor 2

2.6 Western blot檢測瑞舒伐他汀對單個核細胞PPARβ蛋白表達的影響

瑞舒伐他汀對單個核細胞PPARβ核內(nèi)活化蛋白有上調(diào)作用，治療前后目的蛋白與內(nèi)參蛋白的比值分別為（1.64±0.80）、（3.89±2.69），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖3）。

Tab.3 Effectof rosuvastatin on expression of PPARβPPARβ:Peroxisome proliferator-activated receptorβ

Tab.2 Effectof rosuvastatin on lipid profile and MCP-1（n=20）

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀治療后，不但血漿中MCP-1水平顯著下降，而且單個核細胞表面CCR2的表達明顯減少，提示瑞舒伐他汀良好的抗單個核細胞趨化作用。

既往針對他汀作用于MCP-1的研究較多。近年來，作為MCP-1的受體，CCR2在AS中的作用逐漸被人們重視。研究發(fā)現(xiàn)，單核細胞遷移到動脈壁很大程度上受活化的CCR2的調(diào)節(jié)，而選擇性CCR2拮抗劑（GSK1344386B）則顯著抑制單核巨噬細胞浸潤動脈粥樣硬化斑塊［7］。進一步研究顯示 ，在ApoE-/-及LDLr-/-小鼠模型中，CCR2缺失不但導致巨噬細胞浸潤顯著減少，而且使AS斑塊明顯縮小，提示CCR2在促進斑塊發(fā)生發(fā)展中起重要作用［8-10］。

然而，目前觀察他汀類藥物對CCR2影響的研究并不多，且主要以培養(yǎng)的單核細胞或單核細胞系為研究對象，在體研究很少。Han KH等［11］曾入選21例膽固醇正常的健康男性志愿者，予辛伐他?。?0mg/d）治療2周后發(fā)現(xiàn)，外周血單核細胞表面CCR2的表達下降。本研究拓展了Han的研究成果。入組患者有明確的頸動脈粥樣硬化脂質(zhì)斑塊，同時合并吸煙、2型糖尿病、高血壓、基線LDL-C水平不達標等多種冠心病危險因素，部分患者尚有腦梗死病史，屬于未來心血管事件的高危人群，他汀治療對其具有更為重要的意義。研究結果顯示，伴隨著LDL-C從3.30 mmol/L降至1.80 mmol/L，不但單核細胞上的CCR2表達明顯下降，T淋巴細胞表面CCR2也受到顯著抑制，提示瑞舒伐他汀對這部分心血管事件高危人群從MCP-1和CCR2兩方面減少單個核細胞的趨化，可能在防止脂核增大、控制斑塊內(nèi)炎癥、穩(wěn)定斑塊等方面起有益作用。

MCP-1/CCR2的上游通路涉及到多種途徑?；A研究初步顯示，PPARβ，作為過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）其中的一個亞型，可能是連接他汀和下游MCP-1/CCR2等炎癥因子的紐帶之一［12-14］。

在培養(yǎng)的人肺動脈平滑肌細胞和鼠小膠質(zhì)神經(jīng)細胞中，PPARβ活性增加能減少TNF誘導的MCP-1表達或放射損傷導致的MCP-1增加［15，16］。在高脂飼料喂養(yǎng)的Ldlr-/-小鼠中，PPARβ激動劑GW1516能顯著減少斑塊內(nèi)巨噬細胞的浸潤和炎癥反應，減少主動脈斑塊內(nèi)脂質(zhì)滲入，增強膠原蛋白組織沉積，延緩斑塊進展［17］。提示 PPARβ通過抑制下游MCP-1/CCR2發(fā)揮抗AS作用。

然而，他汀是否影響PPARβ尚未可知。有學者發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中，他汀可增加PPARβ的表達［18］。既往本研究組在培養(yǎng)的小鼠心肌細胞及老年大鼠模型中也發(fā)現(xiàn)，他汀通過上調(diào)PPARβ，發(fā)揮抗心肌肥大、抑制心臟衰老、保護腎臟的作用。然而，他汀對人體環(huán)境下參與AS的炎性細胞如何作用尚不明確。

本研究顯示，應用平均11mg瑞舒伐他汀治療后，在基因轉(zhuǎn)錄水平，瑞舒伐他汀上調(diào)單個核細胞PPARβ的表達；提取核蛋白進行Western blot亦顯示，瑞舒伐他汀對PPARβ的蛋白活性同樣具有上調(diào)作用。據(jù)此，我們推測，瑞舒伐他汀除顯著降脂外，還可能通過PPARβ上游通路在一定程度上抑制MCP-1/CCR2水平，起到抗炎作用。這為完善他汀類藥物的抗動脈粥樣硬化作用提供了一定理論依據(jù)，為將來尋找新的藥靶提供了新的思路。同時，由于人體條件的限制，PPARβ上調(diào)是否與MCP-1/ CCR2降低直接有關尚需進一步研究證明。

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The effect of rosuvastatin therapy on CCR2 expression in mononuclear cells and its upstream pathway

【ABSTRACT】Objective:To investigate the effectof rosuvastatin therapy on C-C chemokine receptor（CCR2）expression inmononuclear cells in patientswith carotid atherosclerosis and explore the possible upstream mechanism.Methods:Twenty patientswithout previous statin treatmentwere enrolled.Rosuvastatin were given 5 to 20 mg/day for 3 months.At baseline and 12 weeks，lipid profile and plasmamonocyte chemotactic protein-1（MCP-1）levelswere examined.ThemRNA and protein expressions of CCR2 in themononuclear cellsweremeasured with RT-PCR and flow cytometry，respectively.ThemRNA and protein expression of peroxidase proliferator-activated receptor（PPARβ）were detectedwith RT-PCR and Western blot，respectively.Results:After 3-months rosuvastatin treatment，the patients'low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C）levels decreased significantly（P＜0.01）.Comparedwith baseline，themRNA and protein expressions of CCR2 in the mononuclear cells showed significantly decrease，aswellasplasmaMCP-1 levels（P＜0.05）.BothmRNA and protein expressionsof PPARβ in themononuclear cells increased（P＜0.05）.Conclusion:Rosuvastatinmay attenuateMCP-1/CCR2 through PPARβupstream pathway.

rosuvastatin； atherosclerosis； CCR2； PPARβ

R453.9

A

1000-6834（2016）03-202-05

國家自然科學基金項目（81270941）

2016-01-22

2016-03-07

Tel:010-66876369；E-mail:yeping301@sina.com