蔡曉明，陳家榮，梁光紅

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002； 2.福州市林業(yè)局，福建 福州 350005；3.建甌市葉坑國(guó)有林業(yè)采育場(chǎng)，福建 建甌 353133)

蚧菌共寄生對(duì)馬尾松針葉POD活性的影響

蔡曉明1，2，陳家榮3，梁光紅1

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002； 2.福州市林業(yè)局，福建 福州 350005；3.建甌市葉坑國(guó)有林業(yè)采育場(chǎng)，福建 建甌 353133)

松突圓蚧與枯斑擬盤多毛孢菌都是嚴(yán)重危害福建省馬尾松的主要林業(yè)有害生物。由于二者可共寄生于馬尾松的松針，因此重點(diǎn)研究測(cè)定松針在二者共寄生條件下體內(nèi)過氧化物酶的活性變化，對(duì)于探析松突圓蚧-枯斑擬盤多毛孢菌-馬尾松針葉之間的互作關(guān)系具有重要作用。以5年生馬尾松有蟲有病(共寄生)、有蟲無病(獨(dú)寄生/蟲)、無蟲有病(獨(dú)寄生/病)、無蟲無病(健康針葉，對(duì)照)針葉為研究對(duì)象，采用紫外吸收法測(cè)定松針內(nèi)過氧化物酶的活性特征。結(jié)果表明，不同松針的POD酶活性大小順序?yàn)椋河邢x有病>有蟲無病>無蟲有病>無蟲無病。顯然，病、蟲無論是共寄生還是獨(dú)寄生都會(huì)誘導(dǎo)POD活性上升；但有蟲有病、有蟲無病處理的POD活性分別是無蟲有病處理的POD活性的5.10、3.72倍，表明蟲害在POD活性誘導(dǎo)過程中占據(jù)了主導(dǎo)作用；共寄生處理的POD實(shí)際測(cè)定值為435.0 U·g-1·min-1，顯著高于二者單獨(dú)處理?xiàng)l件下POD的理論相加值402.8 U·g-1·min-1(P<0.05)，表明松突圓蚧、枯斑擬盤多毛孢菌在誘導(dǎo)POD活性上升過程中可能存在互惠共利關(guān)系并導(dǎo)致了聯(lián)合增效作用。因此，防治松突圓蚧時(shí)建議兼治松赤枯病，可進(jìn)一步提升防控效果。

松突圓蚧；枯斑擬盤多毛孢；馬尾松；共寄生；過氧化物酶

松突圓蚧(HemiberlesiapitysophilaTakagi)屬同翅目(Homoptera)盾蚧科(Diaspididae)，是一種危險(xiǎn)性極大的林業(yè)外來入侵害蟲，危害性極強(qiáng)。我國(guó)20世紀(jì)80年代初由珠海入侵，成為我國(guó)南部地區(qū)最具代表性的森林外來入侵物種之一。10 a間便快速擴(kuò)張至廣東大部分地區(qū)，福建和廣西局部地區(qū)，在沿海地區(qū)危害猖獗[1-2]，并呈現(xiàn)向內(nèi)陸林區(qū)擴(kuò)展蔓延的態(tài)勢(shì)，對(duì)福建省森林資源及國(guó)土生態(tài)安全構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅[3-5]。松突圓蚧在福建沒有明顯的越冬現(xiàn)象，主要聚居在松針鞘內(nèi)通過刺吸松針進(jìn)行危害，受害針葉出現(xiàn)黃化、死亡和早落，甚至導(dǎo)致松樹大面積枯死或衰退。而枯斑擬盤多毛孢(Pestalotiasfunereal)屬于半知菌亞門，黑粉菌目，是松赤枯病的病原真菌，被列入2003年國(guó)家林業(yè)局首次發(fā)布的林業(yè)危險(xiǎn)性有害生物名單(檢防函[2003]14號(hào))。該病原菌能浸染多種松屬植物，是中國(guó)長(zhǎng)江以南森林內(nèi)廣泛存在的優(yōu)勢(shì)菌種。主要通過傷口、自然孔口侵入，常寄生在松針葉鞘，引起針葉萎黃病、死亡、早落等[5-6]。

2012年6月，通過野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，松突圓蚧與枯斑擬盤多毛孢在同一松針的共寄生比例最高達(dá)43%，特別在6—10月松突圓蚧種群密度較低的季節(jié)[4-5]，二者共寄生針葉松突圓蚧的存活蟲口數(shù)量顯著增多；它們還具有重疊的危害高峰期且主要借助風(fēng)力傳播。因此，推測(cè)共寄生的松突圓蚧和枯斑擬盤多毛孢可能有互相促進(jìn)的作用，從而對(duì)植株產(chǎn)生更大的危害[6]，為此開展了系列生理生化試驗(yàn)。本文以鄰甲氧基苯酚(即愈創(chuàng)木酚)為過氧化物酶的底物，采用紫外吸收法測(cè)定過氧化物酶的活性，探討松突圓蚧與枯斑擬盤多毛孢共寄生條件下的互作關(guān)系及二者的成災(zāi)機(jī)制，探索治理松突圓蚧新的輔助方法，具有一定的理論與實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用接蟲法制備感蟲樣株。2013年3月中旬—4月中旬，從野外采集松突圓蚧危害的松枝(若蟲高峰期)，剪取嚴(yán)重受害的小枝掛放于5年生健康松苗上，定期檢查其若蟲固定及蚧殼形成，以此獲得感蟲條件基本一致的受害松苗。同時(shí)，采用噴霧法制備感病樣株。先采用PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲，采用打孔器取直徑7 mm菌絲塊接種到100 mL的PD培養(yǎng)基(馬鈴薯和葡萄糖)培養(yǎng)，然后在25 ℃下靜置培養(yǎng)27 d，用雙層紗布濾去菌絲體，再用雙層濾紙過濾獲得液體代謝物備用。接種時(shí)將液體代謝物均勻噴霧到5年生健康松苗上，定期檢查松針的感病情況，以此獲得感病植株與樣品。

按照上述方法，10束待測(cè)松針分別來自：①有蟲有病(共寄生)，將攜有大量初孵若蚧的松枝掛放在5年生健康松苗上，5 d后采用噴霧法接入枯斑擬盤多毛孢菌，待松針出現(xiàn)初期癥狀后，選擇并標(biāo)記有蟲有病的松針作為試驗(yàn)材料；②有蟲無病(獨(dú)寄生/蟲)，按上述方法只接入松突圓蚧若蚧；③無蟲有病(獨(dú)寄生/病)，按上述方法只接入枯斑擬盤多毛孢菌；④健康松針，作為對(duì)照。同時(shí)，確保在同一時(shí)段和相同氣象條件下取樣。

1.2 粗酶液的制備

稱取待測(cè)松針樣品0.1 g，剪碎放入研缽中，分多次向研缽中加入適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿。殘?jiān)儆? mL磷酸緩沖液提取1次，勻漿分裝倒入離心管。以4000 r·min-1低溫離心15 min，上清液即為粗酶液，用磷酸緩沖液定容至10 mL，收集上清液于4 ℃冰箱備用。

1.3 過氧化物酶活性測(cè)定

過氧化物酶活性測(cè)定采用紫外分光法[7-12]。

1.3.1 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化 隨機(jī)抽取采集到的試驗(yàn)針葉樣品0.1 g。取A、B 2支試管，隨機(jī)抽取粗酶液，按照表1配制反應(yīng)溶液。迅速將2支試管中的溶液混合均勻后倒入比色杯，置于分光光度計(jì)樣品室內(nèi)，立即開啟秒表記錄時(shí)間，于470 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，每隔10 s讀數(shù)1次。一直讀取至250 s，并記錄數(shù)據(jù)。依據(jù)吸光值隨反應(yīng)時(shí)間的變化曲線即底物的反應(yīng)進(jìn)度來確定反應(yīng)時(shí)間。

表1 預(yù)備試驗(yàn)試劑添加量

1.3.2 過氧化物酶活性 測(cè)定時(shí)取A、B 2支試管，按照表1配制反應(yīng)溶液。然后將2支試管中的溶液混合均勻后倒入比色杯，置于分光光度計(jì)并在470 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，每隔10 s讀數(shù)1次記錄數(shù)據(jù)直至2 min。每處理重復(fù)3次。

本試驗(yàn)以鄰甲氧基苯酚(即愈創(chuàng)木酚)為過氧化物酶的底物，在該酶作用下，H2O2可將鄰甲氧基苯酚氧化成紅棕色的4-鄰甲氧基苯酚在470 nm波長(zhǎng)處有最大光吸收，依據(jù)吸光度變化斜率即可確定過氧化物酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

各吸光值由3次重復(fù)樣品計(jì)算而得，采用Office Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)變換和初步分析。計(jì)算公式參照研究文獻(xiàn)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

從圖1可以看出，吸光度值在0～2 min內(nèi)呈先小幅上升后緩慢下降，最終趨于一個(gè)臨界值。推測(cè)這一吸光值呈現(xiàn)大幅下降趨勢(shì)現(xiàn)象與底物反應(yīng)殆盡有關(guān)，反應(yīng)宜在前2 min內(nèi)完成效果最好，因此后續(xù)測(cè)定的反應(yīng)時(shí)間為2 min。

2.2 POD活性水平

從測(cè)定的POD活性水平看，所有處理組POD活性都明顯高于對(duì)照(圖2)，表明病、蟲無論是共寄生還是獨(dú)寄生都會(huì)誘導(dǎo)POD活性上升。但3種處理POD活性比較發(fā)現(xiàn)，共寄生的POD活性比松突圓蚧獨(dú)寄生略高，僅為其POD活性的1.37倍；共寄生POD活性卻是枯斑擬盤多毛孢菌獨(dú)寄生POD活性的5.10倍，相差349.7個(gè)酶活性單位；在各自獨(dú)寄生處理后，松突圓蚧獨(dú)寄生的POD活性水平是枯斑擬盤多毛孢菌獨(dú)寄生的POD活性的3.72倍，二者相差232個(gè)酶活性單位。表明松突圓蚧危害在誘導(dǎo)POD活性過程中具主導(dǎo)作用，而枯斑擬盤多毛孢菌的誘導(dǎo)作用相對(duì)較弱。

二者共寄生的POD實(shí)測(cè)值435.0 U·g-1·min-1；但若將獨(dú)寄生蟲、獨(dú)寄生病的POD活性進(jìn)行簡(jiǎn)單相加，得到POD活性的理論值為402.8 U·g-1·min-1，低于實(shí)測(cè)值。表明松突圓蚧、枯斑擬盤多毛孢菌在誘導(dǎo)POD活性上升過程中存在聯(lián)合增效作用或互惠共利效應(yīng)。

2.3 POD活性的變化過程與趨勢(shì)

從反應(yīng)過程來看，各處理的吸光值—時(shí)間的線性擬合斜率代表POD活性水平(圖3)。共寄生所誘導(dǎo)的吸光值明顯高于其他處理，且變化斜率最大(K=-0.0803)，反應(yīng)最為敏感；然后依次是有蟲無病(K=-0.0443)、無蟲有病(K=-0.0183)；無蟲無病(K=0.0018)的變化最為平緩，趨勢(shì)最小，表明不存在明顯的活性變化。比較數(shù)據(jù)趨勢(shì)及線性模擬的相關(guān)系數(shù)，有蟲有病(R2=0.8969，P<0.05)的數(shù)據(jù)波動(dòng)最大，因而線性相關(guān)系數(shù)最??；無蟲有病(R2=0.9731，P<0.05)相關(guān)系數(shù)最高；有蟲無病(R2=0.9314，P<0.05)與無蟲無病(R2=0.9486，P<0.05)的相關(guān)系數(shù)較為接近。

3 結(jié)論與討論

3.1 病蟲共寄生比獨(dú)寄生具有更高的危害水平

一般地，寄主植物在遭受機(jī)械損傷或病蟲危害后，都會(huì)在形態(tài)上在其受傷部位形成愈傷組織，在生理上誘導(dǎo)防御反應(yīng)等，如改變植物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和次生物質(zhì)的組成[13]；膜系統(tǒng)也會(huì)受到破壞并使電導(dǎo)率上升[14]，而體內(nèi)抗氧化酶系(POD、SOD、CAT、PPO、GSH)等的活性較大幅度增加可緩解逆境脅迫對(duì)膜系統(tǒng)的傷害[14-17]，這是植物對(duì)外界脅迫應(yīng)答的典型生理過程。松突圓蚧、枯斑擬盤多毛孢菌無論是單獨(dú)寄生還是共寄生馬尾松的松針，都會(huì)誘導(dǎo)其松針內(nèi)的POD活性增強(qiáng)；但從三者活性變化的程度來看，共寄生所誘導(dǎo)的POD活性呈現(xiàn)了“1+1>2”的特點(diǎn)，即當(dāng)二者共存條件下，松針內(nèi)POD活性高于二者各自獨(dú)寄生條件下的理論總和，表明共寄生比獨(dú)寄生對(duì)松針具有更高的危害水平，可能是二者共同寄生松針誘導(dǎo)植物抗性的疊加效應(yīng)。

3.2 松突圓蚧在共寄生體系中對(duì)POD活性誘導(dǎo)具有主導(dǎo)作用

松突圓蚧與枯斑擬盤多毛孢菌無論是共寄生還是獨(dú)寄生都會(huì)誘導(dǎo)受害針葉POD活性上升，但上升的水平則各不相同。涉及蟲害的2種處理的POD活性明顯高于病原單獨(dú)寄生的處理，表明蟲害對(duì)POD活性誘導(dǎo)具有主導(dǎo)作用，而病害對(duì)POD活性誘導(dǎo)作用相對(duì)較小。與前人的研究相比，有關(guān)單一病害或蟲害對(duì)植株危害后誘導(dǎo)抗氧化酶系的研究頗多[14-20]，如濕地松經(jīng)松針褐斑病菌毒素處理后，PAL、PPO與SOD 活性呈現(xiàn)不同規(guī)律的變化[14]；毛白楊接種野生根癌農(nóng)桿菌后，會(huì)誘導(dǎo)POD等酶活性提高[12]；棉蚜取食可誘導(dǎo)棉花多酚氧化酶和過氧化物酶的活性增加[17]。但涉及二者共寄生及互作下的抗逆酶系研究較少，無法進(jìn)行類似研究的比較。至于松突圓蚧在共寄生體系產(chǎn)生主導(dǎo)作用的機(jī)制，尚需進(jìn)一步深入研究。

3.3 松突圓蚧與枯斑擬盤多毛孢菌在共寄生體系中具有互利關(guān)系

本研究表明，松突圓蚧與枯斑擬盤多毛孢菌在誘導(dǎo)POD活性上升過程中存在聯(lián)合增效作用或互惠共利效應(yīng)；野外調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，枯斑擬盤多毛孢菌一般在新的松針抽生不久先行侵入葉鞘外部，而松突圓蚧待新抽生松針葉鞘松散后才大量侵入葉鞘內(nèi)部，可能與新抽松針葉鞘包裹緊密而不易侵入內(nèi)部有關(guān)。為此推測(cè)二者互利模式可能為：枯斑擬盤多毛孢菌侵入松針導(dǎo)致直接危害，還突破了松針的物理防御，為松突圓蚧侵入創(chuàng)造了便利條件；松突圓蚧侵入后具有更高的危害水平，進(jìn)一步突破松樹的防御體系并減弱松樹長(zhǎng)勢(shì)，隨后更有利于二者繼續(xù)危害松針并加劇危害程度。但有關(guān)其互利的分子機(jī)制還有待繼續(xù)研究。因此，在防治松突圓蚧過程中，應(yīng)考慮兼治松赤枯病，不但利于控制病害的蔓延危害，而且能減少松突圓蚧的侵入葉鞘內(nèi)的機(jī)率和降低危害程度，達(dá)到進(jìn)一步提高松突圓蚧的防控效果。

當(dāng)然，要揭示松突圓蚧與枯斑擬盤多毛孢菌在共寄生條件下互作的生理生化機(jī)制，還需要對(duì)松針的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及次生物質(zhì)含量等進(jìn)行測(cè)定[13]，抗逆酶的全面分析以及基因水平上的表達(dá)、松樹抗性和環(huán)境因子等方面開展更系統(tǒng)而深入的研究。

[1]童應(yīng)華，楊愛民，張飛萍，等.松突圓蚧危害與馬尾松胸圍關(guān)系的探討[J].福建林業(yè)科技，2004，31(2)：49-51.

[2]戴沿海.松突圓蚧為害對(duì)馬尾松針葉主要次生物質(zhì)的影響[J].生物多樣性，2003，11(2)：162-168.

[3]郭祥.幾種松樹受松突圓蚧危害程度的調(diào)查研究[J].福建林業(yè)科技，2007，34(4)：35.

[4]張飛萍，鐘景輝，陳順立.松突圓蚧在松樹春梢不同部位的分布與動(dòng)態(tài)[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28(6)：819-822.

[5]林立群.松突圓蚧和枯斑擬盤多毛孢共寄生的格局及對(duì)寄主針葉主要化學(xué)成分的影響[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2011.

[6]鄭凌凌，朱天輝.枯斑擬盤多毛孢的培養(yǎng)條件對(duì)其產(chǎn)毒的影響[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28(3)：115-118.

[7]俞煌全，吳家勝.對(duì)松突圓蚧分布區(qū)的四個(gè)階段的分析[J].大眾科技，2007，100(12)：118.

[8]田國(guó)忠，李懷方，裘維蕃.植物過氧化物酶研究進(jìn)展[J].武漢植物學(xué)研究，2001，19(4)：332-344.

[9]王琰，陳建文，狄曉艷.水分脅迫下不同油松種源SOD、POD、MDA及可溶性蛋白比較研究[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2011，20(10)：1449-1453.

[10]劉樹英，安偉，徐欣惟，等.中國(guó)沙棘葉中幾種酶活性測(cè)定[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31(5)：584-586.

[11]黃華，梁宗鎖，韓蕊蓮，等.干旱脅迫條件下油松幼苗生長(zhǎng)及抗旱性研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，19(2)：1-4.

[12]王召元，袁玉欣，杜克久，等.根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtutumefaciens)對(duì)毛白楊五種防御酶系統(tǒng)的影響[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30(4)：31-35.

[13]陳順立，吳暉，鄧招娣，等.馬尾松不同家系營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量與松突圓蚧抗性的關(guān)系[J].林業(yè)科學(xué)，2010，46(2)：87-94.

[14]程方，葉建仁，劉戈，等.松針褐斑病菌毒素處理后濕地松組培苗PAL、PPO、SOD活性變化研究[J].林業(yè)科學(xué)研究，2012，25(4)：521-525.

[15]葉建仁，黃素紅，李傳道，等.抗松針褐斑病濕地松體內(nèi)氧化酶的變化[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，19(1)：8-14.

[16]葉建仁，黃素紅，李傳道，等.磷酸葡萄糖脫氫酶和苯丙氨酸解氨酶與抗松針褐斑病的關(guān)系[J].林業(yè)科學(xué)，1994，30 (5)：430- 436.

[17]呂敏，孫婳婳，高希武.昆蟲取食誘導(dǎo)棉花和玉米多酚氧化酶和過氧化物酶的活性研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28(6)：211-216.

[18]Shize Zhang，Wenyan Fu，Ning Li，et al.Antioxidant responses of Propylaea japonica (Coleoptera：Coccinellidae) exposed to high temperature stress[J].Journal of Insect Physiology，2015(73)：47-52.

[19]Yiyang Yuan，Xin Ke，F(xiàn)ajun Chen，et al.Decrease in catalase activity of Folsomia candida fed a Bt rice diet[J].Environmental Pollution，2011(159)：3714-3720.

[20]Shanfeng Ling，HongZhang.Influences of chlorpyrifos on antioxidant enzyme activities of Nilaparvata lugens[J].Ecotoxicology and Environmental Safety，2013(98)：187-190.

Effect of Co-Parasitism byHemiberlesiapitysophilaandPestalotiafunereaon Peroxidase of Masson Pine Needles

CAI Xiao-ming1，2，CHEN Jia-rong3，LIANG Guang-hong1

(1.FujianAgricultureandForestryUniversity，F(xiàn)uzhou350002，F(xiàn)ujian，China； 2.FuzhouForestryBureauofFujianProvince，F(xiàn)uzhou350005，F(xiàn)ujian，China； 3.YekengState-ownedForestryFarm，Jianou353133，F(xiàn)ujian，China)

HemiberlesiapitysophilaandPestalotiasfunereaare most important species infested masson pine trees in Fujian Province.Both of them were founded frequently in the same pine needle which means they are likely to exist in the same needle.So we just focused on the Peroxidase of needles infested by both of them，one of them only to explore the relationship among the fungi，pest and host.The peroxidase was extracted from five-year old needle and measured based on ultraviolet absorption method with control of health needles.The results showed that activity order of Peroxidase was co-parasitism，H.pitysophilaonly，P.funereaand control.Peroxidase activity was always induced to increase after the needles were inoculated，no matter how the treatment was.But the treatment concerned withH.pitysophila，including co-parasitism andH.pitysophilaonly，were much higher than treatment ofP.funereaonly，namely，they were 5.10 and 3.72 times asP.funereaonly，which means pest infestation played more important role during the process of co-parasitism.Theoretical value of pest only and fungi only was still lower than that of co-parasitism，which means each of them played a mutually beneficial role which leads to superimposed effect.Therefore，to improve and enhance the control effect ofH.pitysophila，prevention ofP.funereais also needed to be taken into consideration.

Hemiberlesiapitysophila；Pestalotiasfunerea；Pinusmassoniana；co-parasitism；peroxidase

10.13428/j.cnki.fjlk.2016.02.016

2015-08-12；

2015-08-23

福建省自然科學(xué)基金(2011J01070)

蔡曉明(1975—)，男，福州永泰人，福州市林業(yè)局高級(jí)工程師，在職碩士，從事林業(yè)有害生物防治檢疫與林業(yè)科技推廣工作。E-mail：457118557@qq.com。

梁光紅(1975—)，男，福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院副教授，碩士生導(dǎo)師，從事森林昆蟲學(xué)研究。E-mail：fjlhg@126.com。

S791.248；S763

A

1002-7351(2016)02-0085-05