敖 敦，楊海峰，王 雷，馬月林

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學林學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

沙柳組培技術(shù)初探

敖 敦，楊海峰，王 雷，馬月林

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學林學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

以沙柳莖段為外植體，開展不同基本培養(yǎng)基，植物生長調(diào)節(jié)劑ZT、NAA組合的篩選試驗。結(jié)果表明，在ZT、NAA組合，沙柳幼芽高生長最佳培養(yǎng)基為1/2 WPM+ZT 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，沙柳最佳生根培養(yǎng)基為1/2 WPM+ZT 0.1 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1。在參試的MS、WPM、B5、DCR、White 5種培養(yǎng)基中，最適合沙柳幼芽莖段誘導及生根的培養(yǎng)基為WPM，葉片較綠，根較長，生長較快。

沙柳；組織培養(yǎng)；幼芽生長；生根率

沙柳(Salixpsammophila)別名北沙柳，為楊柳科落葉叢生直立灌木或小喬木。樹高3～5 m，枝細長、有毛、后變光滑、帶紫色；芽銳尖，具有柔毛[1]。沙柳喜濕潤，容易繁殖，適應性廣[2]。同時，可用作燃料、優(yōu)質(zhì)的家畜飼料及纖維板、刨花板、紡織、造紙的重要原料[3]。沙柳廣泛分布于鄂爾多斯、東阿拉善、陜西北部及寧夏東部[4]，是防風固沙的優(yōu)良樹種，是高速公路、鐵路等路基護坡、礦山植被恢復的主要樹種。沙柳具有抗逆性強，耐寒，耐旱，耐風沙鹽堿等特點，是我國沙荒地區(qū)造林的優(yōu)良樹種之一，應用前景十分廣闊。

沙柳人工豐產(chǎn)栽培及扦插育苗等方面的研究已有大量報道[5-10]。在柳樹組織培養(yǎng)方面，國外Gr?nroos等[11]曾利用雌蕊及花序作為外植體進行愈傷誘導、體細胞胚胎發(fā)生的研究；還開展了不同基本培養(yǎng)基的對比試驗[12-13]，認為基本培養(yǎng)基對于某些特定基因型具有一定優(yōu)勢；在生長調(diào)節(jié)劑的篩選研究發(fā)現(xiàn)離體培養(yǎng)的形態(tài)發(fā)生效率更依賴于參試的基因型。國內(nèi)對柳屬的組織培養(yǎng)研究相對較多[14-19]，對沙柳的組織培養(yǎng)研究極少，杜喜梅等[3]采用1年生沙柳春季萌發(fā)嫩枝為外植體，篩選出較適宜的分化增殖培養(yǎng)基與繼代培養(yǎng)基；楊海峰[20]在沙柳組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)了適宜沙柳嫩枝誘導與根誘導的較適宜培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)劑配比，發(fā)現(xiàn)WPM更適宜沙柳嫩枝的組織培養(yǎng)，葉片較綠，根較長，生長較快。

本研究以沙柳休眠芽為外植體，誘導無菌嫩枝，采用ZT、NAA組合進行植物生長調(diào)節(jié)劑濃度篩選及基本培養(yǎng)基的篩選，摸索適合沙柳無菌芽誘導的基本培養(yǎng)基類型及適合的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度。本研究可為沙柳優(yōu)良無性系組培快繁體系的建立，以及利用沙柳快繁體系展開沙柳的細胞遺傳學研究建立基因工程轉(zhuǎn)化提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

試材采自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學苗圃，種源納林河，樹皮顏色灰綠，雄株，編號：08-3。以沙柳休眠的1～2年生木質(zhì)化莖段為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 沙柳外植體休眠枝莖段消毒及誘導 將枝條用洗潔精在流水下清洗后剪成約2～3 cm莖段，每個莖段保留1～2個休眠芽放入燒杯中，洗潔精水浸泡30 min，再繼續(xù)清水沖洗3 h，不斷震蕩洗滌。莖段移入滅菌超凈工作臺，先用75%酒精消毒，再用2%次氯酸鈉加入幾滴吐溫，不停振蕩搖晃消毒2次，用無菌水清洗，期間轉(zhuǎn)入新無菌瓶中，減少污染幾率。無菌水清洗至沒有泡沫為止。然后將消毒后的莖段兩端切除3～5 mm插入培養(yǎng)基中，所有培養(yǎng)基均附加蔗糖20 g·L-1、植物凝膠3 g·L-1，調(diào)節(jié)pH至5.8，封口，置于25 ℃，16 h光照，8 h黑暗條件的光照培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。每天觀察記錄、拍照1次。培養(yǎng)30 d后對苗高進行統(tǒng)計。

1.2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度篩選 選1/2 WPM為基本培養(yǎng)基，植物生長調(diào)節(jié)劑采用ZT、NAA，設(shè)置30個組合，ZT質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1，NAA質(zhì)量濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1。接種選用無菌嫩枝為外植體，切成約2 cm帶芽莖段，接種至培養(yǎng)基。每個組合10瓶，每瓶接種2個外植體，4次重復。

1.2.3 基本培養(yǎng)基的篩選 選用MS、WPM、B5、DCR、White等5種基本培養(yǎng)基，均附加蔗糖20 g·L-1、植物凝膠3 g·L-1，添加NAA 2 mg·L-1+6-BA 0.05 mg·L-1后調(diào)節(jié)pH至5.8。每個組合10瓶，每瓶接種2個外植體，4次重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙柳無菌苗誘導培養(yǎng)觀察

沙柳莖段培養(yǎng)第5天，葉腋處腋芽開始萌動，鱗芽增大，長出綠色芽點；隨后14 d左右，嫩枝基部可見紅色根尖，腋芽逐漸伸長，深綠色幼嫩葉片逐漸展開；培養(yǎng)45 d時，側(cè)芽平均高度約為4 cm，平均根長約為6 cm(圖1)。

2.2 ZT、NAA不同濃度組合對沙柳幼芽高生長的影響

培養(yǎng)30 d后苗高統(tǒng)計結(jié)果見表1。由表1可知：在ZT 0.1 mg·L-1時，隨NAA質(zhì)量濃度增大，苗高表現(xiàn)為降低→增高→再降低的趨勢；在ZT 0.5～1.0 mg·L-1時，隨NAA質(zhì)量濃度增大，苗高表現(xiàn)為先增高后降低的趨勢，苗高最高達到1.7 cm；在ZT 1.5～2.0 mg·L-1時，隨NAA質(zhì)量濃度增大，苗高表現(xiàn)降低的趨勢?？傮w而言，隨著ZT質(zhì)量濃度的增大，沙柳嫩枝高生長呈現(xiàn)顯著下降趨勢，可見，ZT對沙柳幼苗的高生長抑制效果顯著。最佳幼芽高生長培養(yǎng)基為1/2 WPM+ZT 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1。

2.3 ZT、NAA不同濃度組合對沙柳嫩枝生根的影響

培養(yǎng)30 d后沙柳嫩枝生根率統(tǒng)計結(jié)果見表1。從表1可以看出，隨著ZT濃度的增加，其生根率出現(xiàn)下降趨勢，在ZT為0.1～0.5 mg·L-1時，生根率隨著NAA的增加呈現(xiàn)增高趨勢，說明NAA對生根有促進作用；在ZT為2.0 mg·L-1時，生根率均為0，說明高濃度的ZT對沙柳嫩枝生根的抑制作用顯著。最適宜的嫩枝生根培養(yǎng)基為1/2 WPM+ZT 0.1 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1+pH 5.8。

2.4 不同基本培養(yǎng)基對沙柳幼芽莖段誘導及生長的影響

在5種基本培養(yǎng)基培養(yǎng)9 d后，葉腋處腋芽部分開始萌動，出現(xiàn)淡綠色芽尖，莖段基部部分開始出現(xiàn)紅色根尖。在WPM培養(yǎng)基上，沙柳生長速度快，葉片比較綠，且沒有出現(xiàn)葉片黃化現(xiàn)象。在MS培養(yǎng)基，沙柳生長速度較慢，葉片前期生長比較綠，但后期逐漸黃化。而DCR、White、B5等培養(yǎng)基，沙柳生長速度緩慢，而且均出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。

2.5 不同基本培養(yǎng)基對沙柳嫩芽生根的影響

生根培養(yǎng)30 d后發(fā)現(xiàn)，WPM、MS、DCR等3種基本培養(yǎng)基上的嫩枝生根率達到了100%，而B5和White培養(yǎng)基上的嫩枝生根率只有達到40%。綜合沙柳莖段萌生嫩枝與長勢及根的長勢，認為WPM培養(yǎng)基為沙柳幼芽莖段生根的最佳基本培養(yǎng)基。

3 結(jié)論與討論

在ZT、NAA組合中沙柳嫩枝幼芽高生長最佳培養(yǎng)基為1/2 WPM+ZT 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1。沙柳嫩枝最佳生根培養(yǎng)基為1/2 WPM+ZT 0.1 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1。選用的5種基本培養(yǎng)基中沙柳嫩枝生長的最佳基本培養(yǎng)基為WPM。

細胞分裂素不僅能促進植物細胞的分裂和擴大，而且在芽分化的誘導、葉綠體的發(fā)育、養(yǎng)分的運輸和分配、細胞衰老的抑制等方面都表現(xiàn)出顯著的效果[20]。生長素能促進根和莖的發(fā)育和生長、器官的衰老、維管束組織的形成和分化發(fā)育，以及植物的向地和向光反應等[21]。但不同種類的生長素和細胞分裂素對植物生長的影響不一定相同。本研究發(fā)現(xiàn)隨著ZT濃度的增加幼芽的高生長受抑制，其生根率也明顯下降。一般低濃度的細胞分裂素可促進高生長，而高濃度的細胞分裂素促進側(cè)芽生長而抑制高生長，但在本研究中，即使低濃度的ZT也表現(xiàn)出對高生長的抑制作用，其原因可能是沙柳對ZT非常敏感。在前期研究中[20]，發(fā)現(xiàn)低濃度6-BA對嫩枝高生長和生根表現(xiàn)為促進作用，高濃度時顯示出抑制作用，因此，6-BA可作為一種更適合的細胞分裂素應用于沙柳的組織培養(yǎng)研究中，應謹慎采用ZT。對于細胞生長素的應用，本研究主要采用了NAA，初步研究認為NAA對沙柳幼苗生長及生根均有較好的促進作用，與前期研究結(jié)果一致[20]。在今后的研究中，可借鑒杜喜梅等[3]采用的6-BA與KT組合，有可能取得更好的培養(yǎng)效果。

表1 沙柳嫩枝在1/2 WPM+ZT+NAA培養(yǎng)基上生長狀況統(tǒng)計

*：同列不同小寫字母為0.05水平上差異顯著。下同。

表2 不同基本培養(yǎng)基上沙柳嫩枝莖段生長狀況比較

基本培養(yǎng)基中含有植物生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基的類型與組織培養(yǎng)的成功有很大關(guān)系。本研究采用MS、WPM、B5、DCR、White 5種基本培養(yǎng)基對沙柳嫩枝的組織培養(yǎng)差異較大。WPM是一種低鹽培養(yǎng)基，適應木本植物生長。本研究也發(fā)現(xiàn)該培養(yǎng)基比較符合沙柳的生長，長勢較好，生長較快，這可能由于沙柳生長在我國西北地區(qū)，生長環(huán)境十分貧瘠，沙柳已適應低養(yǎng)分的生長環(huán)境。在高鹽培養(yǎng)基MS中培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，沙柳嫩枝長勢低于WPM培養(yǎng)基，生長較慢，所以MS培養(yǎng)基可能不適合沙柳的組織培養(yǎng)。在培養(yǎng)基B5中，沙柳生長較慢，B5中含有較低的銨，這可能對沙柳的生長有抑制作用。在低鹽培養(yǎng)基DCR、White等培養(yǎng)基中，沙柳生長也較差，可能與培養(yǎng)基本身營養(yǎng)成分的差異有關(guān)，如DCR中K元素含量低，而適宜沙柳生長的WPM培養(yǎng)基中含有大量的K，可能是K、S等含量較低導致DCR對沙柳生長作用不大。在杜喜梅等[3]對沙柳以及余如剛等[19]對旱柳的組培研究中發(fā)現(xiàn)生長較好的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，與本研究所發(fā)現(xiàn)WPM為適宜培養(yǎng)基有所差異，這有可能與采用的沙柳基因型以及外植體差異有關(guān)。

[1]丁志剛，任安海，蘇亮明.淺談沙柳的生物學特性，自然分布及平茬復壯技術(shù)[J].內(nèi)蒙古林業(yè)調(diào)查設(shè)計，2005，28(增刊)：36-39.

[2]李維向，劉朝霞，閆偉，等.沙柳優(yōu)良品系選育的研究[J].中國沙漠，2008，28(4)：679-684.

[3]杜喜梅，燕麗萍，王太明，等.沙柳組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究[J].山東林業(yè)科技，2006(6)：7-8.

[4]米志英，高永，弓彩霞，等.庫布齊沙漠沙柳林復壯更新技術(shù)措施研究[J].干旱區(qū)資源與環(huán)境，2008，22(6)：186-189.

[5]蒼久和.沙柳的人工栽培豐產(chǎn)技術(shù)[J].中國林副特產(chǎn)，2004，2(69)：34.

[6]王開芳，趙萍，侯立群，等.沙柳引種扦插育苗試驗[J].山東林業(yè)科技，2006(3)：37-38.

[7]安保，白永祥，田志.沙柳生物學特性與造林技術(shù)研究[J].內(nèi)蒙古林業(yè)科技，2003(增刊)：24-26.

[8]何麗君，慈忠玲，李健軍.沙柳莖葉結(jié)構(gòu)的比較解剖學觀察[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學報，2000，21(1)：128-132.

[9]許鳳，鐘新春，孫潤倉，等.沙柳的超微結(jié)構(gòu)及其木素微區(qū)分布的研究[J].中國造紙學報，2005，20(1)：6-9.

[10]寧明世，李奇，侯春艷.以無性系育種與等位酶技術(shù)對沙柳優(yōu)良無性系的選擇研究[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學報，2004，25(3)：18-23.

[11]Lotta Gr?nroos.Callus Production and Somatic Embryogenesis from Floral Explants of Basket Willow (Salix viminalis L.)[J].Journal of Plant Physiology，1989(134)：558-566.

[12]O.S.Mashkina.Method of Clonal Micropropagation of Different Willow.Species and Hybrids[J].Applied Biochemistry And MicrobioloGgy，2010，46(8)：769-775.

[13]Lottabergma.Effects of N6-benzyladenine on shoots of five willow clones(Salix spp.) cultured in vitro[J].Plant Cell Tissue Organ Culture，1985(4)：135-144.

[14]沈周高，項艷，蔡誠，等.3個楊樹品種葉片再生體系的建立[J].中國農(nóng)學通報，2006，22(11)：90-96.

[15]郭瑤，吳建慧.蒙古柳的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學通訊，2009，45(12)：1211-1212.

[16]王向軍，陶晶，張士俊，等.鉆天柳腋芽組培快繁技術(shù)的研究[J].吉林林業(yè)科技，2006，35(2)：8-11.

[17]關(guān)亞麗，陳英，黃敏仁.簸箕柳組織培養(yǎng)初步研究[J].海南師范大學學報：自然科學版，2009，22(2)：204-208.

[18]唐效蓉，李午平，黎玉才.雜交柳優(yōu)良無性系組培快繁技術(shù)研究[J].湖南林業(yè)科技，2002，29(4)：28-30.

[19]余如剛，杜雪玲，夏陽，等.旱柳Q106組織培養(yǎng)及快繁體系的建立[J].草原與草坪，2005(5)：57-59.

[20]楊海峰.沙柳休眠芽及嫩枝離體培養(yǎng)的初步研究[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學報，2014，35(2)：67-72.

[21]呂劍，喻景權(quán).植物生長素的作用機制[J].植物生理學通訊，2004，40(5)：624-628.

The Initial Exploration on Tissue culture ofSalix

AO Dun，YANG Hai-feng，WANG Lei，MA Yue-lin

(CollegeofForestry，InnerMongoliaAgriculturalUniversityHohhot010019，Neimenggu，China)

Taking theSalixbuds as explants，screening experiment the different basic culture medium and ZT、NAA combination.The results showed that in the ZT、NAA combination，medium 1/2 WPM+ZT 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1is suitable for shoots growth and the best suitable rooting medium is 1/2 WPM+ZT 0.1 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1.The results showed that WPM basic medium is suitable for shoots induction and rootage growth between the MS、WPM、B5、DCR、White five basic medium，buds with the green leaves，fast roots growth.

Salixpsammophila；tissue culture；shoots growth；rooting rates

2015-03-09；

2015-04-17

中國林業(yè)科學研究院中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金(胡楊功能基因組研究平臺構(gòu)建和功能基因發(fā)掘，CAFYBB2011001)；國家自然科學基金資助項目(利用擬南芥突變體鑒定木材發(fā)育相關(guān)基因功能研究，31360187)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學?？茖W研究項目(胡楊大片段DNA轉(zhuǎn)化擬南芥研究，NJZY13076)

敖敦(1989—)，女(蒙古族)，內(nèi)蒙古赤峰人，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學林學院碩士研究生，從事園林植物與人居環(huán)境研究。E-mail：aodun520@sina.cn。

楊海峰(1975—)，男(蒙古族)，內(nèi)蒙古呼和浩特人，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學林學院副教授，博士，從事林木遺傳育種、林木基因工程的研究與教學工作。E-mail：yang_hf888@163.com。

10.13428/j.cnki.fjlk.2016.01.018

S723.1+32.6

A

1002-7351(2016)01-0080-04