蔡守平

(福建省林業(yè)科學(xué)研究院、國(guó)家林業(yè)局南方山地用材林培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350012)

不同球孢白僵菌菌株對(duì)星天牛幼蟲(chóng)的致病力

蔡守平

(福建省林業(yè)科學(xué)研究院、國(guó)家林業(yè)局南方山地用材林培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350012)

為篩選出可用于星天牛生物防治的高致病力菌株，測(cè)定了8株球孢白僵菌菌株(BbMaA-01、BbMQ-04、BbMQ-07、BbQZ-01、BbQZ-02、BbYXTR-03、BbTK-02、BbXJ-11)的生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢量及其對(duì)星天牛幼蟲(chóng)的致病力。結(jié)果表明：不同球孢白僵菌菌株的生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量和對(duì)星天牛幼蟲(chóng)致病力差異十分顯著。采用浸漬法接種15 d后，不同球孢白僵菌菌株對(duì)星天牛幼蟲(chóng)累計(jì)致死率(幼蟲(chóng)死亡率)在70%～100%之間，其中BbXJ-11、BbQZ-02菌株對(duì)幼蟲(chóng)的累計(jì)死亡率最高，均達(dá)100%；且接種后星天牛幼蟲(chóng)的僵蟲(chóng)率(感染率)也分別高達(dá)90%、80%；致死中時(shí)(LT50)較短，分別為5.38 d、5.83 d。研究結(jié)果表明BbXJ-11、BbQZ-02菌株對(duì)星天牛幼蟲(chóng)的致病力較強(qiáng)，同時(shí)2個(gè)菌株的生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)孢量高，故可作為防治星天牛的優(yōu)良菌株加以推廣應(yīng)用。

球孢白僵菌；星天牛；致死中時(shí)(LT50)；僵蟲(chóng)率；生物學(xué)特性

星天牛(Anoplophorachinensis)是一種危險(xiǎn)性林業(yè)有害生物，其分布范圍廣，寄主種類多，且防治困難，是林業(yè)、園林上重要的蛀干害蟲(chóng)[1-2]，在東南沿海防護(hù)林木麻黃(Casuarinaspp.)林中，星天牛普遍發(fā)生，危害嚴(yán)重，部分林分有蟲(chóng)株率高達(dá)50%以上，受害后木麻黃植株極易風(fēng)折或死亡，嚴(yán)重影響了木麻黃海防林的防護(hù)效益持續(xù)發(fā)揮[3]。由于星天牛幼蟲(chóng)蛀干危害，常規(guī)防治手段往往較難奏效。生物防治是防治該蟲(chóng)的有效手段，前人曾嘗試?yán)盟故暇€蟲(chóng)(Steinernemaspp.)[4]、川硬皮腫腿蜂(Sclerodermasichuanensis)[5]、球孢白僵菌(Beauveriabassiana)[6-7]等生防資源防治星天牛幼蟲(chóng)，取得了一定效果。球孢白僵菌是一種應(yīng)用最廣泛的蟲(chóng)生真菌，已知寄主昆蟲(chóng)達(dá)200種以上，已實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)[8-9]，蟲(chóng)生真菌被認(rèn)為是蛀干害蟲(chóng)防治中最有前途的生防資源之一，目前已經(jīng)在多種蛀干害蟲(chóng)如松墨天牛(Monochamusalternatus)[10]、光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)[11]、蕭氏松莖象(Hylobitelusxiaoi)[12-13]等的生物防治中廣泛應(yīng)用。本文在比較不同球孢白僵菌菌株的生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步測(cè)定了8個(gè)菌株對(duì)星天牛幼蟲(chóng)的致病力，旨在篩選出可用于防治星天牛幼蟲(chóng)的致病力高、生產(chǎn)性能良好的白僵菌菌株。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

8株球孢白僵菌菌株的來(lái)源見(jiàn)表1，均保存于福建省林業(yè)科學(xué)研究院森林保護(hù)研究所實(shí)驗(yàn)室，采用斜面低溫保存。菌株的準(zhǔn)備參見(jiàn)蔡守平等[14]、何學(xué)友等[15]的方法，菌株在SDAY平板培養(yǎng)15 d，菌落表面產(chǎn)生大量的白色或乳黃色孢子后備用。

表1 供試球孢白僵菌菌株來(lái)源

1.2 菌株生長(zhǎng)速度及產(chǎn)孢量測(cè)定

參考前人研究方法[14-16]，取各菌株少量孢子，在PPDA平板上劃線，然后置于(25±1) ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d(略長(zhǎng)出菌絲)，用直徑0.4 cm、滅過(guò)菌的打孔器在線上打取菌落塊，然后將菌落塊倒貼于PPDA平板培養(yǎng)基中央，接種后平板用封口膜封好，在平板背面以接種點(diǎn)為中心畫(huà)十字叉，于(25±1) ℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，每天測(cè)量菌落直徑，共測(cè)量15 d。每菌株設(shè)3次重復(fù)。15 d后用直徑為1 cm的打孔器于菌落中心至邊緣1/2處打取菌碟，然后取出置于定量的0.03%吐溫-80溶液中，用高速振蕩器充分振蕩，配制成孢子懸浮液，適當(dāng)稀釋后用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢懸液的濃度并折算成單位面積產(chǎn)孢量。

1.3 白僵菌對(duì)星天牛幼蟲(chóng)的致病力測(cè)定

1.3.1 試蟲(chóng)飼養(yǎng) 試蟲(chóng)飼養(yǎng)方法參考蔡守平等[14，17]方法，星天牛成蟲(chóng)采集地點(diǎn)為惠安赤湖國(guó)有防護(hù)林場(chǎng)凈峰工區(qū)的木麻黃林，幼蟲(chóng)飼養(yǎng)在福建省林科院森保所實(shí)驗(yàn)室完成，待幼蟲(chóng)飼養(yǎng)至3齡時(shí)，即用于生物測(cè)定。

1.3.2 生物測(cè)定 配制一定量的0.03%吐溫-80溶液，然后高溫滅菌，冷卻后備用。從產(chǎn)孢良好的各菌株的平板上輕輕刮取菌落表層的孢子置于上述吐溫-80溶液中，配制成終濃度為107孢子·mL-1的孢子懸浮液；將3齡試蟲(chóng)輕輕取出(若蟲(chóng)體上粘有少量的人工飼料，則需用細(xì)毛刷輕輕清理)，在上述孢子懸浮液中浸漬15 s，對(duì)照以滅過(guò)菌的0.03%吐溫-80溶液替代孢懸液。每個(gè)處理(菌株)接種30頭天牛幼蟲(chóng)，設(shè)3次重復(fù)；接種后將天牛幼蟲(chóng)放置于黑暗的培養(yǎng)箱中(室內(nèi)溫度變幅為25～32 ℃)。接種后每天觀察試蟲(chóng)死亡情況，蟲(chóng)死后保濕培養(yǎng)，觀察是否有菌絲長(zhǎng)出及產(chǎn)孢，以確定是否為白僵菌感染致死，統(tǒng)計(jì)死亡率及僵蟲(chóng)率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件整理，統(tǒng)計(jì)分析在DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)平臺(tái)上進(jìn)行。采用死亡率-時(shí)間機(jī)率值分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，即以時(shí)間(d)的對(duì)數(shù)值為x，將死亡率轉(zhuǎn)換為機(jī)率值，并以機(jī)率值為y，模擬出毒力回歸方程和致死中時(shí)(LT50)，不同菌株之間的致死中時(shí)差異采用致死中時(shí)比例測(cè)定方法來(lái)檢驗(yàn)[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同球孢白僵菌菌株的生長(zhǎng)速度及產(chǎn)孢量

不同球孢白僵菌菌株的菌落生長(zhǎng)速度及產(chǎn)孢量比較見(jiàn)表2。從表2可以看出，在5 d時(shí)，各菌株的菌落大小差異不顯著；而到了10 d時(shí)，不同菌株的菌落直徑顯示出了顯著的差異；而到15 d時(shí)，差異更為顯著，其中BbXJ-11菌株在15 d時(shí)菌落直徑為(6.2±0.1) cm，顯著大于其他菌株，其次是BbQZ-02、BbMQ-04、BbTK-02、BbYXTR-03菌株，其15 d菌落直徑也均在5.2 cm以上；菌落直徑較小的BbMaA-01、BbMQ-07、BbQZ-01菌株15 d的菌落直徑均不足5 cm。從產(chǎn)孢量上看，不同菌株間也存在著顯著差異，其中產(chǎn)孢最高的仍然是BbXJ-11菌株，產(chǎn)孢量達(dá)(1.56±0.04)×108孢子·cm-2，顯著大于其他菌株；其次是BbQZ-02、BbYXTR-03菌株，產(chǎn)孢量分別為(1.38±0.06)×108、(1.18±0.04)×108孢子·cm-2；產(chǎn)孢量最低的是BbQZ-01菌株，產(chǎn)孢量?jī)H為(0.73±0.05)×108孢子·cm-2。

表2 不同球孢白僵菌菌株的菌落生長(zhǎng)速度及其產(chǎn)孢量比較

*：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；數(shù)據(jù)后不同字母為P=0.05時(shí)Duncan′s新復(fù)極差顯著性檢驗(yàn)。下同。

2.2 星天牛幼蟲(chóng)累計(jì)死亡率

2.2.1 感染反應(yīng) 星天牛幼蟲(chóng)感染白僵菌初期幼蟲(chóng)活動(dòng)力變?nèi)酰?～3 d后隨著病情的發(fā)展，蟲(chóng)體上出現(xiàn)褐色的病斑，蟲(chóng)體皺縮，活動(dòng)力極弱；幼蟲(chóng)死亡后蟲(chóng)體逐漸變僵硬，保濕培養(yǎng)后1～2 d在節(jié)間膜處長(zhǎng)出白色菌絲，慢慢布滿全身，隨后逐漸出現(xiàn)白色或淡乳黃色孢子，最終整個(gè)蟲(chóng)體均布滿粉末狀的分生孢子(圖1)。

2.2.2 累計(jì)死亡率 接種后星天牛幼蟲(chóng)累計(jì)死亡率見(jiàn)圖2。不同菌株接種后，星天牛幼蟲(chóng)累計(jì)死亡率隨時(shí)間的增加而逐漸提高，不同菌株間差異顯著。接種BbXJ-11、BbQZ-02菌株的星天牛幼蟲(chóng)致死速度快，幼蟲(chóng)累計(jì)死亡率較高，死亡高峰期為3～8 d；2個(gè)菌株接種后10 d、13 d，幼蟲(chóng)累計(jì)死亡率分別達(dá)到100%。而死亡率相對(duì)較低的是接種BbTK-02、BbYXTR-03、和BbQZ-01菌株，接種后15 d，星天牛幼蟲(chóng)累計(jì)死亡率分別為70%、70%、73.3%。對(duì)照組15 d時(shí)幼蟲(chóng)累計(jì)死亡率為3.3%。

2.3 不同菌株對(duì)星天牛幼蟲(chóng)的致病力

不同菌株對(duì)星天牛幼蟲(chóng)的致病力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。經(jīng)檢驗(yàn)，8個(gè)菌株對(duì)星天牛幼蟲(chóng)致病力回歸方程擬合程度均達(dá)到了顯著水平，表明時(shí)間與累積死亡率之間存在顯著的關(guān)系。死亡率、僵蟲(chóng)率(感染率)、致死中時(shí)(LT50)可以反映出菌株對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)的致病力[14-16]，接種BbXJ-11、BbQZ-02菌株對(duì)星天牛幼蟲(chóng)的致死率、僵蟲(chóng)率均較高，接種后15 d校正死亡率均達(dá)到100%，僵蟲(chóng)率也分別達(dá)到90%、80%，顯著高于其它菌株；校正死亡率最低的為BbYXTR-03、BbTK-02菌株，低于70%；僵蟲(chóng)率最低的為BbTK-02、BbMQ-07菌株，分別為40%、20%。由表4可知，接種BbXJ-11、BbQZ-02菌株的致死中時(shí)(LT50)顯著小于其它菌株，分別為5.38、5.83 d；其它菌株對(duì)星天牛幼蟲(chóng)的致死中時(shí)(LT50)在7.20～10.23 d之間，均高于BbXJ-11、BbQZ-02菌株。說(shuō)明BbXJ-11、BbQZ-02菌株對(duì)星天牛幼蟲(chóng)的致病力較強(qiáng)。

3 討論與結(jié)論

前人在研究球孢白僵菌對(duì)不同靶標(biāo)害蟲(chóng)致病力的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)不同地理來(lái)源、寄主來(lái)源的菌株對(duì)靶標(biāo)害蟲(chóng)的致病力差異顯著[10，14-15，19-22]，樊美珍等[22]從不同蛀干害蟲(chóng)分離獲得4株球孢白僵菌，通過(guò)生物測(cè)定發(fā)現(xiàn)，各菌株對(duì)原寄主的致病力最強(qiáng)。黃金水等使用防治馬尾松毛蟲(chóng)的白僵菌菌劑對(duì)星天牛進(jìn)行了林間防治，結(jié)果無(wú)效[7]，而其從星天牛幼蟲(chóng)自然感染的僵蟲(chóng)上分離到的白僵菌菌株對(duì)星天牛進(jìn)行了室內(nèi)侵染試驗(yàn)，平均侵染率達(dá)98.5%[6]，同時(shí)比較了該菌株不同使用技術(shù)對(duì)星天牛的防治效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白僵菌粘膏涂孔法效果最佳[6]。但經(jīng)過(guò)多次的繼代培養(yǎng)后，該菌株出現(xiàn)退化現(xiàn)象，后期傳代培養(yǎng)中出現(xiàn)污染而造成菌株的丟失。針對(duì)不同靶標(biāo)害蟲(chóng)篩選出致病力強(qiáng)的菌株是利用蟲(chóng)生真菌進(jìn)行生物防治的關(guān)鍵之一[8-9]。

表3 不同球孢白僵菌菌株對(duì)星天牛幼蟲(chóng)的致病力

表4 不同球孢白僵菌菌株對(duì)星天牛幼蟲(chóng)的LT50和LT95

本研究通過(guò)生物測(cè)定發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源的球孢白僵菌菌株對(duì)星天牛幼蟲(chóng)的致病力存在顯著差異，其中以BbXJ-11和BbQZ-02菌株對(duì)星天牛幼蟲(chóng)的致死率高、僵蟲(chóng)率(感染率)也高，致死中時(shí)(LT50)較短，說(shuō)明致病力強(qiáng)，同時(shí)這2個(gè)菌株的生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)孢量較高，表明重新篩選出的2個(gè)新菌株對(duì)星天牛幼蟲(chóng)致病力高、生產(chǎn)性狀良好，可作為星天牛生物防治的優(yōu)良菌株加以開(kāi)發(fā)利用。關(guān)于這2個(gè)菌株的高效菌劑研發(fā)、林間大面積推廣應(yīng)用防治技術(shù)等有待今后進(jìn)一步研究。

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Pathogenicity Evaluation of the Entomopathogenic Fungi，BeauveriaBassianaAgainstAnoplophorachinensislarvae

CAI Shou-ping

(FujianAcademyofForestry，TheKeyLaboratoryofTimberForestBreedingandCultivationforMountainousAreasinSouthernChina，F(xiàn)uzhou350012，F(xiàn)ujian，China)

For screening high virulence strains againstAnoplophorachinensislarvae，biological characteristics of 8Beauveriabassianastrains (BbMaA-01，BbMQ-04，BbMQ-07，BbQZ-01，BbQZ-02，BbYXTR-03，BbTK-02，BbXJ-11) and their virulence to larvae of A.chinensis were investigated.The results showed that there were significant differences in hyphal growth，sporulation and virulence among different strains.The mortality rates of the larvae were between 70% and 100% 15 days after inoculation.And the mortality rates inoculated with BbXJ-11 and BbQZ-02 were 100% which were significantly higher than those inoculated with other strains.The muscardine cadaver rates of larvae inoculated with these two strains were also highest，which were 90% and 80%，respectively.The median lethal time (LT50) of BbXJ-11 and BbQZ-02 were 5.38 days and 5.83 days，respectively，which were significantly shorter than those of other strains.The results showed that BbXJ-11 and BbQZ-02 strains had higher virulence toA.chinensislarvae，and could be chosen as efficient biocontrol agents.

Beauveriabassiana；Anoplophorachinensis；median lethal time (LT50)；muscardine cadaver rate；biological characteristics

2015-10-13；

2015-11-26

福建省林業(yè)科學(xué)研究項(xiàng)目(閩林科〔2016〕3號(hào))，福建省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)(2014R1011-2)

蔡守平(1981—)，男，安徽廣德人，福建省林業(yè)科學(xué)研究院高級(jí)工程師，從事森林害蟲(chóng)生物防治研究。E-mail：caishouping@163.com。

10.13428/j.cnki.fjlk.2016.03.001

S476.12；S763.38

A

1002-7351(2016)03-0001-05