鄧紫宇，郭東強(qiáng)，陳健波，羅 清，項(xiàng)東云

(1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530001； 2.國家林業(yè)局中南速生材繁育實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001； 3.廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001；4.廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001)

鄧恩桉遺傳多樣性的ISSR分析

鄧紫宇1，2，3，郭東強(qiáng)1，2，3，陳健波1，2，3，羅 清4，項(xiàng)東云1，2，3

(1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530001； 2.國家林業(yè)局中南速生材繁育實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001； 3.廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001；4.廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001)

探討鄧恩桉親緣關(guān)系及遺傳多樣性，為其種質(zhì)資源利用和分子育種提供參考。利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析鄧恩桉6個(gè)種源遺傳多樣性。篩選出8條特異引物共擴(kuò)增90條清晰條帶，其中76條為多態(tài)條帶，多態(tài)性比率為84.44%，平均等位基因觀察值為1.8444，平均有效等位基因?yàn)?.4928，基因多樣性指數(shù)為0.2879，Shannon信息指數(shù)為0.4306。6個(gè)鄧恩桉種源遺傳相似系數(shù)在0.7271～0.8719之間，平均相似系數(shù)為0.7926。UPGMA聚類分析發(fā)現(xiàn)，在相似系數(shù)為0.80時(shí)鄧恩桉6個(gè)種源可劃分為2個(gè)類群。鄧恩桉種源間遺傳多樣性差異較小，聚類結(jié)果與鄧恩桉種源地理分布密切相關(guān)。

鄧恩桉；遺傳多樣性；ISSR

鄧恩桉(Eucalyptusdunnii)天然分布于澳大利亞新南威爾士州東北部及昆士蘭州東南部，由于分布區(qū)域有限，天然林面積小，在澳大利亞鄧恩桉被列入稀有樹種行列[1-2]。鄧恩桉生長快、干形好、材質(zhì)優(yōu)、具有較好的抗寒性能，可作為紙漿材和輕型建筑用材[3-4]，是我國低海拔夏雨型涼冷地區(qū)桉樹人工林主要栽培樹種。為追求獲得快速的經(jīng)濟(jì)利益，我國桉樹人工林絕大部分采用短輪伐期經(jīng)營，造成了一定的生態(tài)問題，培育桉樹中大徑材不僅可以緩解生態(tài)壓力而且還能提高經(jīng)濟(jì)效益，鄧恩桉是培育中大徑材較好的樹種。

ISSR(inter-simple sequence repeat)是目前應(yīng)用較廣的分子標(biāo)記技術(shù)，其多態(tài)性源于基因組中簡單序列重復(fù)多態(tài)性，克服了RFLP標(biāo)記技術(shù)限制的同時(shí)結(jié)合RAPD和SSR標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，操作簡便、快捷，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定，結(jié)果可靠。

近年來，我國南方受冬季霜凍影響，桉樹人工林損失嚴(yán)重，耐寒桉樹種鄧恩桉成為桉樹育種研究的重點(diǎn)，其研究主要集中在木材性能[5-9]、抗寒性能[10-11]以及植物組織培養(yǎng)[12-13]等方面。分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于桉樹群體多樣性分析[14-17]，曾艷玲等[18]對包括鄧恩桉在內(nèi)的8份桉樹材料進(jìn)行ISSR分析，并將鄧恩桉與赤桉分為一類，但鄧恩桉群體多樣性研究未見報(bào)道。因此，筆者對引種的2個(gè)鄧恩桉天然分布區(qū)內(nèi)6個(gè)種源間伐后保存的優(yōu)良育種群體利用ISSR標(biāo)記技術(shù)探討其親緣關(guān)系及遺傳多樣性，為今后從分子水平開展鄧恩桉材性和抗寒性能研究及合理保護(hù)利用鄧恩桉種質(zhì)資源和良種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料取自環(huán)江縣華山林場雅龍分場2009年建立的鄧恩桉種源試驗(yàn)林(表1)，參試的6個(gè)鄧恩桉種源分別來自昆士蘭州(2個(gè))和新南威爾士州(4個(gè))。

表1 鄧恩桉種源基本信息

1.2 樣品采集及基因組DNA提取

每個(gè)種源選取長勢良好的12個(gè)單株進(jìn)行取樣，共計(jì)72份材料，采集幼嫩葉片立即密封并置于放有冰袋的冰盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室于-72 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

72份材料基因組DNA的提取采用改良CTAB法，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳初步檢測樣品DNA的濃度與純度(圖1)，用核酸檢測儀進(jìn)行定量檢測并將樣品DNA稀釋至50 ng·μL-1，保存于-20 ℃。

圖1 鄧恩桉基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖2 引物UBC848擴(kuò)增結(jié)果

1.3 ISSR-PCR擴(kuò)增

ISSR-PCR反應(yīng)體系經(jīng)過比較和優(yōu)化確定為20 μL，包括1×buffer、1U Taq酶、2.0 mmol·L-1MgCl2、0.1 mmol·L-1dNTP、0.5 mmol·L-1引物、25 ng模板DNA。ISSR-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，94 ℃變性30 s，52 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸1 min，最后4 ℃保存。選取2個(gè)模板DNA進(jìn)行引物篩選，篩選出擴(kuò)增條帶多、條帶清晰的引物用于ISSR-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠于150 V恒定電壓下電泳1 h左右，電泳結(jié)果可通過自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照(圖2)。

100個(gè)ISSR引物選自加拿大大不列顛哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的隨機(jī)引物，引物合成及相關(guān)試劑藥品購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)電泳條帶，按照條帶的有無賦值，擴(kuò)增條帶無記為“0”，有記為“1”，記錄原始“0/1”矩陣，建立72份材料的ISSR識(shí)別卡。利用POPGENE 32和NTSYS 2.1遺傳分析軟件對“0/1”矩陣進(jìn)行種源水平遺傳多樣性分析，并用UPGMA(非加權(quán)算術(shù)平均聚類)進(jìn)行聚類，數(shù)據(jù)格式輸入及軟件使用參照說明書。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性分析

8條特異引物共擴(kuò)增出90條譜帶，其中多態(tài)性譜帶76條，平均每條引物擴(kuò)增9.5條多態(tài)性譜帶，多態(tài)性比率為84.44%(表2)，表明72份材料之間存在遺傳差異。其中引物UBC835、845、848擴(kuò)增帶數(shù)最多，為13條譜帶，引物835、848、856多態(tài)性比率最高，為100%。在擴(kuò)增出的90條譜帶中包括14條各個(gè)基因型共有的譜帶，為72份材料同源性分析提供了一定的依據(jù)。

表2 ISSR引物的堿基序列及擴(kuò)增結(jié)果

2.2 遺傳多樣性分析

90個(gè)位點(diǎn)檢測到的平均等位基因觀察值為1.8444，平均有效等位基因?yàn)?.4978，基因多樣性指數(shù)為0.2879，Shannon信息指數(shù)為0.4306，表明鄧恩桉6個(gè)種源遺傳多樣一般。6個(gè)鄧恩桉種源遺傳相似系數(shù)在0.7271～0.8719之間，平均相似系數(shù)為0.7926；遺傳距離在0.1371～0.3187之間，平均遺傳距離為0.2338(表3)。表明鄧恩桉6個(gè)種源具有較高的同源性。

表3 鄧恩桉種源間的Nei′s遺傳一致度與遺傳距離

*：對角線上方為遺傳一致度；對角線下方為遺傳距離。

2.3 聚類分析

UPGMA聚類分析顯示(圖3)：在相似系數(shù)為0.80時(shí)，來自昆士蘭州的2個(gè)鄧恩桉種源與來自新南威爾士州的4個(gè)鄧恩桉種源被劃分為2大類；在相似系數(shù)為0.83時(shí)，來自新南威爾士州的4個(gè)鄧恩桉種源又被劃分為2類，其中緯度較低的種源GED9501與GED9507歸為一類，緯度較高的種源GED9502與GED9509歸為一類，說明地理分布是影響聚類結(jié)果的重要因子。遺傳距離最近(0.1371)的種源為GED9501與GED9507，遺傳距離最遠(yuǎn)(0.3187)的種源為GED9502 與GED9504。

3 結(jié)論與討論

3.1 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性實(shí)際就是群體之間的差異性或者個(gè)體之間的差異性，通過分子標(biāo)記技術(shù)探討物種的遺傳多樣性比表型觀測更為準(zhǔn)確可信，因?yàn)樗沂镜氖俏锓N基因的多樣性。巨桉[14]、韋塔桉[15]、細(xì)葉桉[16]和大花序桉[17]等已開展遺傳多樣性的分子標(biāo)記分析，利用分子標(biāo)記技術(shù)揭示桉樹基因多樣性是可行的。本研究通過ISSR標(biāo)記分析鄧恩桉6個(gè)種源遺傳多樣性，84.44%的多態(tài)性比率表明鄧恩桉72個(gè)個(gè)體之間存在較豐富的遺傳變異，4個(gè)多樣性指標(biāo)則表明鄧恩桉6個(gè)種源遺傳基礎(chǔ)較窄，具有較高的同源性，原因在于本次采樣僅針對華山林場雅龍分場種源試驗(yàn)林間伐后保存的優(yōu)良育種群體。

羅建中等[5]指出鄧恩桉遺傳差異主要存在于家系間，鄧恩桉種源間遺傳差異小。鄧恩桉相對其他桉屬樹種，其自然分布區(qū)域小，僅分布在澳大利亞新南威爾士州東北部和昆士蘭州東南部的有限區(qū)域內(nèi)，造成鄧恩桉種源間差異小，而鄧恩桉的生長極易受到種植環(huán)境的影響，這可能是鄧恩桉在個(gè)體間存在豐富差異的原因。在今后鄧恩桉遺傳改良中，應(yīng)重視家系水平改良，針對不同造林地點(diǎn)選擇優(yōu)良材料。

3.2 聚類分析

聚類分析可揭示不同個(gè)體之間的親緣關(guān)系，鄧恩桉在其自然分布區(qū)域呈不連續(xù)分布，成為2個(gè)完全獨(dú)立的群體，本研究中，這2個(gè)獨(dú)立的群體首先被區(qū)分開來，在進(jìn)一步聚類分析中，來自新南威爾士州的4個(gè)鄧恩桉種源被劃分為2類，一類為高經(jīng)度、低緯度、高海拔種源，一類為低經(jīng)度、高緯度、低海拔種源。種源GED9501與GED9507遺傳距離最近，它們都來自新南威爾士州且地理因素相近；種源GED9502 與GED9504遺傳距離最遠(yuǎn)，它們分別來自新南威爾士州和昆士蘭州的兩個(gè)獨(dú)立群體，兩者地理因素比較，種源GED9502為低經(jīng)度、高緯度、低海拔，種源GED9504為高經(jīng)度、低緯度、高海拔。鄧恩桉地理變異與種源間基因變異有關(guān)，地理分布是影響聚類結(jié)果的重要因子，這與大花序桉[17]、杉木[19-20]和鐵蘭屬植物[21]研究結(jié)論相似。

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Genetic Diversity ofEucalyptusdunniiBased on ISSR

DENG Ziyu1，2，3，GUO Dongqiang1，2，3，CHEN Jianbo1，2，3，LUO Qing4，XIANG Dongyun1，2，3

(1.GuangxiForestryScienceResearchInstitute，Nanning530001，Guangxi，China； 2.KeyLaboratoryofCentralSouthFast-growingTimberCultivationofStateForestryAdministrationofChina，Nanning530001，Guangxi，China；3.GuangxiKeyLaboratoryofSuperiorTimberTreesResourceCultivation，Nanning530001，Guangxi，China；4.GuangxiSubtropicalCropsResearchInstitute，Nanning530001，Guangxi，China)

The paper focused on assess the genetic diversity and variability ofEucalyptusdunniito provide referents for resource utilization and molecular breeding.ISSR marker was used to study the genetic diversity of 6Eucalyptusdunniiprovenances.A total of 90 bands were amplified by 8 primers，of which 76 are polymorphic bands(84.44% of polymorphism).The average value of observed number of alleles，average value of effective number of alleles，Nei′s gene diversity and Shannon′s information index were 1.8444，1.4928，0.2879 and 0.4306 respectively.The Nei′s genetic similarity coefficients ranged from 0.7271～0.8719 with an average of 0.7926.According to the UPGMA method，we made the cluster analysis by using the NTSYS software，6Eucalyptusdunniiprovenances could be divided into two groups at the similarity coefficient of 0.80.The genetic diversity among inter-provenances ofEucalyptusdunniiwas lower，and the geographical distribution ofEucalyptusdunniiwas closely related to the cluster result.

Eucalyptusdunnii；genetic diversity；ISSR

10.13428/j.cnki.fjlk.2016.04.004

2016-01-03；

2016-03-01

廣西科學(xué)研究與計(jì)劃開發(fā)項(xiàng)目(桂科合1347004-3)；廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主課題項(xiàng)目(13-A-01-02)；廣西林科院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(林科201408號(hào))

鄧紫宇(1984—)，男，廣西全州人，廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院工程師，碩士，從事林木遺傳育種研究。E-mail：365204914@qq.com。

項(xiàng)東云(1960—)，男，廣西扶綏人，廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院教授級(jí)高級(jí)工程師，從事林木遺傳育種研究。E-mail：1753306481@qq.com。

S792.39

A

1002-7351(2016)04-0017-04