劉雪婷元虹懿張明海關(guān)偉軍

（1. 東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

鴨脂肪間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)與生物學(xué)特性

劉雪婷1，2元虹懿1，2張明海1關(guān)偉軍2

（1. 東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

建立禽類脂肪來源的間充質(zhì)干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）體外培養(yǎng)體系，探索其生物學(xué)特性和多分化潛能。通過酶消化法分離18日齡鴨胚ADSCs，繪制生長曲線，通過RT-PCR、免疫熒光和流式細胞術(shù)陽性率檢測對ADSCs進行鑒定，誘導(dǎo)ADSCs向成骨細胞和脂肪細胞分化。結(jié)果表明，鴨胚胎ADSCs體外增殖能力良好；陽性表達CD29，CD44，CD105，表達率分別為95.39％、94.53％和98.19％；經(jīng)體外誘導(dǎo)后可分化為成骨細胞和脂肪細胞。研究認為在適宜的培養(yǎng)條件下，體外培養(yǎng)的ADSCs能夠穩(wěn)定增殖并具有多分化潛能，可作為組織工程的種子細胞進行保存。

脂肪間充質(zhì)干細胞；分離培養(yǎng)；體外誘導(dǎo)分化；多分化潛能；生物學(xué)特性

干細胞分為胚胎干細胞［1］、成體干細胞和誘導(dǎo)多能干細胞，均具有自我更新能力和多潛能性。干細胞廣泛應(yīng)用于臨床治療，為器官衰竭、組織創(chuàng)傷、先天性結(jié)構(gòu)異常等疾病的治療提供了新方法。然而這些治療具有潛在的局限性，包括倫理學(xué)問題［2］、器官短缺、供體損傷、過敏反應(yīng)和排斥反應(yīng)等。成體干細胞在具有同樣性質(zhì)的前提下，不涉及倫理道德問題，免疫原性低且易于獲取，因此具有更為廣泛的應(yīng)用前景［3］。

間充質(zhì)干細胞（MSCs）為來源于中胚層的非造血干細胞，免疫原性低，不涉及倫理道德問題，是目前為止最具成體干細胞多潛能特征的一類細胞，存在于多種結(jié)締組織和器官中。間充質(zhì)干細胞是一類具有骨形成能力和造血功能的細胞群，來源廣泛。從皮膚［4］、骨骼?。?］、臍帶［6］、骨膜［7］、外周血［8］、滑膜［9］、周細胞［10］、乳牙［11］等組織中分離出的干細胞具有與骨髓間充質(zhì)干細胞相似的生物學(xué)特性。但由于組織有限、不易獲取或獲取的細胞數(shù)量低、體外大量增殖困難等條件的限制，使其治療應(yīng)用受到限制。

2011年Zuk等［12］首次從脂肪組織中分離出一種具有多分化潛能的干細胞，將其命名為脂肪來源的間充質(zhì)干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）。盡管ADSCs來自于中胚層，但是具有多胚層分化和多系分化的潛能，在一定條件下能夠分化成各胚層特定的體細胞。ADSCs能夠分化成脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、肌細胞、牙周細胞［13］、心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞和肌腱細胞［14］等中胚層細胞。

相比較而言，ADSCs來源廣泛、取材方便、對供區(qū)創(chuàng)傷小、易于獲得大量細胞、免疫原性低、具有自我更新和多分化潛能，是目前干細胞應(yīng)用的理想種子細胞。目前，針對ADSCs的研究，大部分集中于鼠、兔、人或其他哺乳動物［15］，對禽類物種的研究很少見。本研究對18日胚齡鴨的ADSCs進行分離培養(yǎng)，對自我更新能力和多分化潛能進行研究，針對表面標記物的表達進行鑒定，旨在為ADSCs的體外培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究提供新思路。

1　材料與方法

1.1材料

18日齡北京鴨鴨胚由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所家禽實驗基地提供。

DMEM/F12、胎牛血清、B27、胰蛋白酶為美國Gibco公司產(chǎn)品，Ⅰ型膠原酶、DMSO、TritonX-100、L-谷氨酰胺、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、吲哚美辛、胰島素、油紅O、β甘油磷酸鈉、維生素C、茜素紅、5-氮雜胞苷、臺盼藍為美國Sigma公司產(chǎn)品，bFGF為英國Peprotech公司產(chǎn)品，BSA、山羊血清、山羊抗兔FITC標記二抗為中國北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，CD29、CD44、CD105、Mhc、 cTnT、GATA為美國Abcame公司產(chǎn)品，多聚甲醛為北京化工廠產(chǎn)品，Trizol為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver. 3.0為中國大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2方法

1.2.1ADSCs的分離培養(yǎng) 無菌取18日齡鴨胚腹股溝處及腹部皮下脂肪組織，于含1％青鏈霉素的預(yù)冷PBS中漂洗5-8遍后剪碎成糊狀，0.1％膠原酶Ι 37℃消化1 h，消化液的量以浸沒組織為宜。為了使組織與消化液反應(yīng)充分，消化過程中可適當(dāng)晃動平皿［16］。用200目細胞篩過濾，收集濾液于15 mL離心管中，室溫下1 200 r/min離心10 min。棄去液體層，用完全培養(yǎng)基［10％FBS，1％B27（Gbico），10 ng/mL bFGF（Peprotech），2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM/F-12］重懸細胞沉淀后，以3×104/cm2濃度接種于直徑60 mm的細胞培養(yǎng)皿中，37℃、5％CO2培養(yǎng)。隔日換液。

當(dāng)細胞生長至80％-90％融合時，棄去培養(yǎng)基，PBS漂洗2次，0.25％胰蛋白酶37℃消化，大量細胞回縮變圓時，以完全培養(yǎng)基反復(fù)吹打細胞，視細胞密度進行1∶2或1∶3比例進行傳代。傳代過程中，觀察細胞形態(tài)并拍照，每3 d更換一次培養(yǎng)基。通常3-4代后，細胞被純化。

1.2.2生長曲線 常規(guī)法消化收集生長狀態(tài)良好的P2、P5、P8代細胞，以1.0×104細胞/mL的密度接種于24孔板。每天隨機選取3個孔進行消化計數(shù)，每孔計數(shù)3次，臺盼藍染色測定細胞活率。以細胞數(shù)為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制生長曲線［17］。根據(jù)生長曲線計算細胞群體增倍時間（Population doubling time，PDT）。計算公式為：

其中，t：培養(yǎng)終止時間；t0：培養(yǎng)起始時間；Nt：培養(yǎng)終止細胞數(shù)；N0：培養(yǎng)起始細胞數(shù)。

1.2.3ADSCs的RT-PCR檢測 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測ADSCs的CD29、CD44和CD105基因的表達，引物由生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成（表1）。Trizol法提取第3代ADSCs總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系40 μL：ddH2O 14 μL，2×dNTP Mixture 20 μL，上下游引物各2 μL，cDNA 2 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸5 min，產(chǎn)物4℃保存。產(chǎn)物進行質(zhì)量濃度為20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀檢測目的基因的表達情況。

表1　RT-PCR引物序列

1.2.4ADSCs表面標記的免疫熒光檢測 取第3 代ADSCs，當(dāng)細胞融合至50％-60％時，用PBS漂洗3遍，每次5 min，4％多聚甲醛室溫條件下固定15 min，預(yù)冷PBS漂洗3次。0.25％Triton X-100通透20 min后，10％山羊血清室溫（中杉金橋）封閉30 min，然后加入抗體CD29（1∶100稀釋），CD44 （1∶100），CD105（1∶100）4℃孵育過夜。棄一抗，PBS漂洗3次然后加入FITC標記的山羊抗兔二抗（1∶100 中杉金橋），室溫避光孵育1 h。避光PBS漂洗3次。最后，用1 μg/mL DAPI孵育30 min 后PBS漂洗3次［18］。于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5ADSCs表面標記的陽性率鑒定 當(dāng)細胞融合至80％-90％時，常規(guī)法消化收集細胞，1 500 r/min離心10 min。棄上清，PBS洗滌沉淀后用預(yù)冷的70％乙醇重懸細胞，4℃過夜。1 200 r/min離心10 min后，棄去上清并用PBS洗滌沉淀。0.25％ Triton X-100通透15 min后，PBS漂洗，10％山羊血清（中杉金橋）封閉1 h后，1 200 r/min離心10 min，棄上清。加入抗體CD29（1∶100稀釋），CD44（1∶100），CD105（1∶100）4℃孵育過夜，對照組加入PBS。棄去一抗和對照組的PBS，PBS漂洗后加入FITC標記的山羊抗兔二抗（1∶100，中杉金橋），室溫避光孵育1 h。棄掉二抗，PBS漂洗后稀釋，經(jīng)80 μm細胞篩處理后上機檢測。選擇參數(shù)后，即可畫圖選擇分析區(qū)域，排除氣泡上樣分析后，可收集數(shù)據(jù)［19］。

1.2.6ADSCs的誘導(dǎo)分化及鑒定

1.2.6.1ADSCs的成脂誘導(dǎo)分化及鑒定 細胞生長達到50％-60％融合時，應(yīng)用成脂誘導(dǎo)液（DMEM/ DF12+10％ FBS+1 μmol/L地塞米松+0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤+200 μmol/L吲哚美辛+10 mg/L胰島素）誘導(dǎo)ADSCs分化，對照組用全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

3周后應(yīng)用油紅O染色法［20］。觀察脂滴，拍照。利用RT-PCR方法檢測脂肪細胞特異性基因脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）和過氧化物酶體增殖因子活化受體-γ（peroxisome proliferato-activated receptor γ，PPAR-γ）的表達情況。

1.2.6.2ADSCs的成骨誘導(dǎo)分化及鑒定 細胞生長達到50％-60％融合時，應(yīng)用成骨誘導(dǎo)液（DMEM/ DF12+10％FBS+10-7M地塞米松 + 10-2M β-甘油磷酸+ 50 mg/L Vc）誘導(dǎo)ADSCs分化。對照組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

3周后應(yīng)用茜素紅染色法［20］。鏡檢，拍照。利用RT-PCR方法檢測成骨細胞特異性基因骨橋蛋白（Osteopontin）和Ⅰ型膠原（Collagen type Ⅰ）的表達情況。

2　結(jié)果

2.1ADSCs的分離培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察

接種24 h后，大部分細胞貼于培養(yǎng)皿底部并向周圍延伸，可見部分多角形、三角形、扁平狀細胞，其中混有大量卵圓形的血細胞（圖1-A）。多次換液后血細胞被祛除，剩余細胞呈現(xiàn)典型的成纖維狀。傳代后，細胞生長迅速，隨著傳代次數(shù)增加，細胞逐漸被純化，細胞形成致密單層，呈旋渦狀走勢。連續(xù)代次之間細胞保持穩(wěn)定的形態(tài)，沒有明顯差別（圖1-B-D）。10代后，細胞增殖速度減慢，開始出現(xiàn)衰老現(xiàn)象（圖1-E）。傳至13代時，細胞衰老明顯，空泡化加劇、核固縮（圖1-F）。隨著培養(yǎng)時間的延長，部分細胞會從培養(yǎng)皿上脫落。

圖 1 ADSCs形態(tài)特征（40×）

2.2ADSCs生長曲線

分別計數(shù)P2、P5、P8代ADSCs的增殖情況并繪制生長曲線（圖2）。ADSCs的增殖過程經(jīng)歷了潛伏期、對數(shù)期、平臺期，生長曲線成典型的“S”形。ADSCs潛伏期約為24 h，培養(yǎng)36 h后，細胞進入對數(shù)生長期，群體增倍時間（PDT）約為36 h，接種第7天細胞生長速度減慢，進入平臺期。表明體外培養(yǎng)ADSCs具有良好的自我更新和增殖能力，易于體外擴增培養(yǎng)。

圖 2 ADSCs生長曲線

2.3ADSCs表面標記的檢測

由于體內(nèi)環(huán)境和體外培養(yǎng)條件下，ADSCs均表達CD29、CD44和CD105這3種標記基因［21］，因此本實驗針對這3種基因進行檢測。RT-PCR結(jié)果（圖3-A）顯示分離培養(yǎng)的ADSCs陽性表達3種標記基因。對P4代ADSCs進行免疫熒光檢測（圖3-B）和陽性率分析（圖3-C），結(jié)果表明ADSCs陽性表達CD29、CD44和CD105，其陽性率分別為95.39％、94.53％和98.19％。

2.4ADSCs成脂誘導(dǎo)分化及鑒定

成脂誘導(dǎo)過程中，對照組ADSCs未見形態(tài)的改變，無脂滴形成（圖4-A）。誘導(dǎo)組成脂分化7 d部分細胞由長梭型變?yōu)楸鈭A形，出現(xiàn)少量脂滴。隨著誘導(dǎo)時間的延長，脂滴排列緊密且相互融合，體積增大，折光性增強。14 d后，可見大量脂滴環(huán)狀排列，一些大脂滴幾乎占據(jù)整個細胞（圖4-B）。誘導(dǎo)21 d時進行油紅O染色，可見對照組不著色，誘導(dǎo)組細胞內(nèi)脂滴被染成紅色（圖4-C）。RT-PCR檢測僅誘導(dǎo)組細胞表達LPL和PPAR-γ（圖4-D）。

圖 3 ADSCs表面標記的檢測

圖4　ADSCs成脂誘導(dǎo)分化及鑒定

2.5ADSCs成骨誘導(dǎo)分化及鑒定

成骨誘導(dǎo)過程中，對照組細胞形態(tài)未見改變，未形成鈣結(jié)節(jié)（圖5-A）。誘導(dǎo)組培養(yǎng)10 d后（圖5-B），部分細胞變成卵圓形，細胞聚集形成結(jié)節(jié)，折光性增強。14 d時，結(jié)節(jié)狀細胞增多，鈣鹽沉積增加。培養(yǎng)21 d時，茜素紅染色發(fā)現(xiàn)，對照組無著色情況，誘導(dǎo)組結(jié)節(jié)呈現(xiàn)明亮的紅色（圖5-C）。RT-PCR結(jié)果（圖5-D）顯示僅誘導(dǎo)組細胞能夠表達成骨細胞特異性基因Osteopontin和Collagen type I。

圖5　ADSCs成骨誘導(dǎo)分化及鑒定

3　討論

脂肪間充質(zhì)干細胞來源廣泛，取材方便，易于獲得大量細胞，免疫原性低，具有自我更新和多分化潛能，是目前干細胞應(yīng)用的理想種子細胞。依據(jù)脂肪的分布部位和功能特點，可將其分為兩類：一類為白色脂肪組織，分布于皮下及臟器周圍，主要參與脂肪代謝和能量代謝等生理活動；另一類為棕色脂肪組織，主要分布于新生動物的肩胛部，當(dāng)生物體受寒冷刺激時，可氧化分解進而散發(fā)熱能。但是目前針對于ADSCs的研究，主要集中于哺乳動物，關(guān)于禽類脂肪干細胞的研究較少。本實驗成功分離了18日齡鴨胚的脂肪間充質(zhì)干細胞，并驗證了其自我更新能力和多分化潛能。用0.1％的Ⅰ型膠原酶37℃消化60 min，細胞增殖分化能力良好。ADSCs的增殖擴散能力受供體年齡，脂肪組織類型（白色/棕色脂肪組織）和位置（皮下/內(nèi)臟）有關(guān)。通常供體年齡越小，ADSCs增殖能力和黏附性就越好，隨著細胞代次的增高，增殖能力也逐漸降低［21］。通過對人ADSCs長期體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，人ADSCs的衰老水平很低，傳至P10代時只有不到5％的細胞表現(xiàn)出衰老現(xiàn)象［12］。初代ADSCs中混雜著許多血細胞，通過多次換液和傳代可去除，體外培養(yǎng)至13代。本實驗ADSCs的生長曲線呈“S”型，從培養(yǎng)36 h開始進入指數(shù)生長期，第8天達到高峰，隨后逐漸降低。

目前脂肪干細胞主要從形態(tài)學(xué)、細胞表面標記、功能等方面進行鑒定。形態(tài)學(xué)研究表明傳至第3代的ADSCs多呈成長梭形，且按一定方向排列［22，23］。關(guān)于脂肪間充質(zhì)干細胞特異性表面標記，目前說法尚不統(tǒng)一，因此，本實驗選擇了體內(nèi)環(huán)境和體外培養(yǎng)條件下ADSCs均會表達的幾種間充質(zhì)干細胞標記物。本實驗選擇了CD29、CD44、CD105 這3種細胞表面標記進行了檢測。CD29在胚胎形成、止血、組織修復(fù)、惡性腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和免疫反應(yīng)過程中具有細胞黏附與識別的作用［24］。CD44是一種細胞表面的糖蛋白，在腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移中起促進作用，主要參與異質(zhì)性黏附，即腫瘤細胞與宿主細胞和宿主基質(zhì)的黏附［25］。CD105是轉(zhuǎn)化生長因子β （TGF-β）的受體蛋白，可調(diào)節(jié)細胞增殖［26］。本實驗用RT-PCR、流式陽性率和免疫熒光檢測第3代 ADSCs CD29、CD44和CD105的表達，結(jié)果證實實驗提取的細胞為ADSCs。雖然ADSCs來源于中胚層，但是具有多胚層分化和多系分化的潛能，在一定條件下能夠分化成各胚層特定的體細胞。本實驗選擇脂肪分化前期的標記基因LPL和脂肪分化中期的標記基因PPAR-γ［27］為標記，采用條件培養(yǎng)基成功地將ADSCs誘導(dǎo)為脂肪細胞和成骨細胞，從而證實了ADSCs的多分化潛能。

然而，盡管ADSCs在體外具有多分化潛能，利用干細胞移植進行細胞治療仍然存在許多安全問題和技術(shù)問題。因此還需要進一步深入研究，使ADSCs有望成為細胞治療和組織工程應(yīng)用的優(yōu)秀種子細胞。

4　結(jié)論

本實驗成功分離了18日齡鴨胚的脂肪間充質(zhì)干細胞，通過體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化鑒定證明了體外培養(yǎng)的ADSCs具有自我更新能力和多分化潛能。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Isolation and Biological Characterization of Duck Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

LIU Xue-ting1，2YUAN Hong-yi1，2ZHANG Ming-hai1GUAN Wei-jun2
（1. Northeast Forestry University，Harbin 150040；2. Institute of Animal Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）

This study aims to establish in vitro culture system for the poultry adipose-derived stem cells（ADSCs），to study the biological characteristics and the multi-differentiation potential. Enzyme digestion method was applied to separate Beijing duck 18-dayold embryos ADSCs and to draw the growth curve. ADSCs were identified by RT-PCR，immunofluorescence and flow cytometric analysis. Our results suggested that the ADSCs had solid proliferative activity and were positive for CD29，CD44 and CD105，the rate of CD29+，CD44+，and CD105+ ADSCs was 95.39％，94.53％，98.19％，respectively. ADSCs differentiated into adipocytes and osteoblasts by induced differentiation in vitro. In summary，under appropriate experimental circumstances，Beijing duck embryo ADSCs have a strong self-renewing ability and multi-differentiation potential in vitro，and it can be an ideal type of seed cell for cellular transplantation therapy.

adipose-derived stem cells；isolation；in vitro directional differentiation；multi-differentiation potential；the biological characteristics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.019

2015-11-02

國家自然科學(xué)基金項目（31472099），中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項目（cxgc-ias-01）

劉雪婷，女，碩士研究生，研究方向：野生動物生態(tài)學(xué)、保護與管理學(xué)；E-mail：esselxt@126.com

張明海，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：野生動物生態(tài)學(xué)、保護與管理學(xué)；E-mail：zhangminghai2004@126.com