奧旭東 薩如拉 王杰 王會(huì)敏 于海泉

（內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，呼和浩特 010021）

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR對(duì)AID基因修飾的牛胎兒成纖維細(xì)胞的作用

奧旭東 薩如拉 王杰 王會(huì)敏 于海泉

（內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，呼和浩特 010021）

以轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞和AID基因敲減細(xì)胞為研究對(duì)象，旨在探討5-氮-2'-脫氧胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR）對(duì)其細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期、相關(guān)基因表達(dá)及其基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)變化的影響。此外，還分析了整體基因組去甲基化和位點(diǎn)特異性去甲基化之間存在的差別，探討提高體細(xì)胞重編程效率的方法及其作用機(jī)制。通過(guò)Real-time PCR、BSP（Bisulfite Sequencing PCR）、Western blotting和流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)分析了5-Aza-CdR對(duì)轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞和AID基因敲減細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，5-Aza-CdR對(duì)轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞的影響存在明顯的劑量效應(yīng)，濃度為4 μmol/L時(shí)，具有明顯的細(xì)胞毒性，大量細(xì)胞死亡（P＜0.05）。當(dāng)使用處理濃度為1-3 μmol/L時(shí)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞增殖被抑制。核型分析顯示，3 μmol/L濃度組處理就可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞出現(xiàn)異常核型。使用1 μmol/L濃度處理細(xì)胞，明顯增加了表達(dá)報(bào)告基因細(xì)胞的數(shù)量，細(xì)胞AID和SOX2的表達(dá)量都有所提高，并且SOX2基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化水平也有所下降。5-Aza-CdR處理AID基因敲減細(xì)胞后，OCT4和SOX2的表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高，而NANOG卻沒(méi)有發(fā)生變化。結(jié)果顯示，5-Aza-CdR處理轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞可改變細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期和報(bào)告基因的表達(dá)，5-Aza-CdR處理后基因組整體去甲基化和AID基因的位點(diǎn)特異性去甲基化協(xié)同作用于體細(xì)胞重編程。

5-Aza-CdR；AID基因；DNA去甲基化；體細(xì)胞核移植

胚胎發(fā)育過(guò)程是細(xì)胞全能性逐漸喪失的過(guò)程［1］，有研究顯示，2-細(xì)胞期到4-細(xì)胞期的小鼠胚胎各個(gè)卵裂球已表現(xiàn)出不同的發(fā)育傾向［2］，隨著胚胎的發(fā)育，各個(gè)細(xì)胞不斷地向既定的方向發(fā)生分化。在發(fā)育過(guò)程中，基因組經(jīng)歷多種表觀遺傳修飾，導(dǎo)致基因的表達(dá)狀況也隨之發(fā)生了改變，由此產(chǎn)生了不同的分化表型。已分化的細(xì)胞可以經(jīng)過(guò)去分化被逆轉(zhuǎn)到未分化狀態(tài)，從而獲得發(fā)育的全能性，這一過(guò)程被稱為體細(xì)胞重編程［3］。誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程的方式主要包括體細(xì)胞核移植（SCNT）、體細(xì)胞與多潛能細(xì)胞融合、胚胎干細(xì)胞提取物處理以及轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）。

核移植和iPS技術(shù)被認(rèn)為是到目前為止誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程最為完全、最具有再生醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用潛能的技術(shù)。目前人們已經(jīng)獲得了多種核移植動(dòng)物和iPS細(xì)胞［4-9］，然而這兩項(xiàng)技術(shù)也存在很大的局限性，如iPS細(xì)胞的效率低下，體細(xì)胞克隆胚胎發(fā)育率低，流產(chǎn)率高及異常個(gè)體等，這些都是制約這兩項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用的主要因素［10，11］。其中，造成體細(xì)胞克隆胚胎發(fā)育異常以及iPS細(xì)胞重編程的效率極低的主要原因是體細(xì)胞基因組不能完全的去分化、不能正常啟動(dòng)重編程過(guò)程。

基因組DNA甲基化是表觀遺傳調(diào)控的重要方式［12］。有研究表明，克隆胚胎基因組的異常甲基化是引起克隆胚發(fā)育率和出生率低的主要原因之一［13］。高甲基化的癌細(xì)胞DNA去甲基化后發(fā)生肌源性重組，可以提高其iPS的重編程效率［14］。目前研究表明，去甲基化藥物可以使抑癌基因去甲基化，從而恢復(fù)其功能治療腫瘤［15］。5-氮胞苷（5-azacytidine，5-AzaC）是一種原型的DNMT抑制劑，而5-氮-2'-脫氧胞苷（5-aza-2'-deoxy-cytidine，5-Aza-dC）是5-AzaC的脫氧核糖類(lèi)似物。它們具有較強(qiáng)的DNMT抑制作用，其通過(guò)抑制了DNMT的作用來(lái)降低基因組的DNA甲基化水平，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)和介導(dǎo)細(xì)胞分化［16-18］。

活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶蛋白（Activationinduced cytidine deaminase，AID）主要因其在B淋巴細(xì)胞中產(chǎn)生抗體多樣性的作用被人們廣泛認(rèn)識(shí)［19-21］。隨后，研究人員發(fā)現(xiàn)AID蛋白可以將5mC脫氨基成為T(mén)，從而導(dǎo)致在T-G不匹配［18］。而AID基因表達(dá)于具有多能性的組織中［22］，這都暗示其具有DNA去甲基化作用。研究證實(shí)在小鼠［23，24］和斑馬魚(yú)［25］中AID基因具有DNA主動(dòng)去甲基化作用。小鼠中的研究雖然表明AID基因具有DNA主動(dòng)去甲基化作用，但是其作用并不是針對(duì)全基因組的而是具有一定的位點(diǎn)特異性［23］。目前，還未見(jiàn)用DNA去甲基化藥物5-Aza-CdR與AID基因聯(lián)合作用對(duì)重編程影響的報(bào)道。因此，5-Aza-CdR在體細(xì)胞重編程中與AID基因作用的關(guān)聯(lián)還不是很清楚，還需進(jìn)一步探討。本研究以轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞和AID基因敲減細(xì)胞為研究對(duì)象，探討5-Aza-CdR對(duì)其細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期、相關(guān)基因表達(dá)及其基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)變化的影響；并分析整體基因組去甲基化和位點(diǎn)特異性去甲基化之間存在的差別，以期為體細(xì)胞克隆效率的提高奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

5-Aza-CdR購(gòu)自Sigma公司，MTT購(gòu)自Promega公司，An-nexin-V購(gòu)自Invitrogen公司。除特別提到的化學(xué)試劑，其余均購(gòu)自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞及AID敲減細(xì)胞的獲得 轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞的獲得使用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000（Invitrogen）轉(zhuǎn)染本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的過(guò)表達(dá)載體pCDsRed-PbAID。轉(zhuǎn)染48 h后消化細(xì)胞，重新接種于10 cm培養(yǎng)皿中，加入G418，每3 d換液1次。待培養(yǎng)皿中形成表達(dá)紅色熒光蛋白的抗藥克隆時(shí)，用克隆杯消化后接種于24孔板后，擴(kuò)大培養(yǎng)。

用于敲減AID基因的siRNA沒(méi)有篩選標(biāo)記，不能長(zhǎng)期干擾AID基因的表達(dá)。為了保證AID-siRNA能夠高效的轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞并起到干擾作用，本研究使用本實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)染效率比較高的電轉(zhuǎn)染方法來(lái)轉(zhuǎn)染AID-siRNA。該方法轉(zhuǎn)染pDsRed-C質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率能夠達(dá)到80％左右。AID基因敲減細(xì)胞的獲得參照以下步驟：第3代牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)2-3 d后，細(xì)胞單層匯合度達(dá)到70％-80％，胰酶消化細(xì)胞，1 200 r/min室溫離心5 min。棄上清，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量，加入適量的電轉(zhuǎn)緩沖液重懸細(xì)胞并吹打均勻。加入終濃度為100 nmol/L siRNA，按照預(yù)定條件設(shè)置參數(shù)250 V，5 ms，2次，進(jìn)行電擊。將電轉(zhuǎn)杯置于37℃培養(yǎng)箱中孵育8-12 min，然后將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中，正常培養(yǎng)4 h，待細(xì)胞貼壁后，換新鮮的完全培養(yǎng)液，以去除上層的死細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)處理。

1.2.25-Aza-CdR處理體細(xì)胞及細(xì)胞毒性、凋亡與周期的分析 5-Aza-CdR用培養(yǎng)液DMEM/F12溶解，配制成1 mol/L的濃儲(chǔ)液，-20℃儲(chǔ)存。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在培養(yǎng)孔里分別加入終濃度為1、2、3和4和5 μmol/L的5-Aza-CdR處理24 h或48 h。

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 000 cells /孔置于96孔板。37℃，5％ CO2培養(yǎng)2 d后，加入梯度濃度的5-Aza-CdR。然后37℃，5％ CO2孵育24 h或48 h，PBS洗2遍，加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液。每孔加入20 μL 0.5％ MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每孔加入100 μL DMSO混勻后酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)OD490 nm。生存細(xì)胞的百分比計(jì)算方法如下：細(xì)胞生存能力抑制率（％）=［1-（OD treatment-OD blank）/（OD control-OD blank）］×100％。

調(diào)整待檢測(cè)的細(xì)胞濃度為2×106-5×106/mL。加入5 μL的Annexin V，室溫孵育3 min，20 μg/mL 的PI染核。避光室溫孵育10 min后，經(jīng)流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter，SC）檢測(cè)。

5-Aza-CdR處理轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞，20 μg/mL的PI染核后使用Beckman流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，使用Cell Cycle軟件（Beckman Coulter）分析數(shù)據(jù)。處理后體細(xì)胞核型的檢測(cè)方法使用本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)制作檢測(cè)方法。

1.2.35-Aza-CdR處理體細(xì)胞基因的表達(dá)及其甲基化變化分析 挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞克隆提取RNA后，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。PCR特異性引物以牛AID、OCT4、NANOG 和SOX2基因?yàn)槟０暹M(jìn)行設(shè)計(jì)。引物序列見(jiàn)表1。在ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀反應(yīng)后，使用2-ΔΔCT方法與GAPDH相比較后得到AID基因及多能基因的表達(dá)。

表1　牛Real-time PCR引物序列和反應(yīng)產(chǎn)物

挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞克隆提取DNA?；蚪MDNA經(jīng)過(guò)Xho I（TaKaRa）酶切后，用亞硫酸氫鹽處理，然后用乙醇沉淀的方法回收DNA用于PCR。引物序列見(jiàn)表2。

1.2.4統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Real-time PCR試驗(yàn)結(jié)果使用單因素分析，而DNA甲基化狀態(tài)使用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05確定為差異的顯著性。

表2　牛BSP-PCR引物序列和反應(yīng)產(chǎn)物

2　結(jié)果

圖1　5-Aza-CdR對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響

2.15-Aza-CdR對(duì)轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

本實(shí)驗(yàn)使用梯度濃度的5-Aza-CdR處理轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞，并分析了5-Aza-CdR處理后的細(xì)胞周期，細(xì)胞形態(tài)和其細(xì)胞毒性作用。結(jié)果（圖1-A）顯示，不同濃度的5-Aza-CdR處理24 h后，1、2 和3 μmol/L與對(duì)照組相比細(xì)胞活性沒(méi)有明顯差異（P＞0.05），而且相鄰濃度之間也不存在顯著性差異。但隨著5-Aza-CdR濃度的繼續(xù)升高，細(xì)胞活性明顯降低（P＜0.01）。1 μmol/L 5-Aza-CdR處理48 h后，所有處理組都與對(duì)照組差異極顯著，而不同濃度之間只有2 μmol/L 和3 μmol/L 之間沒(méi)有差異（P＞0.05）。由此可見(jiàn)，隨著5-Aza-CdR作用濃度的增加，死細(xì)胞數(shù)明顯增多，細(xì)胞耐受性減弱，活性明顯下降；相同濃度作用下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活性呈顯著下降趨勢(shì)（圖1-B）。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)（圖1-D）表明，隨著5-Aza-CdR處理濃度的增大，早期凋亡率并沒(méi)有明顯的升高趨勢(shì)，晚期凋亡率在個(gè)別濃度處理下有所下降，但是死亡細(xì)胞的比例卻顯著增加（P＜0.01），細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例也與5-Aza-CdR處理濃度呈正相關(guān)。通過(guò)流式細(xì)胞儀，對(duì)5-Aza-CdR處理24 h組進(jìn)行了細(xì)胞周期分析，結(jié)果（圖1-C）顯示經(jīng)過(guò)1、2和3 μmol/L 5-Aza-CdR處理24 h后，G0/G1期和G2/M期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少。而且發(fā)現(xiàn)在2 μmol/L和3 μmol/L處理組中出現(xiàn)了少量比例的非整倍體細(xì)胞，這說(shuō)明高濃度的5-Aza-CdR會(huì)增加非整倍體的幾率，對(duì)細(xì)胞有毒性作用。

此外，5-Aza-CdR處理24 h后，處理組細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組沒(méi)有明顯的變化（圖2-A），但是48 h處理組與24 h相比，細(xì)胞形態(tài)更加扁平，細(xì)胞間隙變大（圖2-B）。使用1、2和3 μmol/L濃度的5-Aza-CdR分別處理轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞24 h后，檢測(cè)細(xì)胞染色體倍性的變化（圖3）。結(jié)果（表3）表明，1、2和3 μmol/L處理組都造成了體細(xì)胞整倍性率的降低，分別為78％、71％和60％，其中3 μmol/L處理組與對(duì)照組具有顯著性差異。由此可見(jiàn)高濃度（3 μmol/L）的5-Aza-CdR處理會(huì)導(dǎo)致染色體數(shù)目的異常。

圖2　不同濃度5-Aza-CdR處理轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞24 h（A）及48 h（B）對(duì)其細(xì)胞形態(tài)的影響

表3　5-Aza-CdR處理轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞染色體倍性分析

2.25-Aza-CdR對(duì)轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞AID等基因表達(dá)的影響

使用1 μmol/L 5-Aza-CdR處理轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞后，表達(dá)紅色熒光蛋白（DsRed）的細(xì)胞數(shù)量及其熒光的表達(dá)強(qiáng)度都明顯增加（圖4-A）。說(shuō)明5-Aza-CdR能夠誘導(dǎo)失活的DsRed啟動(dòng)子CMV重新激活。

使用Real-time PCR的方法檢測(cè)到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AID基因的牛胎兒成纖維細(xì)胞AID基因和多能性基因OCT4和NANOG表達(dá)明顯上升，但是SOX2基因的表達(dá)卻沒(méi)有明顯的改變；經(jīng)5-Aza-CdR處理后，SOX2的表達(dá)量都明顯提高（圖4-B）。為了進(jìn)一步分析5-Aza-CdR處理后SOX2的表達(dá)變化的原因，使用亞硫酸氫鹽PCR測(cè)序的方法分析了1 μmol/L 5-Aza-CdR處理的AID轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中OCT4、NANOG 和SOX2啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平。結(jié)果（圖4-C）顯示，5-Aza-CdR的處理降低了這些基因的甲基化水平，其中SOX2的變化具有顯著性差異。

2.35-Aza-CdR對(duì)AID基因敲減細(xì)胞的影響

圖3　5-Aza-CdR處理轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞對(duì)其染色體倍性的影響

圖4　5-Aza-CdR處理轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞對(duì)其基因表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步確認(rèn)干擾片段能夠有效地在牛胎兒成纖維細(xì)胞中起作用，對(duì)轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞中AID基因的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果（圖5-A）顯示，干擾片段能將AID基因的表達(dá)量降低至原水平的5.25％，可以高效的降解目標(biāo)基因mRNA，為后續(xù)研究提供良好的基礎(chǔ)。Western bloting結(jié)果（圖5-B）也證實(shí)轉(zhuǎn)染AID-siRNA干擾了正常AID基因的表達(dá)。

為了更好的分析AID基因?qū)Χ嗄苄曰虻淖饔茫狙芯繖z測(cè)了電轉(zhuǎn)染AID-siRNA 24 h后，細(xì)胞中多能性基因OCT4、NANOG和SOX2的表達(dá)變化。結(jié)果（圖5-C）顯示，干擾AID的表達(dá)后，OCT4和NANOG的表達(dá)沒(méi)有變化，但是SOX2的表達(dá)量發(fā)生了明顯的降低，提示AID對(duì)SOX2的表達(dá)起著至關(guān)重要的作用。1 μmol/L 5-Aza-CdR處理AID基因敲減細(xì)胞24 h后能夠顯著提高OCT4和SOX2基因的表達(dá)（圖5-D），但是NANOG基因和AID基因的表達(dá)量沒(méi)有明顯的變化（圖5-D）。

3　討論

圖5　5-Aza-CdR處理AID基因敲減細(xì)胞對(duì)其基因表達(dá)的影響

目前認(rèn)為，供體細(xì)胞在體細(xì)胞克隆過(guò)程中必然要經(jīng)歷重編程的過(guò)程，而體細(xì)胞克隆效率低下和克隆動(dòng)物異常的重要原因就是供體細(xì)胞錯(cuò)誤的重編程或重編程不徹底［26］。而在克隆胚胎的重編程過(guò)程中DNA甲基化是很重要的事件，DNA甲基化水平的降低可以激活或促進(jìn)多能基因的表達(dá)，進(jìn)而改善體細(xì)胞重編程的效率［13］。目前，研究人員主要通過(guò)使用藥物改變體細(xì)胞或重構(gòu)胚的表觀遺傳特性來(lái)改善體細(xì)胞重編程。5-Aza-CdR作為一種DNMT抑制劑，能夠抑制DNA的甲基化，從而降低基因組的整體甲基化水平，增強(qiáng)基因的表達(dá)量［16-18］。2002年，5-Aza-CdR成為美國(guó) FDA 首批批準(zhǔn)上市的去甲基化藥物，其主要用途就是治療MDS［27］。研究表明，使用5-Aza-CdR治療41例白血病后有一半的患者臨床癥狀減輕，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)患者的總體基因組DNA甲基化水平明顯降低［17］。本研究檢測(cè)了5-Aza-CdR處理的轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞報(bào)告基因的表達(dá)、細(xì)胞周期的分布、細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變、多能性基因的表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化的變化，進(jìn)而研究了5-Aza-CdR的整體去甲基化作用與AID的位點(diǎn)特異性去甲基化作用之間的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)高濃度5-Aza-CdR或者是長(zhǎng)時(shí)間的處理會(huì)明顯增加細(xì)胞的毒性，而使細(xì)胞增殖受到抑制，并阻止細(xì)胞進(jìn)入DNA復(fù)制期，細(xì)胞形態(tài)扁平化類(lèi)似于生長(zhǎng)過(guò)老的細(xì)胞的狀態(tài)，此外，染色體整倍性也會(huì)發(fā)生改變。而在低濃度和短時(shí)間內(nèi)處理對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、周期和染色體倍性沒(méi)有影響。以上研究說(shuō)明5-Aza具有一定的細(xì)胞毒性作用，為了能夠保證5-Aza不影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，本研究選擇用1 μmol/L 5-Aza-CdR處理細(xì)胞24 h。這樣既能保證藥物的作用效果又可以避免其對(duì)細(xì)胞的毒性損傷。

吳俠等［28］研究顯示，轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞中報(bào)告基因的表達(dá)會(huì)隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)及傳代次數(shù)的增加而明顯下降，本研究也觀察到了類(lèi)似的現(xiàn)象。有研究顯示，高濃度的5-Aza-CdR處理細(xì)胞能夠降低其基因組DNA甲基化，進(jìn)而增強(qiáng)外源報(bào)告基因的表達(dá)［29，30］。本研究所用過(guò)表達(dá)載體pCDsRed-PbAID的報(bào)告基因（DsRed）的表達(dá)是由CMV調(diào)控的，研究顯示CMV啟動(dòng)子能夠在哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛表達(dá)。但是，進(jìn)一步的觀察發(fā)現(xiàn)報(bào)告基因的表達(dá)隨著細(xì)胞的傳代培養(yǎng)被沉默［31］。通過(guò)分析CMV啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中其啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，其啟動(dòng)子區(qū)的8個(gè)CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基化［32］。本研究證實(shí)，使用5-Aza-CdR處理后轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞基因組甲基化水平下降，報(bào)告基因的表達(dá)能夠被恢復(fù)。因而推斷，報(bào)告基因表達(dá)的下降，與CMV啟動(dòng)子在傳代過(guò)程中的甲基化修飾有關(guān)。

供體細(xì)胞在受體卵母細(xì)胞胞質(zhì)中不完全的重編程或錯(cuò)誤重編程是導(dǎo)致克隆胚胎發(fā)育率低的重要原因［26］。使供體細(xì)胞的表觀遺傳特性更接近具有多能性的配子或卵裂球可能更有助于提高重編程的效率［33，34］。在豬的研究中，用5-Aza處理的細(xì)胞作為核供體，可以促進(jìn)重構(gòu)胚的發(fā)育［35］。在牛的研究中也有類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)。這些研究表明使用5-Aza處理能夠改善供體核的表觀遺傳特性從而最終提高克隆胚胎的發(fā)育率。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AID基因的牛胎兒成纖維細(xì)胞其AID、OCT4和NANOG基因表達(dá)明顯上升。這就提示在牛胎兒成纖維細(xì)胞中AID基因可以一定程度上改善其表觀遺傳特性。由于SOX2基因沒(méi)有明顯變化，暗示AID基因的DNA去甲基化作用具有位點(diǎn)特異性。5-Aza-CdR處理轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)OCT4和NANOG的表達(dá)量都沒(méi)有明顯的變化，但是SOX2的表達(dá)量明顯提高。此外，通過(guò)BSP的方法研究了5-Aza-CdR處理轉(zhuǎn)AID基因細(xì)胞中的OCT4、NANOG、SOX2的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR可以降低這幾個(gè)基因的甲基化水平，尤其是SOX2 （P＜0.05）。這說(shuō)明5-Aza-CdR雖然具有廣泛的DNA去甲基化作用，但是對(duì)于一些特定位點(diǎn)的去甲基化作用是不明顯的。我們之前的研究表明，AID基因轉(zhuǎn)入體細(xì)胞中，更有利于核移植胚胎的重編程，因而提高了體細(xì)胞克隆胚胎的卵裂率和發(fā)育率。綜合本研究5-Aza-CdR處理細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，可以推測(cè)AID基因的導(dǎo)入和5-Aza-CdR的聯(lián)合作用，可能更有利于體細(xì)胞克隆效率的提高。

此外，為了分析5-Aza-CdR的基因組整體去甲基化與AID基因的位點(diǎn)特異性去甲基化之間的關(guān)系，本研究使用電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)染AID siRNA來(lái)干擾AID基因的表達(dá)，同時(shí)使用1 μmol/L 5-Aza-CdR對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行處理。結(jié)果顯示，干擾AID基因后OCT4 和NANOG的表達(dá)沒(méi)有變化，但是SOX2的表達(dá)量發(fā)生了明顯的降低，而使用5-Aza-CdR能夠補(bǔ)償SOX2的表達(dá)。這就再一次證實(shí)了AID在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有DNA去甲基化作用，并且AID的DNA去甲基作用具有位點(diǎn)特異性。同時(shí)也說(shuō)明了5-Aza-CdR的DNA去甲基化作用與AID基因的導(dǎo)入聯(lián)合作用，更有利于體細(xì)胞克隆效率的提高。目前研究證實(shí)AID基因可以對(duì)5mC/5hmC脫氨基，然后在如MBD4或胸腺嘧啶DNA糖基化酶（Thymine DNA glycosylase，TDG）這些糖基化酶的作用下通過(guò)堿基切除修復(fù)（Base excision repair，BER）和錯(cuò)配修復(fù)（Mismatch repair，MMR）的作用下修復(fù)T-G錯(cuò)配從而最終實(shí)現(xiàn)DNA去甲基化［22，36］。在所有可能的AID基因去甲基化作用過(guò)程中，AID基因只是通過(guò)脫氨基作用來(lái)確定一個(gè)修飾后的堿基位點(diǎn)，而這一位點(diǎn)可能被修復(fù)復(fù)合體所錨定并修復(fù)，同時(shí)這一位點(diǎn)也可能不被修復(fù)復(fù)合體所識(shí)別［37］。此外，雖然現(xiàn)在不清楚AID基因如何選擇其靶位點(diǎn)，但是不可否認(rèn)其選擇具有一定的特殊性［36］。這兩個(gè)原因就造成了AID基因的DNA去甲基化作用具有位點(diǎn)特異性。

4　結(jié)論

基因表達(dá)的調(diào)控是一個(gè)多種調(diào)節(jié)方式協(xié)同的結(jié)果，5-Aza-CdR的基因組整體去甲基化與AID基因的位點(diǎn)特異性去甲基化對(duì)于體細(xì)胞重編程都具有重要的作用，在特定基因位點(diǎn)這兩種作用可以相互補(bǔ)充，二者聯(lián)合處理供體細(xì)胞可能更有利于體細(xì)胞重編程效率的提高。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Effect of DNA Methyltransferase Inhibitor 5-Aza-CdR on AID Gene-modified Bovine Fetal Fibroblasts

AO Xu-dong SA Ru-la WANG Jie WANG Hui-min YU Hai-quan
（Research Center for Laboratory Animal Science Inner Mongolia University，Hohhot 010021）

In order to improve the efficiency of somatic cell nuclear transfer，the researchers used drugs which can alter DNA methylation or histone modifications to benefit somatic cell nuclear transfer. Among them，5-aza-2'-deoxycytidine（5-Aza-CdR）blocked DNA methylation by inhibiting methyl group transfer to adenine or cytosine，and ultimately reduced genomic methylation. In this study，the AID-overexpressing and AID-knocked-down cells were used to study the effects of 5-Aza-CdR（1，2，3，4，and 5 μmol/L）on cell morphology，cell cycle，related gene expression and the changes of methylation status in the gene promoter region. Additionally，the differences between genomic DNA demethylation and site-specific DNA demethylation was analyzed，the methods and its action mechanism of increasing the reprogramming efficiency of somatic cells were discussed. Real-time PCR，BSP（Bisulfite Sequencing PCR），Western blotting，and flow cytometry were employed to analyze the effects of 5-Aza-CdR on the AID-transgenic and AID-knocked-down cells. The results showed that 5-Aza-CdR presented dose-dependent effect on AID-transgenic cells，while the 5-Aza-CdR concentration was 4 μmol/L，obvious toxicity was observed as a lot of cells were dead（P＜0.05）. When treated by 1-3 μmol/L，the cell's morphology changed，and proliferation of cells was inhibited. Karyotype analysis showed that 3 μmol/L treatments resulted in the emergence of a small proportion of aneuploidy cells，indicatingthat high concentrations of 5-Aza-CdR increased the rate of aneuploidy. The number of cells which expressed red fluorescent protein（DsRed）significantly increased after 1 μmol/L 5-Aza-CdR treatment，compared to the control group，the expression of AID and SOX2 were also increased，and the methylation levels in SOX2 promoter region were somehow decreased. After treated by 5-Aza-CdR，the expression of the OCT4 and SOX2 genes increased in AID-knocked-down cells，but the expression of the NANOG did not change. The above results revealed that 5-Aza-CdR treatment affected the cell morphology，cell cycle and reporter gene expression in bovine transgenic cells. In conclusion，while treated by 5-Aza-CdR，the genomic demethylation and loci-specific demethylation of AID act synergistically in somatic cell reprogramming.

5-Aza-CdR；AID；DNA demethylation；somatic cell nuclear transfer

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.016

2015-10-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31460311），內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012ZD04）

奧旭東，男，博士，研究方向：哺乳動(dòng)物生殖生物學(xué)；E-mail：aoxudong_123@126.com

于海泉，男，博士，研究員，研究方向：哺乳動(dòng)物生殖生物學(xué)；E-mail：haiquan_yu@yahoo.com