郭天璐張歡歡杜建中郝曜山王亦學(xué)孫毅

（1. 山西大學(xué)生物工程學(xué)院，太原 030006；2. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，太原 030031）

大蒜半胱氨酸合成酶的mRNA表達(dá)及生物信息學(xué)分析

郭天璐1張歡歡2杜建中2郝曜山2王亦學(xué)2孫毅2

（1. 山西大學(xué)生物工程學(xué)院，太原 030006；2. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，太原 030031）

半胱氨酸合成酶的產(chǎn)物半胱氨酸是植物中含硫氨基酸的重要來源，大蒜中含硫氨基酸豐富，研究大蒜半胱氨酸合成酶的性質(zhì)及生物學(xué)功能以明確其在大蒜硫代謝中的作用。利用生物信息學(xué)技術(shù)分析從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得的3個(gè)大蒜的半胱氨酸合成酶基因（AsGCS2、AsGCS3和AsGCS4）的開放閱讀框，預(yù)測其蛋白序列、分子量大小、蛋白質(zhì)特性、亞細(xì)胞定位、系統(tǒng)進(jìn)化等特征；通過熒光定量PCR分析了3個(gè)半胱氨酸合成酶的組織表達(dá)特性。結(jié)果顯示，AsGCS2、AsGCS3和AsGCS4的開放態(tài)讀碼框長度分別為1 152 bp、1 296 bp和1 236 bp；其編碼蛋白的理論相對分子量分別為40.6 kD、34.1 kD和36.1 kD。AsGCS2被亞細(xì)胞定位于葉綠體中，而AsGCS3和AsGCS4均被定位于細(xì)胞質(zhì)中。氨基酸比對結(jié)果表明，AsGCS2與AsGCS3相似度為70％，與AsGCS4相似度為59％；而AsGCS3與AsGCS4相似度為68％。進(jìn)化分析圖表明，AsGCS2屬于Bsas2亞家族，AsGCS3屬于Bsas1亞家族，AsGCS4屬于Bsas6亞家族。熒光定量PCR結(jié)果表明，大蒜不同CSase的組織特異性是不同的，AsGCS2在葉中表達(dá)量最高，ASGCS3在根中表達(dá)量最高，而ASGCS4在葉和根中都有較高的表達(dá)量。3個(gè)半胱氨酸合成酶基因分別屬于不同的Bsas亞家族，它們的組織表達(dá)特性也不相同，它們在大蒜不同組織中的半胱氨酸合成途徑中起作用。

大蒜；半胱氨酸合成酶；熒光定量PCR

大蒜（Allium sativum）是百合科蔥屬的多年生草本植物，自古以來一直是食藥兩用的食品，其中蒜素（Allicin）被認(rèn)為有較強(qiáng)的抗微生物活性［1］。此外，大蒜中還含有20多種含硫化合物，而這些含硫化合物的生成都離不開半胱氨酸。半胱氨酸是蛋白及谷胱甘肽中的重要成分，也是甲硫氨酸與植物含硫化合物的硫供體，是蒜氨酸合成的必要成分。半胱氨酸生物合成是由絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（Serine acetyltransferase，SATase）和半胱氨酸合成酶（Cysteine synthase，CSase）完成［2］。半胱氨酸合成酶也稱作O-乙酰絲氨酸硫解酶（O-acetylserine（thiol）lyase，OAS），催化O-乙酰絲氨酸和硫化氫合成半胱氨酸。在半胱氨酸合成酶的催化下H2S與O-乙酰絲氨酸反應(yīng)生成Cys，且半胱氨酸合成酶能與絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶形成復(fù)合物［3，4］。半胱氨酸合成酶屬于β-取代丙氨酸合成酶家族（β-substituted alanine synthases family，Bsas）需要磷酸吡哆醛作為輔酶［5］。目前，從許多植物中都克隆到了半胱氨酸合成酶，分別位于細(xì)胞質(zhì)、線粒體、葉綠體這些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中［6］。半胱氨酸合成酶基因的表達(dá)受到氮、硫、光照及重金屬等環(huán)境因素調(diào)節(jié)［7-9］。過表達(dá)半胱氨酸合成酶的煙草，由于提高了體內(nèi)半胱氨酸及谷胱甘肽的含量，增加了其對重金屬、氧化、除草劑等逆境的耐受性［10-13］。

本研究從NCBI 數(shù)據(jù)庫檢索到3個(gè)大蒜的半胱氨酸合成酶基因，通過生物信息學(xué)軟件分析這些基因的性質(zhì)，通過熒光定量PCR分別檢測其在不同組織部位的相對表達(dá)量，旨在為大蒜半胱氨酸合成酶的生物功能研究及應(yīng)用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

山東金鄉(xiāng)白皮大蒜，購買自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

1.2方法

1.2.1序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索到3條大蒜CSase的cDNA序列。利用ExPASy網(wǎng)站的Translate工具將大蒜CSase的cDNA翻譯成氨基酸序列；利用ExPASy服務(wù)器ProtParam、ProtScale工具預(yù)測CSase蛋白的親疏水性和理化性質(zhì)；利用TMHMM工具分析了CSase蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；利用SignalP4.1 預(yù)測CSase蛋白的信號(hào)肽；利用PSORT 預(yù)測ScCBF1的亞細(xì)胞定位；并在PSIpred網(wǎng)站上預(yù)測CSase的二級結(jié)構(gòu)（表1）。利用ClustalX與其他物種的CSase氨基酸序列進(jìn)行多序列比對；利用MEGA5.1（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1　生物信息學(xué)研究的數(shù)據(jù)庫及軟件網(wǎng)址

1.2.2大蒜CSase和Alliinase的mRNA表達(dá)特性 用Primer Primer5在獲得的cDNA序列中選擇合適的區(qū)域，設(shè)計(jì)大蒜CSase的mRNA表達(dá)引物及Alliinase的mRNA的表達(dá)引物（表2）。

表2　大蒜CSase及Alliinase研究中使用的引物

將大蒜種植于花盆中，取發(fā)芽后7 d大蒜的根、莖、葉的組織。每3株的組織混合為一個(gè)重復(fù)，每個(gè)樣品取3次重復(fù)。所有的材料用75％酒精擦拭表面后液氮速凍，于-70℃冰箱保存。采用RNAiso （TaKaRa）提取以上材料的總RNA，經(jīng) BioPhotometer plus核酸蛋白儀（Eppendorf）定量后，取2 μg總RNA作為模板用Reverse TranscriptaseM-MLV（RNase H-）（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

以上述的反轉(zhuǎn)錄的cDNA（5×稀釋）為模板，以EF1a作為內(nèi)參基因（表2），在ABI公司的7300 Real-time PCR儀完成定量PCR擴(kuò)增。每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)。SYBR Green試劑盒采用TransGen公司的TransStart Green qPCR SuperMix UDG，擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃ 2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)。

2　結(jié)果

2.1生物信息學(xué)分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫獲得3個(gè)大蒜CSase基因，分別是AsGCS2（GenBank：AY766093）AsGCS3（Gen-Bank：AY766094）、AsGCS4（GenBank：AY766095），對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果見表3。

表3　大蒜CSase生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.1.1AsGCS2生物信息學(xué)分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得大蒜的AsGCS2的cDNA序列長度為1 424 bp，其中ORF長度為1 152 bp（36-1 187 bp），其對應(yīng)的多肽為383個(gè)氨基酸。Protparam分析表明，AsGCS2理論的分子質(zhì)量為40.6 kD，理論的等電點(diǎn)為8.73，不穩(wěn)定系數(shù)為35.74，表明其為相對穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為92.27，總平均疏水性為0.019，表明該蛋白可能是一種疏水蛋白。

利用TMHMM在線分析，結(jié)果表明該蛋白未發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)域，因此AsGCS2不是跨膜蛋白。利用SignalP4.1Server在線軟件對大蒜的AsGCS2蛋白信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測分析結(jié)果表明，該蛋白N端不存在任何信號(hào)肽序列，是非分泌蛋白。利用PSORT在線軟件分析得知AsGCS2定位于葉綠體中。在PSIpred網(wǎng)站上預(yù)測AsGCS2的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)AsGCS2包含12個(gè)α螺旋，10個(gè)β折疊。

2.1.2AsGCS3生物信息學(xué)分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得大蒜AsGCS3的cDNA序列長度為1 296 bp，其中ORF長度為972 bp（125-1 096 bp），其對應(yīng)的多肽為323個(gè)氨基酸。Protparam分析表明，AsGCS3理論的分子質(zhì)量為34.1 kD，理論的等電點(diǎn)為5.80，不穩(wěn)定系數(shù)為29.98，表明其為相對穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為103.9，總平均疏水性為0.12，表明該蛋白可能是一種疏水蛋白。

利用TMHMM在線分析，結(jié)果表明該蛋白未發(fā)現(xiàn)任何的跨膜結(jié)構(gòu)域，表明AsGCS3也不是跨膜蛋白。利用SignalP4.1Server在線軟件對大蒜的AsGCS3蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果表明該蛋白N端不存在信號(hào)肽序列，同樣是非分泌蛋白。利用PSORT在線軟件分析得知AsGCS3定位于細(xì)胞質(zhì)中。在PSIpred網(wǎng)站上預(yù)測AsGCS3的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)AsGCS3包含11個(gè)α螺旋，10個(gè)β折疊。

2.1.3AsGCS4生物信息學(xué)分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得大蒜AsGCS4的cDNA序列長度為1 236 bp，其中ORF長度為1 020 bp（60-1 079 bp），其對應(yīng)的多肽為343個(gè)氨基酸。Protparam分析表明，AsGCS4理論的分子質(zhì)量為36.1 kD，理論的等電點(diǎn)為5.30，不穩(wěn)定系數(shù)為36.4，表明其為相對穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為89.76，總平均疏水性為-0.071，表明該蛋白可能是一種親水蛋白。

利用TMHMM在線分析，結(jié)果表明AsGCS4蛋白未發(fā)現(xiàn)任何的跨膜結(jié)構(gòu)域，表明此蛋白不是跨膜蛋白。利用SignalP4.1Server在線軟件對大蒜的AsGCS4蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測分析結(jié)果表明，AsGCS4蛋白N端不存在信號(hào)肽序列，同樣也是非分泌蛋白。利用PSORT在線軟件分析得知AsGCS4定位于細(xì)胞質(zhì)中。利用PSIpred網(wǎng)站軟件預(yù)測AsGCS4的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)AsGCS4包含10個(gè)α螺旋，11個(gè)β折疊。

2.2蛋白多序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

用GeneDoc將從NCBI數(shù)據(jù)庫中找到的3個(gè)半胱氨酸合成酶基因：AsGCS2、AsGCS3、AsGCS4進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，AsGCS2與AsGCS3相似性為70％，與AsGCS4相似性為59％，而AsGCS3與AsGCS4相似性為68％，說明它們之間具有很高的保守性。Saito等［14］在1993年已經(jīng)證明賴氨酸是與輔酶磷酸吡哆醛連接的重要位點(diǎn)。如圖1所示，第98-116位氨基酸是半胱氨酸合成酶的PLP連接位點(diǎn)，并具有保守序列KXEXXXPXXSVKDR（方框部分），其中活性位點(diǎn)中心的第二個(gè)賴氨酸殘基（Lys109）連接PLP（圖1圓圈標(biāo)注），酶活性位點(diǎn)的19個(gè)氨基酸殘基在植物中高度保守。

圖1　大蒜CSase氨基酸序列比對結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)通過將已知亞細(xì)胞定位的其他物種的半胱氨酸合成酶基因進(jìn)行序列比對后，用ClustalX、MEGA5.1（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果（圖2）顯示，按照它們亞細(xì)胞定位的不同大體可以分為6個(gè)亞家族，我們所研究的AsGCS2屬于Bsas2（葉綠體CSase），AsGCS3屬于Bsas1（細(xì)胞質(zhì)CSase），AsGCS4位于細(xì)胞質(zhì)，但是屬于Bsas6，一個(gè)功能未知的亞家族。

2.3CSase（AsGCS2、AsGCS3、AsGCS4）和Alliinase（AsALL）基因的組織特異性表達(dá)

通過對大蒜萌發(fā)時(shí)期根、假莖、葉組織的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行Real-time PCR分析可以看出（圖3），大蒜不同的組織部位CSase的表達(dá)程度是不同的，AsGCS2在葉部位表達(dá)量達(dá)到最高，AsGCS3表達(dá)量最高的部位為根，AsGCS4在葉和根中都有較高的表達(dá)量?？傮w而言CSase在根部都有較高的表達(dá)量，假莖部表達(dá)量較低，與之相反，AsALL在根部表達(dá)量較低。

3　討論

半胱氨酸合成酶屬于Bsas家族，基于一級結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位，Hatzfeld將其分成6個(gè)亞家族：Bsas1，細(xì)胞質(zhì)CSase；Bsas2，葉綠體CSase；Bsas3，線粒體CAS；以及未定位的Bsas4，Bsas5 和Bsas6［6］。Bsas1、Bsas2主要的活性都是合成Cys［15］。Bsas3類的β-氰丙氨酸合成酶（β-Cyanoalanine synthase，β-CAS）催化氫氰酸與L-半胱氨酸結(jié)合生成β-氰丙氨酸，具有使氰化物脫毒的功能，且都需要磷酸吡哆醛（pyridoxal 5'-phosphate，PLP）作為輔基。其序列及結(jié)構(gòu)與半胱氨酸合成酶相似，定位于線粒體中［16］。有些Bsas3中的β-CAS具有合成半胱氨酸與β-氰丙氨酸的雙重功能［16-18］。Bsas4的Case活性很低，沒有CAS活性［6］。CSase-like 蛋白At5g28030被證明具有半胱氨酸脫硫酶的活性［19］。Bsas5的酶具有S-硫胱氨酸合成酶（S-sulfocysteine synthase）活性，沒有半胱氨酸合成酶活性［20］。Bsas6的酶定位于細(xì)胞質(zhì)中，但其功能尚不清楚。AsGCS4與Bsas6的酶序列相近，但與所有已知的半胱氨酸合成酶的差異較大，也可能屬于一個(gè)新的Bsas亞家族Bsas7，由于缺乏相關(guān)功能研究結(jié)果與AsGCS4相關(guān)序列的支持，暫時(shí)將AsGCS4歸入Bsas6中。

圖2　Bsas家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

半胱氨酸是合成蒜氨酸及蒜素的重要前體，為了研究哪個(gè)半胱氨酸合成酶與蒜氨酸及蒜素合成有關(guān)，比較了3種CSase酶與蒜氨酸酶在大蒜不同組織部位的表達(dá)，未發(fā)現(xiàn)與蒜氨酸酶表達(dá)完全吻合的基因在葉與根中表達(dá)量均較高。蒜氨酸酶在葉和假莖中表達(dá)較高，半胱氨酸合成酶的表達(dá)模式與其均不相同，可能大蒜中還存在其他未知的半胱氨酸合成酶，擬南芥中有至少8個(gè)CSase-like蛋白，玉米與水稻中有5個(gè)CSase-like蛋白。

半胱氨酸合成酶催化半胱氨酸合成，其產(chǎn)物半胱氨酸對無機(jī)硫的同化起中心作用，為甲硫氨酸、谷胱甘肽及植物中的多種含硫次級代謝物的生物合成提供唯一的硫化物供體［21］。半胱氨酸合成酶的表達(dá)受到氮、硫、鹽等非生物脅迫的調(diào)節(jié)，過量表達(dá)半胱氨酸合成酶能夠增加植物體內(nèi)谷胱甘肽含量，提高植物對逆境的抵抗力［22］。半胱氨酸在植物免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，擬南芥OAS-Al的突變體導(dǎo)致對致病菌的免疫力下降［23］。由于半胱氨酸的重要作用，植物中的半胱氨酸合成酶是冗余的，OAS-TL A，OAS-TL B貢獻(xiàn)了半胱氨酸合成酶活性的絕大部分，半胱氨酸合成酶對花粉發(fā)育具有重要作用，OAS-TL A，OAS-TL B，OAS-TL C全部缺失的花粉發(fā)育受到影響［24］。這些研究表明半胱氨酸合成酶在植物抗逆，抗損傷以及免疫調(diào)節(jié)方面具有重要作用。大蒜中半胱氨酸、谷胱甘肽等含硫化合物的組分遠(yuǎn)高于其他植物，因此，研究其半胱氨酸合成酶的表達(dá)及生物學(xué)功能具有重要意義。

圖3　CSase（AsGCS2、AsGCS3、AsGCS4）和Alliinase基因的不同組織特異性表達(dá)

4　結(jié)論

AsGCS2屬于Bsas2葉綠體CSase亞家族，亞細(xì)胞定位于葉綠體，在葉中表達(dá)量最高；AsGCS3屬于Bsas1線粒體CAS亞家族，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)，在根中表達(dá)量最高；AsGCS4屬于Bsas6亞家族，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)，在葉和根中都有較高的表達(dá)量。除此之外，它們在大蒜不同組織中的半胱氨酸合成途徑中起作用。

［1］Yoshimoto N， Yabe A， Sugino Y， et al. Garlic gamma-glutamyl transpeptidases that catalyze deglutamylation of biosynthetic intermediate of alliin［J］. Front Plant， 2015， 5：758-768.

［2］Urano Y， Manabe T， Noji M， Saito K. Molecular cloning and functional characterization of cDNAs encoding cysteine synthase and serine acetyltransferase that may be responsible for high cellular cysteine content in Allium tuberosum［J］. Gene， 2000， 257（2）：269-277.

［3］ Ravina CG， Chang CI， Tsakraklides GP， et al. The sac mutantsof chlamydomonas reinhardtii reveal transcriptional and posttranscriptional control of cysteine biosynthesis［J］. Plant Physiol， 2002，130：2076-2084.

［4］Ikegami F， Itagaki S， Murakoshi I. Purification and characterization of two forms of cysteine synthase from Allium tuberosum［J］. Phytochemistry， 1992， 32：31-34.

［5］Ikegami F， Murakoshi I. Enzymic synthesis of non-protein β-substituted alanines and some higher homologues in plants［J］. Phytochemistry， 1994， 35（5）：1089-1104.

［6］Hatzfeld Y， Maruyama A， Schmidt A， et al. β-Cyanoalanine synthase is a mitochondrial cysteine synthase-like protein in spinach andArabidopsis［J］. Plant Physiology， 2000， 123（3）：1163-1172.

［7］Takahashi H， Saito K. Subcellular localization of spinach cysteine synthase isoforms and regulation of their gene expression by nitrogen and sulfur［J］. Plant Physiology， 1996， 112（1）：273-280.

［8］CintiaGoulart K， Masaaki N， Michimi N， et al. Heavy metal tolerance of transgen ic tobacco plants over- expressing cysteine synthase［J］. Biotechnology Letters， 2004， 26：153-157.

［9］Nakamura T， Yamaguchi Y， Sano H. Four rice genes encoding cysteine synthase：isolation and differential responses to sulfur，nitrogen and light［J］. Gene， 1999， 229（1-2）：155-161.

［10］Noji M， Saito M， Nakamura M， et al. Cysteine synthase overexpression in tobacco confers tolerance to sulfur-containing environmental pollutants［J］. Plant Physiology， 2001， 126（3）：973-980.

［11］Youssefian S， Nakamura M， Orudgev E， et al. Increased cysteine biosynthesis capacity of transgenic tobacco overexpressing an O-acetylserine（thiol）lyase modifies plant responses to oxidative stress［J］. Plant Physiology， 2001， 126（3）：1001-1011.

［12］Domínguez-Solís JR， Gutiérrez-Alcala G， Romero LC， et al. Cytosolic O-acetylserine（thiol）lyase gene is regulated by heavy metals and can function in cadmium tolerance［J］. Journal of Biological Chemistry， 2000， 276（12）：9297-9302.

［13］Nakamura M， Ochiai T， Noji M， et al. An improved tolerance to cadmium by overexpression of two genes for cysteine synthesis in tobacco［J］. Plant Biotechnology， 2014， 31（2）：141-147.

［14］Saito K， Kurosawa M， Murakoshi I. Determination of a functional lysine residue of a plant cysteine synthase by site-directed mutagenesis， and the molecular evolutionary implication［J］. FEBS Lett， 1993， 328：111-114.

［15］Hell R， Bork C， Bogdanova N， et al. Isolation and characterization of two cDNAs encoding for compartment specific isoforms of O-acetylserine（thiol）lyase from Arabidopsis thaliana［J］. FEBS Lett， 1994， 351：257-262.

［16］Marrero-Degro J， Marcano-Velázquez J， Siritunga D. Isolation and characterization of novel β-cyanoalanine synthase and cysteine synthase genes from cassava［J］. Plant Molecular Biology Reporter， 2011， 29（3）：514-524.

［17］王小芳， 楊玲娟， 董曉寧， 等. 植物半胱氨酸合成及調(diào)控研究進(jìn)展［J］. 植物生理學(xué)報(bào)， 2011， 47（1）：37-48.

［18］Ikegami F， Takayama K， Murakoshi I. Purification and properties of β-cyano-l-alanine synthase from Lathyrus latifolius［J］. Phytochemistry， 1988， 27：3385-3389.

［19］álvarez C， Calo L， Romero LC， et al. An Oacetylserine（thiol）lyase homolog with L-cysteine desulfhydrase activity regulates cysteine homeostasis in Arabidopsis thaliana［J］. Plant Physiol，2010， 152：656-669.

［20］Bermudez MA， Galmes J， Moreno I， et al. Photosynthetic adaptation to length of day is dependent on S-sulfocysteine synthase activity in the Thylakoid lumen［J］. Plant Physiol， 2012， 160（1）：274-288.

［21］Bonner ER， Cahoon RE， Knapke SM， et al. Molecular basis of cysteine biosynthesis in plants：Structural and functional analysis of O-acetylserine sulfhydrylase from Arabidopsis thaliana［J］. Journal of Biological Chemistry， 2005， 280（46）：38803-38813.

［22］許奕， 金志強(qiáng)， 宋順， 等. 香蕉MaCSase 基因的克隆和表達(dá)分析［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2012， 28（34）：202-210.

［23］álvarez C， ángeles Bermúdez M， Romero LC， et al. Cysteine homeostasis plays an essential role in plant immunity［J］. New Phytologist， 2012， 193（1）：165-177.

［24］Birke H， Heeg C， Wirtz M， et al. Successful fertilization requires the presence of at least one major O-acetylserine（thiol）lyase for cysteine synthesis in pollen of Arabidopsis［J］. Plant Physiology，2013， 163（2）：959-972.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

mRNA Expression and Bioinformatics Analysis of Cysteine Synthase in Allium sativum

GUO Tian-lu1ZHANG Huan-huan2DU Jian-zhong2HAO Yao-shan2WANG Yi-xue2SUN Yi2
（1. College of Bio-engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006；2. Research Center of Biotechnology，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031）

The cysteine synthesized by cysteine synthase is an important source of amino acids containing sulfur in plants. The amino acid with sulfur in garlic is abundant，thus we studied the properties and biological functions of garlic cysteine synthase in order to clarify its role in the metabolism of garlic. Three cysteine synthase genes of garlic，AsGCS2，AsGCS3 and AsGCS4 were found from NCBI database，and then bioinformatics analysis and RT-PCR were conducted. The lengths of their open reading frames were 1 152 bp，1 296 bp，and 1 236 bp，respectively. The theoretical relative molecular weights of their encoded enzymes were 40.6 kD，34.1 kD，and 36.1 kD，respectively. By subcellular localization，AsGCS2 was localized in the chloroplasts，while AsGCS3 and AsGCS4 were localized in the cytoplasm. The results of the amino acid sequence alignment revealed that the similarity of AsGCS2 with AsGCS3 was 70％，and that with AsGCS4 was 59％，while it was 68％ between AsGCS3 and AsGCS4. Phylogenetic analysis showed that AsGCS2 belonged to Bsas2，AsGCS3 belonged to Bsas1，but AsGCS4 was different from all known cysteine synthases，possibly belonging to Bsas6. RT-PCR expression analysis indicated that the expression levels of CSase varied in various tissues. The expression level of AsGCS2 was the highest in the leaves，the highest expression of AsGCS3 was in the root，and AsGCS4 expressed highly in both leaves and roots. In conclusion，3 cysteine synthase gene AsGCS2，AsGCS3，and AsGCS4 belong to the different subfamilies of Bsas，their tissue expression characteristics were not the same，and they play a role in different tissues of garlic in cysteine biosynthesis.

Allium sativum；cysteine synthase；qRT-PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.015

2015-10-21

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2014ZX08003001-002-003）

郭天璐，女，碩士研究生，研究方向：植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)；E-mail：421489192@qq.com

孫毅，男，博士，研究方向：植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)；E-mail：sunyi692003@163.com張歡歡，男，碩士，研究方向：轉(zhuǎn)基因抗蟲技術(shù)；E-mail：frank.red@163.com