馮艷芳耿麗麗韓榕張杰

（1. 山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨汾 041004；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

花生NBS-LRR類(lèi)基因的克隆及表達(dá)特性分析

馮艷芳1，2耿麗麗2韓榕1張杰2

（1. 山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨汾 041004；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

基于花生轉(zhuǎn)錄組及基因組數(shù)據(jù)，克隆獲得一個(gè)花生的NBS-LRR類(lèi)抗逆基因的全長(zhǎng)序列，該基因與大豆抗病性蛋白基因（KHN40407.1）的相似性為79％，命名為AhNDrp基因。該基因不含內(nèi)含子，cDNA 全長(zhǎng)2 832 bp，有5個(gè)典型的抗逆性蛋白保守結(jié)構(gòu)域，其中DomainⅤ是富含亮氨酸的重復(fù)序列。熒光定量PCR分析表明，AhNDrp基因在花生根中特異性表達(dá)，且黃曲霉處理后該基因表達(dá)量顯著上升，說(shuō)明該基因可能參與抗病反應(yīng)。

花生；NBS-LRR基因；基因克隆；表達(dá)分析

栽培花生（Arachis hypogaea L.）作為一種重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。2015年我國(guó)花生的總產(chǎn)量達(dá)1 670萬(wàn)t，居世界首位。但是一些生物及非生物脅迫會(huì)影響花生的產(chǎn)量和品質(zhì)，如干旱、鹽堿、低溫、寒冷、高溫及各種病原菌等外界不良環(huán)境會(huì)延緩植物的生長(zhǎng)發(fā)育，降低植物的生產(chǎn)效率，甚至在極端條件下，會(huì)導(dǎo)致植物死亡。植物的應(yīng)激反應(yīng)是動(dòng)態(tài)的，涉及到不同調(diào)節(jié)水平之間錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系，包括新陳代謝的調(diào)節(jié)、生理上基因表達(dá)的調(diào)節(jié)和形態(tài)上的適應(yīng)等［1］。使用寄主抗性是控制植物病害最有效、經(jīng)濟(jì)的方式［2］。

有研究表明，抗病基因（R基因）在識(shí)別和抵御病原菌入侵方面具有重要作用。編碼具有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（NBS）和C-末端富含亮氨酸重復(fù)（LRR）的基因，是R基因中最大一類(lèi)抗性基因［3］。植物NBS-LRR蛋白（nucleotide-binding site-leucine rich re-peat protein）根據(jù)氨基酸末端序列可分為兩類(lèi)，卷曲螺旋（CC）- NBS-LRR類(lèi)蛋白質(zhì)和TIR-NBSLRR類(lèi)蛋白，后一類(lèi)蛋白在單子葉植物中尚未被鑒別［4，5］，而且TIR-NBS-LRR類(lèi)蛋白可能比CC-NBSLRR型蛋白起源更早［6］。抗逆性反應(yīng)的識(shí)別過(guò)程是基于NBS-LRR蛋白介導(dǎo)的直接或間接的識(shí)別病理分子——無(wú)毒蛋白AVR進(jìn)行的，而AVR蛋白突變會(huì)使抗逆性反應(yīng)過(guò)程中識(shí)別異常，從而導(dǎo)致抗性異常。也有研究表明，抗性反應(yīng)的識(shí)別過(guò)程是通過(guò)NBSLRR蛋白與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用進(jìn)行的，Shen 等［7］的研究表明，在大麥中識(shí)別白粉病抗性蛋白（Mla10）是通過(guò)CC結(jié)構(gòu)域與一個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域的相互作用，進(jìn)行防御反應(yīng)。NBS結(jié)構(gòu)域位于NBSLRR型蛋白的中間區(qū)域，存在于真核生物具有結(jié)合ATP和GTP的許多蛋白質(zhì)之中，如ATP合成酶β亞基、核糖體延伸子、腺苷酸激酶以及抗病基因編碼蛋白等。NBS結(jié)構(gòu)域可以與核苷酸進(jìn)行結(jié)合，LRR結(jié)構(gòu)域在將感知到的病原體激活方面起著至關(guān)重要的作用［8-10］。

花生作為豆科植物家族中的一個(gè)重要成員，其N(xiāo)BS-LRR類(lèi)基因在不同脅迫下的功能分析報(bào)道尚不多見(jiàn)。本研究以花生抗逆性基因AhNDrp為研究對(duì)象，以本課題組此前獲得的花生根轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)為依據(jù)［11］，從基因注釋結(jié)果中篩選到contig281453為花生抗逆性蛋白，獲得基因的半長(zhǎng)序列，利用電子克隆技術(shù)獲得AhNDrp全長(zhǎng)基因，從而分析該基因在花生不同組織部位（根、莖、葉、幼胚）的表達(dá)情況以及干旱和黃曲霉脅迫下的表達(dá)特性，旨在為花生抗黃曲霉的機(jī)理研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)材料與處理 供試花生栽培品種白沙1016，由山東省花生研究所提供?；ㄉ?、莖、葉取自2周齡的組培苗，幼胚子葉為收集果針入土后25-55 d不同大小的花生莢果，剝皮后混合。所有植物材料取樣后于液氮中迅速冷凍，在-80℃冰箱保存。干旱處理：當(dāng)花生生長(zhǎng)至15 d左右時(shí)，選擇健壯且長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，用15％ PEG6000溶液模擬干旱處理，分別取未處理及處理后2、4、6和8 h的幼苗根，液氮速凍后于-80℃保存，用于總RNA提取和熒光定量PCR分析。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

黃曲霉處理：花生剝?nèi)シN皮后種植于溫室中，3周后接種黃曲霉孢子。用無(wú)菌水收集在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3 d 的黃曲霉菌孢子，調(diào)整孢子濃度為6×108/ mL［12］，噴于花生的根部，分別取未處理及處理后 1、3、5和7 d的幼苗根，液氮速凍后，于-80℃保存，用于熒光定量PCR分析。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.1.2酶及主要試劑 Primer Star高保真聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司；2×Taq Mix PCR擴(kuò)增試劑購(gòu)自北京博邁得生物技術(shù)有限公司；pMD19-T Vector購(gòu)自TaKaRa公司；DNA Marker DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Promega公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。PCR產(chǎn)物測(cè)序由北京華大生物技術(shù)有限公司完成。反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR試劑盒為北京天根公司FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒和SYBR Green熒光定量試劑盒。

1.1.3PCR 引物 引物的合成由上海生工生物技術(shù)有限公司完成，引物序列見(jiàn)表 1。

表 1 本研究所用的基因克隆和real-time的引物序列

1.1.4生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件 花生基因組網(wǎng)址（http：//peanutbase.org）；序列檢索采用NCBI blast （http：//www.ncbi.nlm.Nih.gcv/blast）；蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析在（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi）進(jìn)行；三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)在（http：//swissmodel. expasy.org/workspace/index.php？func=modelling_ simple1）進(jìn)行；氨基酸同源性比對(duì)分析采用DNAMAN軟件；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建采用MEGA4.0軟件。

1.2方法

1.2.1花生基因組的提取 花生基因組DNA的提取采用改良的CTAB法［13］。將提取基因組放于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2NBS-LRR類(lèi)基因全長(zhǎng)獲得 根據(jù)peanutDB上序列，設(shè)計(jì)引物見(jiàn)序列表 1。以花生栽培品種白沙1016基因組為模板，AhNDrp-f和AhNDrp-r為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 10 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。取PCR產(chǎn)物電泳，選取目的條帶，回收、克隆到 pMD19-T Vector，經(jīng) PCR 鑒定正確后進(jìn)行測(cè)序拼接。

1.2.3RNA的提取、cDNA第一鏈的合成 RNA的提取 采用上海生工生物工程有限公司TRIzol試劑，提取方法參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。TaKaRa公司的DNaseⅠ用于消化殘留 DNA，cDNA 第一條鏈的合成用天根的FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒。

1.2.4花生AhNDrp的mRNA轉(zhuǎn)錄分析 分別提取花生2周齡的根、莖、葉和不同生長(zhǎng)時(shí)期混合幼胚的總RNA及干旱和黃曲霉接種處理下不同時(shí)期的花生根總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行AhNDrp基因表達(dá)特性分析。用天根公司的SYBR Green熒光定量試劑盒檢測(cè)花生AhNDrp基因的表達(dá)量。設(shè)actin基因?yàn)閮?nèi)部參照，AhNDrp-real-time-f和AhNDrp-realtime-r分別為擴(kuò)增目的基因的上下游引物。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 15 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。序列中不包含內(nèi)含子，編碼943個(gè)氨基酸，終止密碼子為T(mén)AG（圖2）。

圖1　AhNDrp基因的擴(kuò)增結(jié)果

圖2　AhNDrp基因的結(jié)構(gòu)示意圖

2　結(jié)果

2.1AhNDrp全長(zhǎng)基因的獲得與序列分析

本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得一條1 970 bp的EST序列（contig281453），在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，注釋為NBS-LRR型抗逆性蛋白（NBS-LRR type disease resistance protein）。將該序列與http：//peanutbase.org網(wǎng)站上公布的花生基因組序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果設(shè)計(jì)引物（AhNDrp-f/r），以花生基因組為模板，擴(kuò)增得到3 200 bp的片段（圖1），送測(cè)序。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性比較，該蛋白與大豆抗逆性蛋白（Glycine soja disease resistance protein RPM1，GenBank No：KHN40407.1）的相似性最高為79％。將該基因命名為AhNDrp基因，編碼區(qū)為2 832 bp，GenBank登錄號(hào)為KU128398。AhNDrp基因DNA序列與cDNA序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，AhNDrp基因DNA

2.2AhNDrp蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1AhNDrp蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用CDD（conserved domain database）在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)AhNDrp蛋白有5個(gè)典型的抗逆性蛋白保守結(jié)構(gòu)域（圖3）。其中DomainⅠ為RX-CC-like結(jié)構(gòu)域，位于2-127區(qū)，與抗病反應(yīng)的必要因素RanGAP2相互作用；DomainⅡ?yàn)锳AA-ATP酶結(jié)構(gòu)域，由117個(gè)氨基酸組成，包含一個(gè)P-Loop（NBS結(jié)構(gòu)域中的保守基序）元件；DomainⅤ位于595-804區(qū)，由209個(gè)氨基酸組成，是富含亮氨酸重復(fù)序列，LRR基序可參加蛋白-蛋白互作，在分子識(shí)別過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。這3個(gè)保守區(qū)域說(shuō)明AhNDrp屬于NBS-LRR型抗逆性蛋白。

利用同源建模的分析工具SWISS-MODEL對(duì)花生NDrp蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行三維結(jié)預(yù)測(cè)。軟件自動(dòng)選擇PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的2qkwB作為模板，對(duì)目標(biāo)蛋白的605-879氨基酸進(jìn)行3-D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，如圖4所示，蛋白的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域是由132個(gè)α-螺旋、65個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲、52個(gè)延伸鏈和26個(gè)β-折疊連接共同構(gòu)成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。

圖3　花生AhNDrp蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析

圖4　花生NDrp蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

2.2.2AhNDrp蛋白同源性分析 將AhNDrp蛋白序列與豆科植物花生、大豆、野生大豆、鷹嘴豆、菜豆（Phaseolus vulgaris，XP_007158209.1）、苜蓿（Medicago truncatula，AF491998.1）和非豆科植物白梨（P.×bretschneideri，XP_009373508.1）、蘋(píng)果（Malus domestica，XP_008342592.1）、薔薇科落葉喬木植物梅（Prunus mume，XP_008238133.1）、可可（Theobroma cacao，XP_007040756.1）、川桑（Morus notabilis，XP_010110397.1）的抗逆性蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖5）。白沙1016號(hào)花生AhNDrp蛋白與白梨和蘋(píng)果的進(jìn)化關(guān)系最近；苜蓿和菜豆等次之；與鷹嘴豆、梅的進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.3AhNDrp基因在干旱和黃曲霉處理下的表達(dá)特性分析

通過(guò)熒光定量PCR方法分析花生品種BS1016 中AhNDrp基因的表達(dá)情況，結(jié)果（圖6-A）顯示AhNDrp基因在莖、葉、幼胚中均無(wú)表達(dá)，僅在根中特異表達(dá)。用15％ PEG6000溶液模擬干旱脅迫處理，分析0-8 h AhNDrp基因在花生根中的表達(dá)量（圖6-B），發(fā)現(xiàn)隨著干旱處理時(shí)間的增加AhNDrp基因表達(dá)量也逐漸上升，在處理6 h時(shí)表達(dá)量最高，處理8 h時(shí)表達(dá)量降低，但該基因在干旱處理下的表達(dá)量始終低于未處理時(shí)的植株，說(shuō)明AhNDrp基因無(wú)抗干旱能力。用孢子濃度為6×108/mL的黃曲霉處理花生后，0-3 d，AhNDrp基因的表達(dá)量處于上升階段，在3 d達(dá)到最高表達(dá)量，為對(duì)照表達(dá)量的1.62倍；之后開(kāi)始下降，在第7天時(shí)表達(dá)量降到最低，明顯低于對(duì)照組及其他處理組（圖6-C）。

圖5　12種植物抗逆性蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3　討論

目前花生基因組測(cè)序已經(jīng)取得重要進(jìn)展，部分基因組已公布（http：//peanutbase.org），為花生新基因克隆及基因功能研究等提供了數(shù)據(jù)平臺(tái)。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)花生根、葉及未成熟種子的轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序，構(gòu)建了含3萬(wàn)多條花生EST序列的數(shù)據(jù)庫(kù)。本研究結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和基因組測(cè)序，成功克隆到了花生AhNDrp全長(zhǎng)基因，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)該抗逆性蛋白結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)，為后續(xù)探究花生抗逆性基因的表達(dá)調(diào)控和作用機(jī)制提供參考。

有報(bào)道指出，NBS-LRR類(lèi)基因是在進(jìn)化過(guò)程中通過(guò)串聯(lián)或部分復(fù)制祖先基因而得到的。NBS結(jié)構(gòu)域包含幾個(gè)保守基序：P-loop、kinase 2a、kinase 3a 和GLPL motifs等［14］；P-loop被證明在ATP結(jié)合能力中起到關(guān)鍵作用［10］，在煙草［15］和擬南芥［16］PR5中也得到類(lèi)似結(jié)論；kinase-3a激酶可以結(jié)合嘌呤或核糖［14］，但是NBS結(jié)構(gòu)域在植物抗病性機(jī)制中的作用尚不清楚。LRR結(jié)構(gòu)域在蛋白與蛋白之間的相互作用中發(fā)揮重要作用，最新研究結(jié)果表明LRR蛋白片段足以啟動(dòng)防御信號(hào)［17］，是識(shí)別病原體衍生的效應(yīng)分子，隨后激活宿主防御反應(yīng)。LRR蛋白的多種結(jié)構(gòu)域使其可以同時(shí)作為病原體探測(cè)器、傳感器、開(kāi)關(guān)和響應(yīng)因子［18］。這些NBS-LRR類(lèi)蛋白質(zhì)在細(xì)胞生長(zhǎng)、風(fēng)化、細(xì)胞骨架的形成、囊泡運(yùn)輸和防御反應(yīng)中起重要作用。目前，已從不同植物中克隆得到一些NBS-LRR類(lèi)基因，例如，何利等［19］從桑樹(shù)中克隆到5個(gè)NBS類(lèi)基因分別為CL93、Unigene14278、Unigene26173、Unigene32704、Unigene31320的片段；史靜東等［20］利用同源序列法分離小麥NBS-LRR類(lèi)抗病基因類(lèi)似片段，獲得4 個(gè)RGAs片段。本研究利用電子克隆的方法，克隆得到的基因全長(zhǎng)2 832 bp，命名為AhNDrp基因，含有NBS-LRR類(lèi)抗病基因典型的保守結(jié)構(gòu)域。

圖6　AhNDrp基因口花生根、莖、葉、幼胚（A）及干旱（B）和黃曲霉接種處理下（C）花生根口表達(dá)分析

劉建成等［21］從草莓中克隆得到一個(gè)NBS-LRR類(lèi)基因，經(jīng)半定量 RT-PCR 分析顯示，該基因在草莓的所有組織中都表達(dá)，但在莖尖分生組織中表達(dá)水平最高，且在葉中的表達(dá)水平明顯受到外源水楊酸和脫落酸處理的影響。本研究中克隆的AhNDrp基因只在花生根部特異性表達(dá)，與前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果及半定量RT-PCR的結(jié)果一致。趙小波等［22］在花生抗旱品種中克隆到NBS-LRR類(lèi)PDRl基因，該基因在干旱脅迫處理12 h 后表達(dá)量達(dá)到峰值。但本研究中，干旱處理后AhNDrp基因的表達(dá)量始終低于未處理時(shí)的植株，說(shuō)明該基因的表達(dá)產(chǎn)物不參與干旱脅迫的響應(yīng)，被迫應(yīng)答干旱脅迫。

劉宇等［23］克隆到花生抗病基因，并測(cè)得在黃曲霉侵染后，種皮、籽仁及果皮中基因PnAG3的表達(dá)量都上升。而經(jīng)黃曲霉脅迫后，AhNDrp基因在0-3 d中表達(dá)量持續(xù)上升，說(shuō)明該基因可能參與了黃曲霉抗病反應(yīng)過(guò)程。

NBS-LRR類(lèi)基因是一類(lèi)抗逆性基因，黃曲霉是一種致病性真菌，而在干旱脅迫下，黃曲霉菌株可能成為土壤中的優(yōu)勢(shì)菌株，導(dǎo)致花生黃曲霉毒素污染、品質(zhì)下降等。所以測(cè)定AhNDrp基因在干旱和黃曲霉脅迫下的表達(dá)量，為在理想遺傳背景下引進(jìn)高效抗病基因的育種工作提供一定的參考。

4　結(jié)論

本研究克隆了花生AhNDrp基因的全長(zhǎng)序列，含有NBS-LRR保守結(jié)構(gòu)域，該基因在花生根部特異表達(dá)，并根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果，推測(cè)其可能參與黃曲霉脅迫響應(yīng)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Expression Pattern Analysis of NBS-LRR Like-gene in Peanut

FENG Yan-fang1，2GENG Li-li2HAN Rong1ZHANG Jie2
（1. School of Life Sciences，Shanxi Normal University，Linfen 041004；2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）

Based on peanut's transcriptome and genome data，a full length sequence of NBS-LRR like-gene was cloned. This gene，which showed 79％ similarity with disease resistance protein（KHN40407.1）of Glycine soja，was designated as AhNDrp gene. The length of cDNA of AhNDrp gene was 2 832 bp，and contained no intron. AhNDrp gene harbored 5 typical conserved domains with resistance-related protein，and Domain V was repeat sequence with rich leucine. Real-time quantitative PCR analysis showed that AhNDrp gene was expressed exclusively in root，and the expression was significantly increased after aflatoxin treatment，indicating that this gene was involved in the resistance response.

peanut；NBS-LRR gene；gene clone；expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.014

2015-12-24

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（31501711）

馮艷芳，女，碩士，研究方向：抗蟲(chóng)植物基因工程；E-mail：yanfang1369@163.com

韓榕，男，博士，教授，研究方向：環(huán)境植物學(xué)；E-mail：hhwrsl@163.com張杰，男，博士，研究員，研究方向：生防微生物功能基因；E-mail：jzhang@ippcaas.cn