鄭育青

（沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽 110016）

螺旋霉素生物合成中的分子、基因及發(fā)酵調(diào)控技術(shù)

鄭育青

（沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽 110016）

螺旋霉素（spiramycin，SPM）是十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，在臨床上占有重要的地位，其產(chǎn)生菌為生二素鏈霉菌（S. ambofaciens）。螺旋霉素由福洛氨糖（forosamine）、碳霉氨糖（mycaminose）和碳霉糖（mycarose）3個部分組成。簡要介紹了螺旋霉素的理化性質(zhì)和藥理作用，以及生物合成途徑與發(fā)酵工藝等方面的研究狀況，根據(jù)螺旋霉素生物合成途徑，分別從分子水平、基因水平及發(fā)酵工藝等3個方面對通過添加前體或?qū)η绑w有利的物質(zhì)及定向過量表達(dá)某些重要基因等提高螺旋霉素產(chǎn)量的技術(shù)進(jìn)行了簡要概述。

螺旋霉素；生物合成；基因調(diào)控；前體

螺旋霉素（spiramycin，SPM）是一種由生二素鏈霉菌（S. ambofaciens）所產(chǎn)生的多組分大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，主要組分包括螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，結(jié)構(gòu)式見文獻(xiàn)［1］。螺旋霉素具有一個十六元聚酮內(nèi)酯環(huán)，由Ⅰ型聚酮合酶（PKSⅠ）合成。其中十六元環(huán)上有3個脫氧己糖，分別是福洛氨糖（forosamine）、碳霉氨糖（mycaminose）和碳霉糖（mycarose）；其分子式為C43H74N2O14，分子量為843.052 7［1］。螺旋霉素為白色或微黃色、味苦，是一種無定形堿性抗生素；易溶于醇類，可溶于氯仿、己烷、酮、苯和醋酸酯，難溶于水；且其硫酸鹽溶于水和低級醇。在發(fā)酵液中，組分I的含量最高，為60％；其次，是組分Ⅱ，含量為24％；最后是組分Ⅲ，含量為13％，各組分活性相近［2］。螺旋霉素的熔點：組分Ⅰ為134-137℃；組分Ⅱ為130-133℃；組分Ⅲ為128-131℃。比旋度［α］D20（C=I，甲醇）：組分Ⅰ為-96°；組分Ⅱ為-86°；組分Ⅲ為-85 °。在231-232 nm處有紫外吸收峰，本身帶有發(fā)色基團(tuán)；遇濃硫酸或鹽酸呈紫色反應(yīng)。螺旋霉素的麥芽酚反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)、坂口反應(yīng)、雙縮反應(yīng)、斐林反應(yīng)均為陰性［3，4］。

螺旋霉素屬中譜抗生素，對呼吸道感染、軍團(tuán)菌病、弓形蟲病、隱孢子病、非淋球菌性尿道炎及其他炎癥（如丹毒、猩紅熱、扁桃體炎、中耳炎、牙周炎、急性鼻竇炎及急性乳腺炎等）均有滿意療效；對革蘭陽性菌和部分革蘭陰性菌，如腦膜炎雙球菌、鏈球菌、百日咳桿菌、梭狀芽胞桿菌等有效，對青霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素的耐藥菌也有效；對立克次體有效，對衣原體和支原體有一定抗菌作用；但因腸道革蘭陰性桿菌通常耐藥，故螺旋霉素對其抗菌作用差［5］。螺旋霉素的抗菌譜雖然與紅霉素相似，但其抗生素后效應(yīng)（PAE）較紅霉素持續(xù)時間更長，不良反應(yīng)明顯低于紅霉素；且無誘導(dǎo)耐藥性，不良反應(yīng)較低，交叉耐藥性也?。?］；因而可用以治療一些新發(fā)現(xiàn)的感染［7］。螺旋霉素的抗菌作用機(jī)制與其他大環(huán)內(nèi)酯類抗生素相同，通過特異性地與細(xì)菌70S核糖體上的50S亞基結(jié)合，選擇性地抑制蛋白質(zhì)的合成延伸，從空間上阻滯新生肽鏈的延伸和促進(jìn)pt-tRNA的脫落而發(fā)揮抑菌作用；且螺旋霉素強(qiáng)烈抑制PolyC、PolyA及PolyU對脯氨酸、賴氨酸及苯丙氨酸的吸收［8］。

國產(chǎn)螺旋霉素的產(chǎn)生菌是由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所于1974年從甘肅水?？h土壤中分離得到的鏈霉菌L799，它產(chǎn)生的抗生素與國外報道的螺旋霉素相同［9］。臨床常用的螺旋霉素類藥物是由螺旋霉素乙?；?，進(jìn)入體內(nèi)后必須脫乙?；俎D(zhuǎn)化為螺旋霉素方可發(fā)揮抗菌作用。螺旋霉素雖體外抗菌作用差；但體內(nèi)過程獨特，組織親和力、組織濃度高，能增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用［10］；因而在臨床上占有重要的地位。由于螺旋霉素在臨床上的廣泛應(yīng)用，因此，如何在其生物合成過程中提高產(chǎn)量是當(dāng)前本領(lǐng)域研究的一個重要課題。為此，本文從分子水平、基因水平及發(fā)酵工藝等3個方面，對螺旋霉素生物合成過程的調(diào)控技術(shù)進(jìn)行簡要綜述，重點介紹其中的基因調(diào)控技術(shù)。

1　螺旋霉素分子水平的生物合成調(diào)控技術(shù)

從分子水平看，由于螺旋霉素為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，屬于一大類聚酮化合物（polyketide），因此在其生物合成過程中，內(nèi)酯環(huán)的形成是主要限制因素。內(nèi)酯環(huán)的合成是通過聚酮體途徑、由聚酮合酶（PKS）催化而成的，即以乙酰CoA、丙酰CoA丁酰CoA為起始單位，以丙二酰CoA、甲基丙二酰CoA和乙基丙二酰CoA為延長單位，在酶的作用下“頭尾”相連形成一條脂肪鏈，再在環(huán)合酶和修飾酶的作用下形成內(nèi)酯環(huán)。內(nèi)酯環(huán)合成后，再經(jīng)過酶的修飾，即單、雙、三糖基化作用，形成最終化合物，即先是在C-5位點連接上第一個糖（mycaminose），再將C-9的酮基還原并在此位點連接第二個糖（forosamine），最后是在碳霉氨糖上連接一個碳霉糖。

由于上述過程中起始單位可由短鏈脂肪酸或部分氨基酸降解而成，表明短鏈脂肪酸及起始和延伸單位是合成螺旋霉素的重要前體。因此，添加前體或?qū)η绑w有重要作用的物質(zhì)是在分子水平上調(diào)控螺旋霉素生物合成的重要方法。李友元等［11］通過二價陽離子（Zn2+、Mn2+、Co2+和Cu2+等）對?；っ负王；鵆oA合成酶影響的研究發(fā)現(xiàn)：Mn2+和Co2+對?；っ负王；鵆oA合成酶都有較強(qiáng)的激活作用；Cu2+雖對后者也有較強(qiáng)的激活作用，但對前者卻有更為明顯的抑制作用；Zn2+作用均不明顯。毛全貴等［12］通過不同時間添加不同濃度的金屬離子對SPM發(fā)酵影響的研究發(fā)現(xiàn)，在SPM發(fā)酵前期添加適當(dāng)濃度（2.5 μg/mL）的Fe2+，產(chǎn)物效價比對照實驗平均提高了19.7％，且在放大實驗中效果良好。新近的研究還確認(rèn)在SPM發(fā)酵中加入富含亞油酸的脂肪酸可提高其效價，且脂肪酸種類的復(fù)雜程度和效價的高低成正比，雖然還未能證明產(chǎn)生此結(jié)果的原因，但這項研究成果顯然對工業(yè)生產(chǎn)提高SPM產(chǎn)量大有好處［13］。

2　螺旋霉素基因水平的生物合成調(diào)控技術(shù)

2007年，Karray等［14］確定了螺旋霉素生物合成的50個調(diào)控基因，其中包含5個PKS基因（srmGV、srmGIV、srmGIII、srmGII、srmGI）、11個PKS下游基因（orfl*c、orf2*c、orf3*c、orf4*c、orf5*、orf6*、orf7*c、orf8*、orf9*、orfl0*、orfll*）和34個PKS上游基因（orfl、orf2、orf3、orf4、orf5、orf6、orf7、orf8、orf9、orfl0、orfllc、orfl2、orfl3c、orfl4、orfl5c、orfl6、orfl7、orfl8、orfl9、orf20、orf2l、orf22c、orf23c、orf24c、orf25c、orf26、orf27、orf28、orf29、orf30c、orf3l、orf32c、orf33和orf34c），基因命名中的c為反向編碼序列。此后，M-H·布隆德萊-魯奧等［1］將已鑒定出的10個PKS下游基因及34個上游基因，應(yīng)用BLAST和FASTA等程序?qū)⑦@些開放閱讀框?qū)С龅牡鞍仔蛄信c其他數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較，檢索出與基因產(chǎn)物呈顯著相似性的蛋白質(zhì)，并記錄下這些蛋白質(zhì)的來源和具體功能；再應(yīng)用基因敲除及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MSMS）分析等技術(shù)，確定了這些基因在螺旋霉素生物合成過程中的具體作用。近幾年對參與螺旋霉素生物合成基因的研究中，Karray等［15］又將原先確定的50個調(diào)控基因縮減為44個，并對其重新命名為“srml、srm2、srm3……srm42、srm43及srm44”，如圖1所示。下面著重介紹螺旋霉素生物合成過程中一些主要基因的功能及其對螺旋霉素產(chǎn)量的調(diào)控。

首先是PKS的多酶體系是螺旋霉素生物合成過程中最為重要組成部分。在基因工程研究中，研究者認(rèn)為對PKS的組成單元進(jìn)行基因操作可提高螺旋霉素的產(chǎn)量或產(chǎn)生新的化合物。如過量表達(dá)5個PKS基因可以提高螺旋霉素的產(chǎn)量。其次，這44個基因大部分為螺旋霉素生物合成過程中所需要的酶，部分具體功能如圖2-圖4所示。因此，在螺旋霉素的生物合成過程中，可通過定向過量表達(dá)這些重要酶的基因，來提高螺旋霉素產(chǎn)量［14-16］。

圖1　螺旋霉素生物合成基因［15］

其中srm3編碼O-甲基轉(zhuǎn)移酶，參與合并入內(nèi)酯環(huán)前體的形成，這對于螺旋霉素的生物合成途徑是必需的，因此該基因失活會導(dǎo)致螺旋霉素完全停止產(chǎn)生。srml4編碼異構(gòu)酶，該酶負(fù)責(zé)螺旋霉素分子中一種糖（可能是mycarose）生物合成所必須的異構(gòu)化反應(yīng)。srml5編碼3-氨基轉(zhuǎn)移酶，該酶負(fù)責(zé)螺旋霉素一種氨基糖生物合成所必須的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。srm20編碼氨基轉(zhuǎn)移酶，該酶負(fù)責(zé)forosamine生物合成所必須的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。srm24基因編碼3，4-脫水酶，該酶負(fù)責(zé)forosamine生物合成所必須的脫水反應(yīng)，若該基因失活則不產(chǎn)生forosamine。srm26編碼還原酶，該基因失活雖依舊產(chǎn)生生物合成中間體platenolide A，但卻不產(chǎn)生中間體platenolide B。srm43基因編碼還原酶。上述這7個基因的失活實驗顯示：其所得到的菌株不再產(chǎn)生螺旋霉素，證明這8個基因是螺旋霉素生物合成中所必須的［14-16］。

此后，Hoang等［17，18］研究又發(fā)現(xiàn)：螺旋霉素的糖基化主要受srm5、srm6、srm28、srm29和srm38這5個基因的調(diào)控，糖基化分為3步且為依次進(jìn)行，srm5、srm29和srm38分別為3個糖苷化酶，而srm6、srm28均為NDP己糖3，4-異構(gòu)酶，為輔助性蛋白（圖5）。因而，通過激活相應(yīng)的糖苷化反應(yīng)并使其處于最優(yōu)活性，也可顯著提高產(chǎn)量。

圖2　碳霉氨糖的合成過程［1］（有改動）

圖3　福洛氨糖的合成過程［1］（有改動）

圖4　碳霉糖的合成過程［1］（有改動）

圖5　螺旋霉素生物合成過程中的糖基化反應(yīng)［17］（有改動）

尤其值得提出的是srm22，該基因早就被命名為srmR［19］，其在螺旋霉素生物合成過程中極為關(guān)鍵。通過構(gòu)建重組質(zhì)粒來確定srm22翻譯起始位點的實驗，研究者已確定其翻譯起始位點位于最上游的ATG基因，并證明了srm22的5'-截短的信使是無活性的，而5'末端對于激活srm22基因的功能卻是必須的。因此為了提高螺旋霉素的產(chǎn)量，必須過量表達(dá)有效的srm22，而不表達(dá)srm22基因的5'-截短的信使。同時，srm22可調(diào)節(jié)srm40的表達(dá)，而srm40基因編碼調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，是螺旋霉素生物合成的激活子，控制著螺旋霉素生物合成中很多其他基因的表達(dá)，在其各自的沉默和過表達(dá)實驗中發(fā)現(xiàn)，srm40對于螺旋霉素生物合成過程是必須的，且倍增這兩個基因可造成螺旋霉素產(chǎn)量的提升［14，17］。

綜上所述，可歸納出螺旋霉素生物合成途徑及其中的主要調(diào)控基因如圖6所示。

圖6　螺旋霉素生物合成途徑及其中的主要調(diào)控基因

3　螺旋霉素的發(fā)酵調(diào)控技術(shù)

螺旋霉素發(fā)酵通常采用二級發(fā)酵工藝。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為淀粉、魚粉、玉米漿、碳酸鈣、硝酸銨、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀等［7］。實驗表明，添加丙三醇可以增加糖酵解（EMP）途徑和三羧酸（TCA）循環(huán)的代謝流，促進(jìn)細(xì)胞代謝；添加甲基化試劑（如氯化膽堿）可增大TCA循環(huán)通量并減少雜質(zhì)；添加維生素（如VB1和硫辛酸）可提高酶活力及促進(jìn)菌體生長代謝；通過這3種方式均可提高螺旋霉素的產(chǎn)量［20-22］。祝立新等［23］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到40 h左右，添加Mn2+溶液，使得發(fā)酵液中Mn2+濃度為15-40 mmol/L，可提高螺旋霉素產(chǎn)量約25％。

通過高產(chǎn)菌株的選育和及時分離產(chǎn)物來提高產(chǎn)量也是工業(yè)生產(chǎn)中常用的方法，如選育纈氨酸耐性突變株［24］、耐油突變株等［25］。韓少卿等［26］發(fā)現(xiàn)，利用超濾、納濾技術(shù)分離提取螺旋霉素，其收率可高達(dá)76.3％。

此外，微生物代謝工程通過分析細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)并以基因工程方面的技術(shù)手段作為輔助來提高螺旋霉素的發(fā)酵效率，也是當(dāng)前本領(lǐng)域研究的一個重要問題［27］。如通過對螺旋霉素生物合成代謝網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的研究發(fā)現(xiàn)：添加葡萄糖作為螺旋霉素發(fā)酵過程中的激活劑，可在防止葡萄糖效應(yīng)的同時，有效促進(jìn)C3酰化酶的催化作用，以此也可提高螺旋霉素的產(chǎn)量［28］。

4　小結(jié)

以前，螺旋霉素的生物合成主要從分子層面入手，通過添加前體及前體類似物來提高產(chǎn)量。近年，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，從基因?qū)用嫒胧?，通過過量表達(dá)某些重要的基因以優(yōu)化菌種來提高產(chǎn)量，已成為一種高效的新途徑。此外，在生產(chǎn)實踐的發(fā)酵過程中，尋找發(fā)現(xiàn)成本更低、安全性更高的對前體合成有利物質(zhì)，仍是當(dāng)前需要繼續(xù)深入研究的問題。

［1］M-H·布隆德萊-魯奧， H·多明格斯， E·達(dá)爾邦-龍熱爾， 等.參與螺旋霉素生物合成的多肽、編碼這些多肽的核苷酸序列及其應(yīng)用：中國， CN101302528A［P］. 2008.

［2］劉德玉， 趙群飛， 高淑紅， 等. 生二素鏈霉菌orfl*c基因的功能研究及菌株改造［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2013， 29（1）：39-45.

［3］王印. 螺旋霉素的生產(chǎn)與研究探討［J］. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2010 （10）：36-38.

［4］趙明垚. 簡析螺旋霉素的生產(chǎn)工藝與研究進(jìn)展［J］. 中國科技博覽， 2012（24）：433.

［5］龐瑋， 龐莉. 螺旋霉素及其臨床應(yīng)用［J］. 實用醫(yī)技雜志，1997， 4（3）：203-204.

［6］司良. 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的作用機(jī)制與應(yīng)用進(jìn)展［J］. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)， 2010， 37（22）：4397-4398.

［7］江國慶， 吳榮昌， 金淑文. 應(yīng)對螺旋霉素重新評價［J］. 中國藥學(xué)雜志， 1995， 30（5）：299-300.

［8］孫麗文. 螺旋霉素類抗生素體內(nèi)過程探討［J］. 國外醫(yī)藥（抗生素分冊）， 1998， 19（5）：358-361， 365.

［9］陰蔭， 馮晶. 螺旋霉素的制備技術(shù)探析［J］. 中國科技博覽，2013（33）：278.

［10］朱峰， 王爾健. 螺旋霉素的再評價［J］. 中國抗生素雜志，1991， 16（3）：231-236.

［11］李友元， 陳長華， 李永東， 等. ?；っ负王；鵆oA合成酶對螺旋霉素合成的影響［J］. 華東理工大學(xué)學(xué)報， 2001， 27（3）：251-253.

［12］毛全貴， 趙勝利， 韓德全， 等. 金屬離子對螺旋霉素生物合成的影響［J］. 中國抗生素雜志， 2005， 30（11）：647-648， 694.

［13］曾俊， 葉蕊芳， 管瑩， 等. 不同種類植物油及脂肪酸對螺旋霉素生物合成影響［J］. 糧食與油脂， 2015， 28（1）：49-52.

［14］Karray F， Darbon E， Oestreicher N， et al. Organization of the biosynthetic gene cluster for the macrolide antibiotic spiramycin in Streptomyces ambofaciens［J］. Microbiology， 2007， 153（12）：4111-4122.

［15］Karry F， Darbon E， Hoang CN， et al. Regulation of the biosynthesis of the macrolide antibiotic spiramycin in Streptomyces ambofaciens［J］. Journal of Bacteriology， 2010， 192（21）：5813-5821.

［16］ Aigle B， Lautru S， Spiteller D， et al. Genome mining of Streptomyces ambofaciens［J］. Journal of Industrial Microbiology ＆amp; Biotechnology， 2014， 41（2）：251-263.

［17］Hoang CN， Karray F， Lautru S， et al. Glycosylation steps during spiramycin biosynthesis in Streptomyces ambofaciens：Involvement of three glycosyltransferases and their interplay with two auxiliary proteins［J］. Antimicrobial Agents and Chemotherapy， 2010， 54 （7）：2830-2839.

［18］Hoang CN， Darbon E， Thai R， et al. Post-PKS tailoring steps of the spiramycin macrolactone ring in Streptomyces ambofaciens［J］Antimicrobial Agents ＆amp; Chemotherapy， 2013， 57（8）：3836-3842.

［19］Geistlich M， Losick R， Turner JR， et al. Characterization of a novel regulatory gene governing the expression of apolyketide synthase gene in streptomyces ambofaciens［J］. Molecular Microbiology，1992， 6（14）：2019-2029.

［20］胡蓉， 陳長華， 張琪， 等. 丙三醇對螺旋霉素生物合成過程的影響［J］. 華東理工大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版， 2009， 35（1）：30-34.

［21］羅俊， 高淑紅， 陳長華， 等. 甲基化試劑對螺旋霉素發(fā)酵的影響［J］. 化學(xué)與生物工程， 2011， 28（5）：46-50.

［22］ 葉蕊芳， 史婷婷， 張燕， 等. 維生素對螺旋霉素發(fā)酵的影響［J］.化學(xué)與生物工程， 2008， 25（10）：64-67.

［23］ 祝立新， 唐慧慧， 毛全貴. 螺旋霉素發(fā)酵工藝［J］. 技術(shù)與市場，2010， 17（2）：71.

［24］ 宋友禮， 屠小平， 胡巍， 等. 螺旋霉素高產(chǎn)株的推理選育和工業(yè)生產(chǎn)［J］. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志， 2003， 34（11）：18-20.

［25］孫新強(qiáng). 螺旋霉素高產(chǎn)菌種選育及發(fā)酵工藝優(yōu)化［D］. 杭州：浙江工業(yè)大學(xué)， 2002.

［26］韓少卿， 葉驥， 薛強(qiáng)， 等. 超濾和納濾膜分離技術(shù)提取螺旋霉素［J］. 中國抗生素雜志， 2005， 30（1）：52-55.

［27］郝偉麗， 劉景芝， 趙寶華. 微生物代謝工程原理與應(yīng)用［J］.生物技術(shù)通報， 2007（5）：18-23.

［28］Colombié V， Bideaux C， Goma G， et al. Effects of glucose limitation on biomass and spiramycin production by Streptomyces ambofaciens［J］. Bioprocess and Bosystems Engineering， 2005，28（1）：56-61.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Regulation Techniques for Biosynthesis of Spiramycin in Molecular and Genetic Level Along with Ferment

ZHENG Yu-qing
（School of Life Science and Biopharmaceutics，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016）

Spiramycin is a 16-membered ring macrolide antibiotics，and plays an important role in clinical practice. It is produced by S. ambofaciens. Spiramycin is composed of three parts：forosamine，mycaminose and mycarose. This article describes briefly the physicochemical properties and pharmacological effects of the spiramycin，and recent advances on the biosynthetic pathway and the fermentation process. According to biosynthetic pathway of spiramycin，the techniques for increasing its yield，i.e.，adding precursor or beneficial substances to precursor，and direct overexpression of some important genes，were briefly summarized from 3 aspects of the molecular and genetic level，as well as fermentation process，respectively

spiramycin；biosynthesis；gene-regulation；precursor

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.006

2016-03-21

鄭育青，女，研究方向：生物制藥；E-mail：zhengyq1630@163.com